Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить центр генетического разнообразия цюрихского центра генетического разнообразия за важные консультации экспертов на ранней стадии этого проекта. Работа в лаборатории Vermeer была поддержана грантом sNF Professorship (PP00P3_157524) и грантом на оборудование R'EQUIP (316030-164086) от Швейцарского национального научного фонда (SNSF), присужденного JEMV.

1. Клонирование трансгенного, трансгенного производства и отбора линий
<ol><li>Клонпромоутер выбора в соответствующем векторе входа. Используйте метод клонирования на основе рекомбинации(Таблица материалов)и рекомбинируйте промоутеров в pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (с тегом сродства или флу?...

Проверка шаблона локализации RPL18 Решающее значение для того, чтобы избежать неправильного толкования данных из любого эксперимента TRAP, имеет правильную модель выражения помеченного рибосомального подразделения. Таким образом, включение GFP в качестве эпитопа тега RPL18 очень ?...

Благодаря все более широкому применению методов секвенирования следующего поколения, пространственное разрешение в биологии развития может быть увеличено. Современные исследования направлены на вскрытие тканей вплоть до специализированных типов клеток, если не одноклеточного уровня1,,2,,3,,4. С этой целью за последние пятьдесят лет было разработано множество различных методов (см. рисунок 1A)5,6,6,7,,88,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.
Многие инструменты в науке о растениях были адаптацией методов, которые были впервые в исследованиях на животных. Это не относится к методу, который мы вводим в деталях здесь. В 2005 году, оснащенный сильным фоном в переводе белка, Лаборатория Бейли-Серрес приступила к разработке рибосомных белков для последующего очищения сродства16. Таким образом, они могли бы избежать трудоемких и трудоемких полисомного профилирования, которое основано на ультрацентрифугации с градиентом сахарозы и было использовано для оценки перевода рибосом с 1960-хгодов 17,18. Метод с тех пор был назван переводной рибосомы очистки сродства (TRAP)16. После успешных исследований транслатома в растениях, Heiman et al. адаптированы TRAP для животных19 и другие расширили свое применение дрожжей20, Drosophila21, Xenopus22 и зебрафиш23,24.
Хотя генетическая модификация модельной системы является необходимым условием для TRAP, которая ограничивает ее применение видов, поддавшихся генетической трансформации, можно одновременно использовать это возражение в целевых подмножествах клеток, которые представляют особый интерес и в противном случае чрезвычайно трудно изолировать от нетронутой ткани / органа25 (например, высоко разветвленные дендритные клетки в мозге мыши или грибковых hyphae инфицированных растительных тканей). В растениях все клетки удерживаются на месте через клеточные стенки, которые составляют основу гидростатического скелета26. Чтобы освободить клетку растений из этой матрицы, ученые либо физически вырезать клетку из окружающей ткани с помощью лазерного захвата микродиссекции (LCM)27 или выполняется ферментативное пищеварение клеточныхстенок 28. Среди последних клеток, так называемых протопластов, популяция, интересующая сяртово,констачированная и может быть отделена с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS)7. LCM обычно требует, чтобы образец был исправлен и встроен в воск, что в конечном итоге ухудшает качество его РНК29. Методы на основе FACS дают высококачественную РНК, но сам процесс протоптертора вводит различия в экспрессии генов30, а ткани с модифицированными и толстыми вторичными клеточными стенками, как известно, трудно поддаются лечению. Кроме того, многие процессы развития в растениях, как предполагается, полагают, полагаются на механически передаваемые сигналы и, следовательно, целостность клеточной стенки имеет первостепенное значение31. Два метода, которые используют ярлык, чтобы обойти изоляцию клеток, работая на уровне ядер, являются флуоресценция активированной ядерной сортировки (FANS) и изоляции ядер помечены в конкретных типах клеток (INTACT). Как и в TRAP, они используют клеточные тип-специфические промоутеры для того чтобы маркировать ядра, которые затем получают обогащенными через сортировать или вытягивать вниз, соответственно8,,15. Основная проблема для всех этих подходов заключается в том, чтобы получить достаточное количество РНК-материала из подмножества клеток в ткани. Поскольку TRAP захватывает лишь часть клеточных РНК, сбор образцов является значительным узким местом. Поэтому для получения высококачественных данных из низких объемов ввода необходимы особенно чувствительные протоколы подготовки библиотек.
