Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Jean-Claude Walser, do Centro de Diversidade Genética de Zurique, por conselhos cruciais de especialistas na fase inicial deste projeto. O trabalho no laboratório Vermeer foi apoiado por uma bolsa de professor do SNF (PP00P3_157524) e uma bolsa de equipamentos R'EQUIP (316030_164086) da Fundação Nacional de Ciência suíça (SNSF) concedida ao JEMV.

1. Clonagem de transgene, produção e seleção de linhas transgênicas
<ol><li>Clone o promotor de escolha no vetor de entrada apropriado. Use um método de clonagem baseado em recombinação(Tabela de Materiais)e recombine os promotores em pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (com etiqueta de afinidade ou proteína fluorescente de escolha) usando clonagem baseada em recombinação em pDONRP1-P249.</li>
	<li>Combine o vetor de entrada contendo RPL18 com o vetor de entrada contend...

Verificação do padrão de localização RPL18 Crucial para evitar má interpretação dos dados de qualquer experimento TRAP é o padrão de expressão adequado da subunidade ribossômica marcada. Portanto, a incorporação do GFP como uma tag epítopoa ao RPL18 de forma muito elegante permite a verificação do padrão de expressão desejado e, consecutivamente, a retração da fração polisome do mesmo tecido. Abordagens mais invasivas para assegurar padrões de promotores adequados são seguidas...

Impulsionada pela crescente aplicação de técnicas de sequenciamento de última geração, a resolução espacial na biologia do desenvolvimento poderia ser aumentada. Estudos contemporâneos visam dissecar tecidos para tipos de células especializadas, se não o nível de célulaúnica11,2,,3,4. Para isso, uma infinidade de métodos diferentes foi concebida ao longo dos últimos cinquenta anos (ver Figura 1A)5,6,,7,,688,99,10,,11,,12,,13,,14,15.
Muitas ferramentas em ciência vegetal têm sido adaptações de técnicas que foram pioneiras na pesquisa animal. Este não é o caso para o método que estamos introduzindo em detalhes aqui. Em 2005, equipado com uma forte formação em tradução de proteínas, o Laboratório Bailey-Serres começou a projetar proteínas ribossômicas para posterior purificação de afinidade16. Assim, poderiam evitar o demorado e intensivo em perfil de polisério, que se baseia na ultracentrifugação com um gradiente de sacarose e foi utilizado para avaliar ribossomos traduzidos desde a década de 196017,18. Desde então, o método foi referido como purificação de afinidade de ribossomos traláricos (TRAP)16. Após estudos bem-sucedidos de translatome em plantas, Heiman et al. adaptaram TRAP para animais19 e outros estenderam sua aplicação para leveduras20, Drosophila21, Xenopus22 e zebrafish23,24.
Embora a modificação genética do sistema modelo seja um pré-requisito para trap, que limita sua aplicação a espécies passíveis de transformação genética, pode-se simultaneamente aproveitar essa objeção para atingir subconjuntos de células que são de interesse especial e de outra forma extremamente difíceis de isolar do tecido/órgão intacto25 (por exemplo, células dendríticas altamente ramificadas em um cérebro de camundongos ou hifas fúngicas em tecido vegetal infectado). Nas plantas, todas as células são mantidas no lugar através de paredes celulares que formam a base do esqueleto hidrostático26. Para libertar uma célula vegetal dessa matriz, os cientistas cortaram fisicamente a célula de seu tecido circundante através da microdissecção de captura a laser (LCM)27 ou realizaram digestão enzimática das paredes celulares28. Entre as últimas células, os chamados protoplastos, a população de interesse é fluorescentemente rotulada e pode ser separada por meio da triagem celular ativada por fluorescência (FACS)7. O LCM geralmente requer uma amostra para ser fixada e embutida em cera, o que acaba por deteriorar a qualidade do seu RNA29. Os métodos baseados em FACS produzem RNA de alta qualidade, mas o processo de protoplasting em si introduz diferenças na expressão genética30 e tecidos com paredes de células secundárias modificadas e grossas são notoriamente difíceis de tratar. Além disso, muitos processos de desenvolvimento nas plantas são assumidos para contar com sinais mecanicamente transmitidos e, portanto, a integridade da parede celular é de suma importância31. Dois métodos, que utilizam um atalho para contornar o isolamento celular operando no nível de núcleos, são a triagem nuclear ativada por fluorescência (FANS) e o isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas (INTACT). Como no TRAP, eles usam promotores específicos do tipo celular para marcar núcleos, que posteriormente são enriquecidos através da classificação ou puxar para baixo, respectivamente8,15. Um grande desafio para todas essas abordagens é obter material de RNA suficiente de subconjuntos de células em um tecido. Como o TRAP captura apenas uma fração dos RNAs celulares, a coleta de amostras é um gargalo considerável. Portanto, protocolos especialmente sensíveis de preparação de bibliotecas são necessários para produzir dados de alta qualidade a partir de baixas quantidades de entrada.
