Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Nos gustaría dar las gracias a Jean-Claude Walser, del Centro de Diversidad Genética de Zúrich, por su asesoramiento experto crucial en la fase inicial de este proyecto. El trabajo en el laboratorio de Vermeer fue apoyado por una beca de cátedra SNF (PP00P3_157524) y una subvención de equipo R'EQUIP (316030_164086) de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (SNSF) otorgada a JEMV.

1. Clonación de transgénicos, producción de líneas transgénicas y selección
<ol><li>Clonar el promotor de elección en el vector de entrada adecuado. Utilice un método de clonación basado en recombinación (Tabla de materiales) y recombine los promotores en pDONRP4-P1r. Clonar RPL18 (con etiqueta de afinidad o proteína fluorescente de elección) utilizando clonación basada en recombinación en pDONRP1-P249.</li>
	<li>Combine el vector de entrada que contiene RPL18<...

Verificación del patrón de localización RPL18 El patrón de expresión adecuado de la subunidad ribosomal etiquetada es fundamental para evitar la interpretación errónea de los datos de cualquier experimento TRAP. Por lo tanto, la incorporación de GFP como etiqueta de epítope a RPL18 permite muy elegantemente la verificación del patrón de expresión deseado y, consecutivamente, la extracción de la fracción de polisoma del mismo tejido. Los enfoques más invasivos para asegurar patrones de p...

Impulsada por la creciente aplicación de técnicas de secuenciación de próxima generación, se podría aumentar la resolución espacial en la biología del desarrollo. Los estudios contemporáneos tienen como objetivo disuajar tejidos hasta tipos de células especializadas, si no de un solo nivel de células1,,2,3,4. Para ello, en los últimos cincuenta años se ha ideado una plétora de métodos diferentes (véase la Figura 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Muchas herramientas en la ciencia vegetal han sido adaptaciones de técnicas que fueron pioneras en la investigación animal. Este no es el caso del método que estamos introduciendo en detalle aquí. En 2005, equipado con una sólida experiencia en traducción de proteínas, el Bailey-Serres Lab se propuso diseñar proteínas ribosomales para la posterior purificación de afinidad16. Por lo tanto, podrían evitar el perfilado de polisomas que consume mucho tiempo y requiere mucha mano de obra, que se basa en la ultracentrifugación con un gradiente de sacarosa y se utilizó para evaluar la traducción de ribosomas desde la década de 196017,18. Desde entonces, el método se ha denominado purificación de afinidad ribosoma traslacional (TRAP)16. Después de estudios de traducción exitosos en plantas, Heiman et al. adaptó TRAP para animales19 y otros ampliaron su aplicación a la levadura20, Drosophila21, Xenopus22 y zebrafish23,,24.
Aunque la modificación genética del sistema modelo es un requisito previo para trap, que limita su aplicación a especies susceptibles a la transformación genética, se puede aprovechar simultáneamente esta objeción a los subconjuntos objetivo de células que son de especial interés y, por lo tanto, extremadamente difíciles de aislar del tejido/órgano intacto25 (por ejemplo, células dendríticas altamente ramificadas en un cerebro de ratón o hifas fúngicas en el tejido vegetal infectado). En las plantas, todas las células se mantienen en su lugar a través de paredes celulares que forman la base del esqueleto hidrostático26. Para liberar una célula vegetal de esta matriz, los científicos han cortado físicamente la célula de su tejido circundante a través de la microdisección de captura láser (LCM)27 o han realizado digestión enzimática de las paredes celulares28. Entre estas últimas células, las llamadas protoplastias, la población de interés está etiquetada fluorescentemente y se puede separar mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)7. LCM generalmente requiere que una muestra sea fija e incrustada en la cera, lo que en última instancia deteriora la calidad de su ARN29. Los métodos basados en FACS producen ARN de alta calidad, pero el proceso de protoplasting en sí mismo introduce diferencias en la expresión génica30 y los tejidos con paredes celulares secundarias modificadas y gruesas son notoriamente difíciles de tratar. Además, se supone que muchos procesos de desarrollo en las plantas dependen de señales transmitidas mecánicamente y, por lo tanto, la integridad de la pared celular es de suma importancia31. Dos métodos, que utilizan un acceso directo para eludir el aislamiento celular operando en el nivel de nucleii, son la clasificación nuclear activada por fluorescencia (FANS) y el aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de células específicos (INTACT). Al igual que en TRAP, utilizan promotores específicos del tipo de celda para marcar los núcleos, que posteriormente se enriquecen a través de la clasificación o el tirón hacia abajo, respectivamente8,15. Un desafío importante para todos estos enfoques es obtener suficiente material de ARN de subconjuntos de células en un tejido. Como TRAP captura solo una fracción de los ARN celulares, la recolección de muestras es un cuello de botella considerable. Por lo tanto, se necesitan protocolos de preparación de bibliotecas especialmente sensibles para producir datos de alta calidad a partir de cantidades de entrada bajas.