С момента своего создания, TRAP был либо использован в сочетании с ДНК microarrays или, как секвенирование расходы значительно снизились в последние годы, РНК-сек10,32,33. Множество вопросов исследования уже были выяснены, как рассмотрено в Sablok и др.34. Мы убеждены, что больше докладов будет следовать в ближайшие годы, как техника является очень универсальным при объединении различных промоутеров для целевых конкретных типов клеток. В конце концов, это будет сделано даже в индуцируемой образом, и может быть объединена с зондирования реакции растения на многие биотических и абиотических факторов стресса. Кроме того, там, где стабильные трансгенные линии отсутствуют, волосатые системы экспрессии корней также успешно используются для выполнения TRAP в томате и medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Рисунок 1: Перевод циризующей сродства рибосомы (TRAP) дополняет портфель анализа "омики". О. Повышение уровня аналитической точности, вплоть до одноклеточного или даже субклеточного разрешения может быть достигнуто с помощью множества методов или их комбинаций. Схема дает обзор имеющихся в настоящее время инструментов в области растений и животных. Сбор тканей при клеточном разрешении может быть достигнут с помощью таких протоколов, как LCM или FACS, которые затем соединяются со стандартным транскриптомом или полисомным профилированием/анализом транслатома. TRAP и INTACT интегрируют захват тканей и изоляцию РНК, поскольку они основаны на эпитоп-пометке. Тем не менее, образцы INTACT только ядра клеток и представляет собой, следовательно, особый случай анализа транскриптома. Небольшой значок кролика отмечает недавно разработанные методы в области животных: В то время как SLAM-ITseq и Flura-seq полагаются на метаболическое тарзание зарождающихся РНК с модифицированными базами урацила в клетках, выражающих разрешительный фермент, Slide-seq использует стеклянный слайд с покрытием со штрих-кодами ДНК, которые предоставляют позиционную информацию в клеточном диапазоне. В APEX-seq используется подход к маркировке непосредственной маркировки для пробы РНК в конкретных субклеточных отсеках. Примечательно, что повышенное разрешение часто требует генерации трансгенного материала (звездочек), и эти методы, таким образом, в основном используются для типовых видов. TRAP особенно подходит для исследований растительной науки с участием клеточной стенки (CW) или механической сигнализации, а также клеточных видов, которые трудно выпустить из их матрицы CW. B. Детальные шаги влажной лаборатории процедуры TRAP: Рассада, выражающая GFP-тегами рибосомный белок в различных типах клеток (например, корневые эндодермисы), выращиваются на чашках Петри в течение семи дней, а корневой материал собирают путем замораживания оснастки. Общий образец контроля РНК собирается из гомогенизированного сырого экстракта, прежде чем гранулировать мусор с помощью центрифугации. Магнитные бусы анти-GFP добавляются в очищенный экстракт для выполнения иммунопротеберации. После инкубации и трех этапов стирки, полисомо-ассоциированной РНК (TRAP /полисома РНК) непосредственно получается через экстракцию фенола-хлороформа. LCM: лазерный захват микродиссекции, FACS/ FANS: флуоресценция активированной ячейки / ядерной сортировки, APEX-seq: метод, основанный на инженерии аскорбат перекистой, INTACT: изоляция ядер помечены в конкретных типах клеток, SLAM-ITseq: тиол (SH)-связанных алкилирования для метаболического секвенирования РНК в тканях, Flura-seq: фторурацил помечены РНК секвенирования (Создано с Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Целью данной статьи является предоставление подробного описания метода TRAP, выделение критических шагов и руководство по возможному методу подготовки библиотеки.
Общий эксперимент TRAP будет по существу состоять из следующих шагов (см. также Рисунок 1B):(1) Подготовка растительного материала, включая клонирование рибосом-теговая конструкция, трансгенное производство линии и отбор, выращивание и ссыпая семян, стерилизации и покрытия, а также стрессовое применение/обработка (необязательно) и сбор тканей; (2) иммуноочищение, включая гомогенизацию тканей и очистку сырого экстракта, мытье биса и иммуноочищение, и шаги мытья; (3) добыча РНК и оценка качества; и (4) подготовка библиотеки.
Корень Arabidopsis была модельсистемы для изучения развития растений с момента его введения в качестве модели завода37,38. Здесь применение TRAP демонстрируется в контексте развития бокового корня растений. В растениях, накопление всей корневой системы опирается на выполнение этой программы и поэтому очень важно для выживания организма39. В Arabidopsis, боковые корни происходят из ткани перицикл, который находится рядом с ксилем судов и, следовательно, называется ксилем полюс перицикл (XPP; см. Рисунок 2C)40. Некоторые клетки XPP, которые расположены глубоко внутри корня, приобретают идентичность ячейки основателя и, на местном гормональном триггере, начинают размножаться путем отеков и деления антиклинально41. Однако, из-за наличия жесткой матрицы стенки клетки, этот процесс оказывает механическое давление на окружающие ткани. В частности, поражена надлежащая эндодермис, так как она находится на пути боковой оси роста корня42,,43,,44. Действительно, вновь формирующихся primordium придется расти через надлежащую клетку эндодермис(Рисунок 2C2) в то время как коры и эпидермиз клетки просто отодвинуты в сторону для приморского,наконец,выйти45,46. Недавняя работа в нашей лаборатории показала, что эндодермис активно способствует распространению в перицикле. Целенаправленной блокировки эндодермальной гормональной сигнализации достаточно, чтобы ингибировать даже самое первое деление в клетках XPP47. Таким образом, перицикл эндодермис связи представляет собой очень ранний контрольно-пропускной пункт для бокового развития корней в Arabidopsis. Это, однако, не известно, как этот перекрестный разговор выполняется. Чтобы разгадать эту тайну, мы выбрали trap-seq подход к целевой XPP и эндодермальных клеток. Чтобы обогатить клетки в боковой корневой программе, мы имитировали гормональный триггер, экзогенно применяя аналог auxin (1-нафталенеацетической кислоты, NAA)48, который в то же время позволил временно решить начальную фазу бокового образования корня.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