Desde a sua criação, o TRAP tem sido usado em combinação com micromatrizes de DNA ou, como os custos de sequenciamento caíram significativamente nos últimos anos, RNA-seq10,32,33. Uma infinidade de questões de pesquisa já foi elucidada como revisada em Sablok et al.34. Estamos convencidos de que mais relatórios serão seguidos nos próximos anos, pois a técnica é muito versátil ao combinar diferentes promotores para atingir tipos específicos de células. Eventualmente, isso será feito mesmo de forma indutível, e pode ser combinado com a sondagem da reação da planta a muitos fatores de estresse bióticos e abióticos. Além disso, quando linhas transgênicas estáveis não estão disponíveis, sistemas de expressão raiz peluda também têm sido usados com sucesso para realizar TRAP em tomate e medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figura 1: Traduzir purificação de afinidade de ribossomos (TRAP) complementa o portfólio de análise "ômica". A. O aumento dos níveis de precisão analítica, até a resolução unicelular ou mesmo subcelular, pode ser alcançado por uma infinidade de métodos ou combinações. O esquema dá uma visão geral das ferramentas disponíveis atualmente no campo vegetal e animal. A coleta de tecidos na resolução celular pode ser alcançada por protocolos como LCM ou FACS, que são então acoplados à transcrição padrão ou análise de perfil/tradução polisome. TRAP e INTACT integram tanto a captura de tecido quanto o isolamento do RNA, pois são baseados na marcação de epítopos. No entanto, intacto amostra apenas núcleos celulares e constitui, portanto, um caso especial de análise de transcriptome. Um pequeno ícone de coelho marca métodos recém-desenvolvidos no campo animal: Enquanto SLAM-ITseq e Flura-seq dependem da segmentação metabólica de RNAs nascentes com bases uracil modificadas em células que expressam a enzima permissiva, Slide-seq faz uso de um slide de vidro revestido com códigos de barras de DNA que fornecem informações posicionais na faixa celular. Uma abordagem de rotulagem de proximidade é seguida em APEX-seq para amostrar RNAs em compartimentos subcelulares específicos. Notavelmente, o aumento da resolução muitas vezes requer a geração de material transgênico (asteriscos) e esses métodos são, portanto, predominantemente utilizados para espécies modelo. Trap é especialmente adequado para estudos de ciência vegetal envolvendo parede celular (CW) ou sinalização mecânica, bem como espécies celulares que são difíceis de liberar de sua matriz CW. B. Etapas detalhadas do laboratório molhado do procedimento TRAP: As mudas que expressam proteína ribossômica marcada por GFP em tipos de células distintas (por exemplo, endoderme raiz) são cultivadas em placas de Petri por sete dias e o material raiz colhido pelo congelamento instantâneo. Uma amostra total de controle de RNA é coletada do extrato bruto homogeneizado antes de pelleting os detritos via centrifugação. Contas anti-GFP magnéticas são adicionadas ao extrato limpo para realizar a imunoprecipitação. Após a incubação e três etapas de lavagem, o RNA associado ao pórnio (Trap/Polysome RNA) é obtido diretamente através da extração de fenol-clorofórmio. LCM: microdissecção de captura a laser, FACS/FANS: célula ativada por fluorescência/classificação nuclear, APEX-seq: método baseado na engenharia de ascorbate peroxidase, INTACT: isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas, SLAM-ITseq: alquilação vinculada ao thiol(SH) para o sequenciamento metabólico de RNA no tecido, Flura-seq: sequenciamento de RNA com rótulo fluorouracil (Criado com Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do método TRAP, destacar passos críticos e fornecer orientação para um possível método de preparação da biblioteca.