Desde su creación, TRAP se ha utilizado en combinación con microarrays de ADN o, como los costos de secuenciación disminuyeron significativamente en los últimos años, ARN-seq10,32,33. Una multitud de preguntas de investigación ya se ha aclarado como se revisó en Sablok et al.34. Estamos convencidos de que seguirán más informes en los próximos años, ya que la técnica es muy versátil a la hora de combinar diferentes promotores para apuntar a tipos de células específicas. Eventualmente, esto se hará incluso de una manera inducible, y puede combinarse con el sondeo de la reacción de la planta a muchos factores de estrés biótico y abiótico. Además, cuando no se dispone de líneas transgénicas estables, los sistemas de expresión de raíces peludas también se han utilizado con éxito para realizar TRAP en tomate y medicago35,,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figura 1: La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) complementa la cartera de análisis "omics". A. El aumento de los niveles de precisión analítica, hasta una sola célula o incluso la resolución subcelular se puede lograr mediante una plétora de métodos o combinaciones de los mismos. El esquema ofrece una visión general de las herramientas disponibles actualmente en el campo vegetal y animal. La recolección de tejidos a resolución celular se puede lograr mediante protocolos como LCM o FACS, que luego se acoplan al transcriptoma estándar o al análisis de perfiles/traducción de polisoma. TRAP e INTACT integran la captura de tejido y el aislamiento de ARN, ya que se basan en el etiquetado de epítopos. Sin embargo, INTACT sólo toma muestras de núcleos celulares y constituye, por lo tanto, un caso especial de análisis de transcriptoma. Un pequeño icono de conejo marca los métodos recientemente desarrollados en el campo animal: Mientras que SLAM-ITseq y Flura-seq se basan en el objetivo metabólico de ARN nacientes con bases de uracilo modificadas en células que expresan la enzima permisiva, Slide-seq hace uso de un portaobjetos de vidrio recubierto con códigos de barras de ADN que proporcionan información posicional en el rango celular. Se sigue un enfoque de etiquetado de proximidad en APEX-seq para muestrear ARN en compartimentos subcelulares específicos. En particular, el aumento de la resolución a menudo requiere la generación de material transgénico (asteriscos) y, por lo tanto, estos métodos se utilizan predominantemente para las especies modelo. TRAP es especialmente adecuado para estudios de ciencias vegetales que involucran pared celular (CW) o señalización mecánica, así como especies celulares que son difíciles de liberar de su matriz CW. B. Pasos detallados de laboratorio húmedo del procedimiento TRAP: Las plántulas que expresan proteína ribosomal etiquetada con GFP en distintos tipos de células (por ejemplo, endodermis de raíz) se cultivan en platos De Petri durante siete días y el material radicular cosechado por congelación rápida. Se recoge una muestra de control total de ARN del extracto crudo homogeneizado antes de peletizar los escombros a través de la centrifugación. Las perlas magnéticas anti-GFP se añaden al extracto transparente para realizar la inmunoprecipitación. Después de la incubación y tres pasos de lavado, el ARN asociado al polisoma (ARN TRAP/polisoma) se obtiene directamente a través de la extracción de fenol-cloroformo. LCM: microdisección de captura láser, FACS/FANS: clasificación celular/nuclear activada por fluorescencia, APEX-seq: método basado en ascorbación peroxidasa diseñada, INTACT: aislamiento de núcleos etiquetados en tipos de células específicas, alquilación vinculada a SLAM-ITseq: thiol(SH) para la secuenciación metabólica de ARN en tejido, Flura-seq: secuenciación de ARN con etiqueta de fluorouracilo (Creado con Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del método TRAP, resaltar los pasos críticos y proporcionar orientación para un posible método de preparación de biblioteca.
Un experimento trap genérico consistirá esencialmente en los siguientes pasos (véase también la figura 1B):(1) Preparación de material vegetal, incluida la clonación de la construcción de etiquetado de ribosoma, producción y selección de líneas transgénicas, cultivo y abultamiento de semillas, esterilización y chapado, y aplicación/tratamiento de tensión (opcional) y recolección de tejidos; 2) inmunopurificación, incluida la homogeneización tisular y la limpieza del extracto crudo, el lavado de cuentas y la inmunopurificación, y las etapas de lavado; 3) extracción de ARN y evaluación de la calidad; y (4) la preparación de la biblioteca.