В этой статье мы даем практические инструкции для получения транслатомных данных от различных типов корневых клеток Arabidopsis thaliana с помощью метода очистки сродства рибосомы (TRAP) и последовательной оптимизированной подготовки библиотеки с низким уровнем ввода.
В качестве исходного материала, мы используем растительные линии, которые выражают GFP-тегами рибосомного белка RPL18 в клеточном типе-специфического образом с помощью адекватных промоутеров. Перед иммуноочищением и экстракцией РНК ткань замораживается, что сохраняет целостность тканей и одновременно позволяет проводить исследования временных рядов с высоким временным разрешением. Примечательно, что структуры клеточной стенки остаются нетронутыми, что является основным недостатком в альтернативных процедурах, таких как флуоресценция активированных клеток сортировки на основе подходов, которые полагаются на ткани протоптертодляя изолировать различные популяции клеток. Кроме того, не требуется фиксация тканей, как в лазерных захвата микродиссекции на основе методов, что позволяет высококачественной РНК быть получены.
Однако отбор проб из субпопуляций клеток и только изоляция полисососообразной РНК серьезно ограничивает урожайность РНК. Поэтому необходимо применять достаточно чувствительные методы подготовки библиотекдля для успешного получения данных РНК-сек.
TRAP предлагает идеальный инструмент для исследования растений, так как многие процессы развития включают клеточные стены, связанные с механическими и механическими сигнальными путями. Использование промоутеров для целевых конкретных популяций клеток преодолевает разрыв между органом и одноклеточным уровнем, которые, в свою очередь, страдают от небольшого разрешения или очень высоких затрат. Здесь мы применяем TRAP для изучения клеточной связи в боковом корневом образовании.

Для оценки качества вышеупомянутая процедура должна быть исследована на нескольких промежуточных этапах: проверка шаблона выражения в плантах, контроль качества изолированной полисомальной РНК, а также окончательных библиотек. qRT-PCR с использованием известных генов...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Перевод рибосомной очистки сродства (TRAP) дает возможность вскрыть программы развития с минимальной обработкой органов и тканей. Протокол дает высококачественную РНК из клеток, ориентированных на зеленый флуоресцентный белок (GFP) помечены рибосомной субъединицы. Инструменты анализа вниз по течению, такие как qRT-PCR или RNA-seq, раскрывают профили экспрессии тканей и клеток.