Um experimento trap genérico consistirá essencialmente nas seguintes etapas (ver também Figura 1B): (1) Preparação de material vegetal incluindo clonagem de construção de marcação de ribossomos, produção e seleção de linhas transgênicas, crescimento e acúmulo de sementes, esterilização e revestimento, e aplicação/tratamento de estresse (opcional) e colheita de tecidos; (2) imunopurificação, incluindo homogeneização tecidual e limpeza do extrato bruto, lavagem de abelhas e imunopurificação, e etapas de lavagem; (3) Extração de RNA e avaliação da qualidade; e (4) preparação da biblioteca.
A raiz arabidopsis tem sido um sistema modelo para estudar o desenvolvimento de plantas desde sua introdução como uma planta modelo37,38. Aqui, a aplicação do TRAP é apresentada no contexto do desenvolvimento da raiz lateral vegetal. Nas plantas, o acúmulo de todo o sistema radicular depende da execução deste programa e, portanto, é muito importante para a sobrevivência do organismo39. Em Arabidopsis,as raízes laterais originam-se do tecido periciclo que reside ao lado dos vasos xilem e, portanto, é denominado periciclo do pólo xilem (XPP; ver Figura 2C)40. Algumas células XPP, que estão localizadas no interior da raiz, adquirem uma identidade celular fundadora e, sobre um gatilho hormonal local, começam a se proliferar por inchaço e divisão anticlinalmente41. No entanto, devido à presença de uma matriz de parede celular rígida, este processo exerce estresse mecânico nos tecidos circundantes. Em particular, a endoderme sobreposta é afetada, pois está no caminho do eixo de crescimento da raiz lateral42,43,44. De fato, o primordium recém-formado terá que crescer através da célula endoderme sobreposta (Figura 2C2), enquanto as células córtex e epiderme são apenas deixadas de lado para que o primordium finalmente emerja45,46. Trabalhos recentes em nosso laboratório mostraram que a endoderme está contribuindo ativamente para acomodar a proliferação no periciclo. O bloqueio direcionado da sinalização hormonal endodérmica é suficiente para inibir até mesmo a primeira divisão nas células XPP47. Assim, a comunicação periciclo-endoderme constitui um ponto de verificação muito cedo para o desenvolvimento da raiz lateral na Arabidopsis. No entanto, não se sabe como esse crosstalk é realizado. Para desvendar esse mistério, escolhemos a abordagem TRAP-seq para atingir células XPP e endodérmicas. Para enriquecer para as células no programa raiz lateral, imitamos o gatilho hormonal aplicando exogenously um análogo auxina (1-ácido naftalinacático, NAA)48, que ao mesmo tempo permitiu resolver temporalmente a fase inicial da formação da raiz lateral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

Neste artigo, damos instruções práticos para obter dados translatome de diferentes tipos de células radiculares Arabidopsis thaliana através do método de purificação de afinidade costelado (TRAP) traduzindo e preparação consecutiva de biblioteca otimizada otimizada.
Como material inicial, empregamos linhas de plantas que expressam a proteína ribossômica RPL18 com gfp de forma específica do tipo celular, utilizando promotores adequados. Antes da imunopurificação e extração de RNA, o tecido é congelado, o que preserva a integridade do tecido e permite simultaneamente a execução de estudos de séries temporais com alta resolução temporal. Notavelmente, as estruturas de parede celular permanecem intactas, o que é uma grande desvantagem em procedimentos alternativos, como abordagens baseadas em triagem celular ativadas por fluorescência que dependem de protoplasting tecidual para isolar populações celulares distintas. Além disso, nenhuma fixação tecidual é necessária como em técnicas baseadas em microdissecção de captura a laser, o que permite obter RNA de alta qualidade.
No entanto, a amostragem de subpopulações de células e apenas o RNA associado ao polisome severamente limita severamente os rendimentos de RNA. É, portanto, necessário aplicar métodos suficientemente sensíveis de preparação de bibliotecas para a aquisição bem-sucedida de dados pelo RNA-seq.
O TRAP oferece uma ferramenta ideal para a pesquisa de plantas, pois muitos processos de desenvolvimento envolvem vias de sinalização mecânica e relacionadas à parede celular. O uso de promotores para atingir populações celulares específicas está fazendo a ponte entre o nível de órgãos e células únicas que, por sua vez, sofrem de pouca resolução ou custos muito altos. Aqui, aplicamos TRAP para estudar a comunicação celular-célula na formação de raízes laterais.