La raíz de Arabidopsis ha sido un sistema modelo para estudiar el desarrollo de la planta desde su introducción como planta modelo37,,38. Aquí, la aplicación de TRAP se muestra en el contexto del desarrollo de la raíz lateral de la planta. En las plantas, la acumulación de todo el sistema radicular se basa en la ejecución de este programa y por lo tanto es muy importante para la supervivencia del organismo39. En Arabidopsis,las raíces laterales se originan a partir de tejido periciclo que reside junto a vasos xilemas y, por lo tanto, se denomina periciclo de polo xilem (XPP; véase la figura 2C)40. Algunas células XPP, que se encuentran en lo profundo de la raíz, adquieren una identidad celular fundadora y, tras un desencadenante hormonal local, comienzan a proliferar por hinchazón y división anticlinalmente41. Sin embargo, debido a la presencia de una matriz de pared celular rígida, este proceso ejerce tensión mecánica en los tejidos circundantes. En particular, la endodermis superpuesta se ve afectada, ya que se encuentra en el camino del eje de crecimiento de la raíz lateral42,,43,44. De hecho, el primordium recién formado tendrá que crecer a través de la célula de endodermis superpuesta(Figura 2C2),mientras que las células de corteza y epidermis simplemente se apartan para que el primordium finalmente surja45,46. El trabajo reciente en nuestro laboratorio ha demostrado que la endodermis está contribuyendo activamente a acomodar la proliferación en el periciclo. El bloqueo dirigido de la señalización hormonal endodérmica es suficiente para inhibir incluso la primera división en las células XPP47. Por lo tanto, la comunicación periciclo-endodermis constituye un punto de control muy temprano para el desarrollo de la raíz lateral en Arabidopsis. Sin embargo, no se sabe cómo se realiza esta charla cruzada. Para desentrañar este misterio, elegimos el enfoque TRAP-seq para apuntar a las células XPP y endodeérmicas. Para enriquecer las células en el programa de raíz lateral, imitamos el desencadenante hormonal aplicando exógenamente un análogo de auxina (ácido 1-naftalencia, NAA)48,que al mismo tiempo permitió resolver temporalmente la fase inicial de la formación de la raíz lateral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

En este artículo, damos instrucciones prácticas para obtener datos de traducción de diferentes tipos de células raíz de Arabidopsis thaliana a través del método de traducción de purificación de afinidad ribosoma (TRAP) y la preparación de bibliotecas de baja entrada optimizadas consecutivas.
Como material de partida, empleamos líneas vegetales que expresan la proteína ribosomal etiquetada por GFP RPL18 de una manera específica del tipo de célula mediante el uso de promotores adecuados. Antes de la inmunopurificación y la extracción de ARN, el tejido se congela a presión, lo que preserva la integridad del tejido y simultáneamente permite la ejecución de estudios de series temporales con alta resolución temporal. En particular, las estructuras de las paredes celulares permanecen intactas, lo que es un inconveniente importante en procedimientos alternativos como enfoques basados en la clasificación celular activado por fluorescencia que se basan en el protoduro de tejidos para aislar poblaciones celulares distintas. Además, no es necesaria ninguna fijación tisular como en las técnicas basadas en microdisección de captura láser, lo que permite obtener ARN de alta calidad.
Sin embargo, el muestreo de subpoblaciones de células y solo el arn asociado al poliso limita gravemente los rendimientos del ARN. Por lo tanto, es necesario aplicar métodos de preparación de bibliotecas suficientemente sensibles para la adquisición exitosa de datos por ARN-seq.
TRAP ofrece una herramienta ideal para la investigación de plantas, ya que muchos procesos de desarrollo implican vías de señalización mecánica y relacionadas con la pared celular. El uso de promotores para dirigirse a poblaciones celulares específicas está cerrando la brecha entre el nivel de órgano y de una sola célula que a su vez sufren de poca resolución o costos muy altos. Aquí, aplicamos TRAP para estudiar la comunicación célula-célula en la formación de raíces laterales.

Para la evaluación de la calidad, el procedimiento antes mencionado debe sondearse en varios pasos intermedios: validación del patrón de expresión en planta, control de calidad del ARN polisómico aislado, así como de las bibliotecas finales. QRT-PCR utilizando genes marcadores conocidos se puede, además, realizar para confirmar la respuesta a la condición de tratamiento o para afinar las condiciones experimentales.