Перевод Рибосома сродство очищения (TRAP) для расследования Arabidopsis thaliana Корневая развития в масштабе типа клеток

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

С помощью TRAP мы можем исследовать процесс развития в клеточном разрешении. Мы используем клеточный тип-специфических промоутеров для привода помечены рибосомные под-единицы, и оттуда мы можем изолировать полисомной РНК. Этот протокол дает высококачественную РНК, но в очень ограниченных количествах, поэтому методы, которые специализируются на сверхнизком вводе, необходимы для надежного производства высококачественных РНК-библиотек.TRAP является идеальным инструментом для исследования растений, потому что многие процессы развития опираются на клеточные стенки, связанные и механические сигнальные пути. Мы используем TRAP для изучения клеточной связи в боковом формировании корней. Поскольку получение РНК хорошего качества оказалось не таким прямым, как мы ожидали, мы надеемся, что эта пошаговая видео-инструкция увеличит применимость TRAP и поможет продвинуть этот мощный метод.Чтобы стерилизовать размножаемые гомозиготные линии, равномерно распределив менее 300 микролитров семян на 12 на 12 сантиметров в квадрате чашек Петри, и сложите посуду на 60-литровый децикатор. После ночной стерилизации газа, пусть газ испаряется перед сбором семян в 50 миллилитров трубки хранения. Перед покрытием разбавить стерилизованные семена 0,1%агара, чтобы получить один миллилитр впитываемой смеси семян на тарелку.Чтобы посадить смесь семян, используйте квадратные крышки чашки Петри, чтобы создать ламинированный держатель шаблона для посадки трех рядов семян на тарелку, и поместите пустые пластины агара в держатель шаблона. Равномерно распределим один миллилитр впитываемых семян на три ряда пластин. И поместите обработанные пластины в штабеля в ламинарный поток, пока семена не высохнут.Когда семена прилипли к поверхности агара, закройте крышки и запечатать каждую пластину с помощью микропорной ленты. Для экзогенного лечения корней арабидопсиса с агентом интереса, подготовить от 1,5 до двух сантиметров в ширину, 10 сантиметров длиной, полоски бумаги. Замочите бумагу в 10 микромоляных NAA, и использовать пинцет, чтобы применить полоску бумаги для каждого ряда корней.Затем осторожно нажмите любые пузырьки воздуха, и опорожнить избыток жидкости из пластины, прежде чем маркировки пластины со временем. В соответствующей экспериментальной точке конца, используйте типсы, чтобы тщательно удалить полоски бумаги ткани с каждой пластины, не отделяя корни, и использовать хирургическое лезвие, чтобы сократить один раз в ряд вдоль стрелять корень соединения, в один решительный удар. Используйте пинцет, чтобы проведите по корням каждого ряда, чтобы собрать корни в три пучка.И опорожните корни в 50 миллилитровую трубку, наполненную жидким азотом, для замораживания оснастки. Когда все образцы корня для обработки были собраны, decant сверхнормативный жидкий азот используя крышку пробки для того чтобы предотвратить корни от разливать. И поместите трубку в сосуд, для хранения 80 градусов по Цельсию.Для измельчения тканей и гомогенизации носите хлопчатобумажные перчатки под стандартными лабораторными перчатками и добавляйте PMSF в буфер полисомной экстракции. Опустите образец ткани в ступку, содержащую жидкий азот, и используйте охлажденный пестик, чтобы тщательно измельчить ткани, пока весь материал не появится в виде белого порошка. Когда вся ткань будет заземлена, добавьте в образец пять миллилитров буфера полисомной экстракции и быстро смешайте замороженные фрагменты тканей с порошком до того, как буфер замерзнет.Как только смесь может быть передана, опорожните суспензию в стеклянный гомогенизатор на льду, и использовать дополнительные два миллилитров полисомы буфера экстракции для полоскания раствора и пестика. Вручную измельчите суспензию до тех пор, пока экстракт не станет однородным. Затем, залить сырой экстракт корня в 50 миллилитров центрифуги трубки на льду, и обработать следующий образец, как попродемонстрировано.Для общего сбора РНК перенесите 200 микролитров алицитов каждого сырого образца в отдельные чистые, предварительно охлажденные, помеченные микроцентрифуговые трубки. Чтобы удалить клеточные стенки, мусор и большие органеллы, центрифуга образцов и декантировать супернатант в свежие, предварительно охлажденные конические трубки для второй центрифугации. В то время как трубки вращаются, aliquot 60 микролитров магнитных бусин GFP на образец, в 1,5 миллилитровую трубку.