Para avaliação da qualidade, o procedimento acima mencionado deve ser sondado em várias etapas intermediárias: validação de padrão de expressão na planta, controle de qualidade do RNA polissômal oimosois isolado, bem como das bibliotecas finais. qRT-PCR usando genes marcadores conhecidos pode, além disso, ser realizado para confirmar a resposta à condição de tratamento ou para ajustar as condições experimentais.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Com a TRAP, podemos investigar o processamento do desenvolvimento na resolução celular. Usamos promotores específicos do tipo celular para conduzir uma sub-unidade ribossômica marcada, e a partir daí podemos isolar o RNA polissário. Este protocolo produz RNA de alta qualidade, mas em quantidades muito limitadas, portanto, métodos especializados para entrada ultra-baixa são necessários para produzir bibliotecas de RNA de alta qualidade.O TRAP é uma ferramenta ideal para a pesquisa de plantas, pois muitos processos de desenvolvimento dependem de vias de sinalização mecânica e relacionadas à parede celular. Usamos o TRAP para estudar a comunicação celular-célula na formação lateral de raízes. Como obter RNA de boa qualidade provou não ser tão direto quanto esperávamos, esperamos que esta instrução de vídeo passo a passo aumente a aplicabilidade do TRAP e ajude a promover essa técnica poderosa.Para esterilizar as linhas homozigos propagadas, espalhe menos de 300 microliters de sementes uniformemente em placas de Petri de 12 por 12 centímetros quadrados, e empilhe as placas em um dessecador de 60 litros. Após a esterilização de gás durante a noite, deixe o gás evaporar antes de coletar as sementes em um tubo de armazenamento de 50 mililitros. Antes de emplacar, diluir as sementes esterilizadas com 0,1% de ágar para obter um mililitro de mistura de sementes imbibed por placa.Para emplacar a mistura de sementes, use tampas quadradas de placa de Petri para criar um suporte de modelo laminado para o plantio de três fileiras de sementes por prato, e coloque placas de ágar vazias no porta-modelos. Distribua um mililitro das sementes absorvidas uniformemente em três fileiras de placas. E coloque as placas processadas em pilhas em um fluxo laminar, até que as sementes estejam secas.Quando as sementes tiverem grudado na superfície do ágar, feche as tampas e sele cada placa com fita micropora. Para o tratamento exógeno das raízes arabidopsis com um agente de interesse, prepare 1,5 a dois centímetros de largura, 10 centímetros de comprimento, tiras de papel de tecido. Mergulhe o papel de tecido em 10 naa micromolar, e use pinças para aplicar uma tira de papel de tecido em cada linha de raízes.Em seguida, pressione suavemente as bolhas de ar e esvazie o excesso de líquido da placa, antes de rotular a placa com o tempo. No ponto final experimental apropriado, use fórceps para remover cuidadosamente as tiras de papel de tecido de cada placa sem separar as raízes, e use uma lâmina cirúrgica para cortar uma vez por linha ao longo da junção de raiz de ensaio, em um único curso determinado. Use pinças para deslizar ao longo das raízes de cada linha, para coletar as raízes em três feixes.E esvazie as raízes em um tubo de 50 mililitros cheio de nitrogênio líquido, para congelamento instantâneo. Quando todas as amostras de raiz por tratamento tiverem sido coletadas, decante o excesso de nitrogênio líquido usando a tampa do tubo para evitar que as raízes derramem. E coloque o tubo em um vaso de doer, para um armazenamento de 80 graus celsius.Para moagem e homogeneização de tecidos, use luvas de algodão sob luvas de laboratório padrão e adicione PMSF ao tampão de extração de pórsome. Esvazie a amostra de tecido em uma argamassa contendo nitrogênio líquido, e use um pilão resfriado para moer cuidadosamente os tecidos até que todo o material apareça como um pó branco. Quando todo o tecido tiver sido moído, adicione cinco mililitros de tampão de extração de polisso à amostra, e misture rapidamente os fragmentos de tecido congelado com o pó antes que o tampão congele.Assim que a mistura puder ser transferida, esvazie o chorume em um homogeneizador de vidro no gelo, e use mais dois mililitros de tampão de extração de pórsome para enxaguar a argamassa e o pilão. Triture manualmente o chorume até que o extrato fique homogêneo. Em seguida, despeje o extrato de raiz bruta em um tubo de centrífuga de 50 mililitros no gelo, e processe a próxima amostra como demonstrado.Para a coleta total de