И поместите трубку на магнитную подсвечку, чтобы облегчить удаление супернатанта. Затем, мыть бисер два раза в один миллилитр холодного буфера мытья на стирку, и повторно приостановить бисер в 60 микролитров мыть буфера на образец. Сразу же после центрифугации, декант очищенного супернатанта в помечены 15 миллилитров труб, и добавить 60 микролитров промытых бусин в каждом образце.Затем поместите все образцы горизонтально в ведро со льдом, в течение двух часов инкубации с качанием. В конце инкубации соберите бисер на магнитной подгофе на льду и добавьте PMSF в оставшийся буфер извлечения полисомы. После отбрасывания супернатантов добавьте в образцы около пяти миллилитров буфера извлечения полисомы и повторно приостановите бисер в образцах с нежным наклоном.Рок образцов в течение 15 минут на шейкер на льду, а затем два моет со свежим буфером мытья на магните, как попродемонстрировано. После последней стирки перенесите образцы в один миллилитр буфера для мытья в 1,5 миллилитровую трубку. И собрать бисер еще раз на магнитной поднося, чтобы удалить все супернатанты.Затем поместите трубки на лед до тех пор, пока все образцы не будут обработаны. Для восстановления лабораторных принадлежностей, во-первых, промыть все оборудование в химические отходы. Ручная мытья растворов, пестиков и гомогенизаторов с мылом, прежде чем промыть каждый инструмент тщательно.Затем поместите оборудование в теплобезопасный контейнер и выпекайте материалы на ночь при температуре более 220 градусов по Цельсию. Кисть все центрифуги трубки очистить с моющим средством, прежде чем поместить трубки на автоклавный лоток с ободом и дым капот. Налейте один миллилитр жидкого дитил пирокарбоната и один литр деионизированного раствора воды на трубы в течение трех-18 часов.Затем соберите раствор перед стерилизацией лотка трубок в автоклаве. Здесь показаны представительные установки с сигналами GFP. Контр-окрашивание с propidium йодид отмечает очертания клеточной стенки.Линии соответствуют шаблону локализации эндодермиса и ксилем-полюсного перицикла. В этих репрезентативных измерениях, полученных с помощью полисомной РНК, большинство образцов показали очень небольшую деградацию, при этом показатели целостности РНК варьируются от девяти до 10. На этих графиках можно наблюдать следы успешно подготовленных библиотек, подчеркивая надежность процедуры, несмотря на уменьшенные объемы реакции.Перед производством набора данных, охватывающего геном, РНК TRAP из экспериментального эксперимента может быть исследована количественным RTPCR для проверки успеха лечения и/или экспериментальных условий, а также специфичности тканей. В этом анализе, тестирование трех auxin-ответных генов подтвердило успешную индукцию гормона после двух часов лечения. Профили генов маркеров, полученные из данных секвенирования, подтвердили специфичность клеточного типа.Следуйте рекомендациям хорошей практики, когда вы справляетесь с РНК. Работайте на стерильной скамейке, очищайте оборудование раствором для удаления РНК, носите перчатки и немедленно меняйте их, когда они загрязняются. Будьте уверены, чтобы надлежащим образом обрабатывать и отказаться от всех токсичных химических веществ и газов, которые были использованы во время процедуры, особенно фенол-DEPC хлора газа и жидкого азота.В портфолио омических исследований TRAP занимает важную нишу и уже используется для ответа на многие биологические вопросы, особенно в биологии развития, TRAP имеет огромный потенциал.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Геомагнитное поле (Gmf) и завод Эволюция: Исследуя эффекты ГМП Разворот на<em&gt; Резуховидка Таля</em&gt; Разработка и экспрессия генов

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Построение конечно-элементных моделей по расследованию данио рерио Щековые биомеханики

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Простая камера для долговременной конфокальной визуализации развития корней и гипокотилов

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Светосвязная реверсивная модуляция митоген-активированного пути протеинкиназы при дифференцировке клеток и<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональное развитие

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

В пробирке Выращивания яйцеклетку для Live клеточной Imaging зигота поляризации и кучность эмбриона в проростках Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Создание личиночной данио рерио как модель животного к расследованию Trypanosoma cruzi подвижности In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...