RNA, transfira 200 alíquotas de microliter de cada amostra bruta para tubos de microcentrifuge limpos, pré-resfriados e rotulados. Para remover paredes celulares, detritos e grandes organelas, centrifugar as amostras e decantar o supernaente em tubos cônicos frescos e pré-resfriados para uma segunda centrifugação. Enquanto os tubos estão girando, alíquota de 60 microliters de contas magnéticas GFP por amostra, em um tubo de 1,5 mililitro.E coloque o tubo em um suporte magnético, para facilitar a remoção de supernaspes. Em seguida, lave as contas duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem a frio por lavagem, e suspenda novamente as contas em 60 microliters de tampão de lavagem por amostra. Imediatamente após a centrifugação, decante o supernanato limpo em tubos rotulados de 15 mililitros, e adicione 60 microliters de contas lavadas a cada amostra.Em seguida, coloque todas as amostras horizontalmente em um balde de gelo, para uma incubação de duas horas com balanço. No final da incubação, colete as contas em um suporte magnético no gelo e adicione PMSF ao tampão de extração de polissóis restante. Depois de descartar os supernantes, adicione aproximadamente cinco mililitros de tampão de extração de pórsome às amostras e suspenda as contas dentro das amostras com inclinação suave.Balance as amostras por 15 minutos no shaker no gelo, seguido por duas lavagens com tampão de lavagem fresco no ímã, como demonstrado. Após a última lavagem, transfira as amostras em um mililitro de tampão de lavagem, em um tubo de 1,5 mililitro. E recolher as contas mais uma vez no suporte magnético, para remover todo o supernatante.Em seguida, coloque os tubos no gelo até que todas as amostras tenham sido processadas. Para o recondicionamento dos suprimentos de laboratório, primeiro, enxague todo o equipamento nos resíduos químicos. Lave as argamassas, pilões e homogeneizadores com sabão, antes de enxaguar bem cada instrumento.Em seguida, coloque o equipamento em um recipiente seguro para o calor, e asse os materiais durante a noite a mais de 220 graus celsius. Escove todos os tubos de centrífugas limpos com detergente, antes de colocar os tubos em uma bandeja autoclavevel com uma borda e um capô de fumaça. Despeje um mililitro de pirocarbonato de diethyl líquida e um litro de solução de água deionizada nos tubos por três a 18 horas.Em seguida, colete a solução antes de esterilizar a bandeja de tubos na autoclave. Aqui, plantas representativas com sinais GFP são mostradas. A contra-coloração com iodeto de propídio marca os contornos da parede celular.As linhas correspondem ao padrão de localização da endoderme e ao periciclo do polo xilema. Nestas medidas representativas obtidas a partir do RNA polisário, a maioria das amostras apresentou muito pouca degradação, com números de integridade de RNA variando de nove a 10. Nestes gráficos, podem ser observados traços de bibliotecas preparadas com sucesso, destacando a robustez do procedimento, apesar dos volumes de reação reduzidos.Antes da produção de um conjunto de dados de abrangência de genomas, o TRAP RNA de um experimento piloto pode ser sondado por RTPCR quantitativo para validar o sucesso do tratamento e/ou as condições experimentais, bem como a especificidade do tecido. Nesta análise, o teste de três genes responsivos àuxina confirmou uma indução hormonal bem sucedida após duas horas de tratamento. Perfis genéticos de marcadores específicos de tecido recuperados dos dados de sequenciamento confirmaram a especificidade do tipo celular.Siga conselhos de boas práticas ao lidar com o RNA. Trabalhe em um banco estéril, limpe seu equipamento com solução de remoção de RNA, use luvas e troque-as imediatamente quando forem contaminadas. Certifique-se de manusear e descartar adequadamente todos os produtos químicos tóxicos e gases que foram usados durante o procedimento, especialmente gás cloro-DEPC e nitrogênio líquido.No portfólio de estudos omicais, o TRAP ocupa um nicho importante, e já tem sido usado para responder a muitas questões biológicas, especialmente na biologia do desenvolvimento, a TRAP tem um enorme potencial.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnética Field (Gmf) and Plant Evolution: investigação dos efeitos dos Gmf Reversão sobre<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Desenvolvimento e Expressão Gênica

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Biologia do Desenvolvimento

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...