<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Con TRAP, podemos investigar el procesamiento del desarrollo en resolución celular. Usamos promotores específicos de tipo celular para conducir una subunidad ribosomal etiquetada, y desde allí podemos aislar el ARN polisoma. Este protocolo produce ARN de alta calidad, pero en cantidades muy limitadas, por lo tanto, se necesitan métodos especializados para la entrada ultrabajo para producir de forma fiable bibliotecas de ARN de alta calidad.TRAP es una herramienta ideal para la investigación de plantas, ya que muchos procesos de desarrollo se basan en vías de señalización mecánica y relacionadas con la pared celular. Utilizamos TRAP para estudiar la comunicación célula-célula en la formación de raíz lateral. Como la obtención de ARN de buena calidad demostró no ser tan directo como esperábamos, esperamos que esta instrucción de video paso a paso aumente la aplicabilidad de TRAP y ayude a promover esta poderosa técnica.Para esterilizar las líneas homocigotas propagadas, esparza menos de 300 microlitros de semillas uniformemente en platos Petri de 12 por 12 centímetros cuadrados, y apila los platos en un desecador de 60 litros. Después de la esterilización de gas durante la noche, deje que el gas se evapore antes de recoger las semillas en un tubo de almacenamiento de 50 mililitros. Antes de enchapar, diluir las semillas esterilizadas con 0,1% de agar para obtener un mililitro de mezcla de semillas impregnadas por placa.Para la mezcla de semillas, utilice tapas cuadradas para el plato Petri para crear un porta plantillas laminadas para plantar tres filas de semillas por plato, y coloque las placas de agar vacías en el soporte de la plantilla. Distribuya un mililitro de las semillas impregnadas uniformemente en tres filas de placas. Y coloque las placas procesadas en pilas en un flujo laminar, hasta que las semillas estén secas.Cuando las semillas se hayan pegado a la superficie del agar, cierre las tapas y selle cada placa con cinta adhesiva de microprés. Para el tratamiento exógeno de las raíces de Arabidopsis con un agente de interés, prepare tiras de papel tisú de 1,5 a dos centímetros de ancho y 10 centímetros de largo. Remoje el papel tisú en 10 MIA micromolares y use pinzas para aplicar una tira de papel tisú a cada fila de raíces.A continuación, presione suavemente cualquier burbuja de aire y vacíe el exceso de líquido de la placa, antes de etiquetar la placa con el tiempo. En el punto final experimental apropiado, utilice fórceps para extraer cuidadosamente las tiras de papel tisú de cada placa sin separar las raíces, y utilice una cuchilla quirúrgica para cortar una vez por fila a lo largo de la unión de raíz de brote, en un solo trazo determinado. Usa pinzas para deslizar a lo largo de las raíces de cada fila, para recoger las raíces en tres paquetes.Y vacíe las raíces en un tubo de 50 mililitros lleno de nitrógeno líquido, para congelar a presión. Cuando se hayan recogido todas las muestras de raíz por tratamiento, decante el exceso de nitrógeno líquido utilizando la tapa del tubo para evitar que las raíces se derramen. Y coloque el tubo en un recipiente de hacedor, para un almacenamiento de 80 grados centígrados.Para la molienda y homogeneización de tejidos, use guantes de algodón debajo de guantes de laboratorio estándar y agregue PMSF al tampón de extracción de polisomas. Vacíe la muestra de tejido en un mortero que contenga nitrógeno líquido y utilice un pestillo enfriado para moler cuidadosamente los tejidos hasta que todo el material aparezca como un polvo blanco. Cuando todo el tejido haya sido molido, agregue cinco mililitros de tampón de extracción de polisoma a la muestra y mezcle rápidamente los fragmentos de tejido congelados con el polvo antes de que el tampón se congele.Tan pronto como la mezcla se puede transferir, vacíe la suspensión en un homogeneizador de vidrio sobre hielo, y utilice dos mililitros adicionales de tampón de extracción de polisoma para enjuagar el mortero y el pestillo. Moler manualmente la suspensión hasta que el extracto sea homogéneo. A continuación, vierta el extracto de raíz bruta en un tubo centrífugo de 50 mililitros sobre hielo, y procese la siguiente muestra como se ha demostrado.Para la recolección total de ARN, transfiera 200 alícuotas de microlitros de cada muestra bruta a tubos de microcentrífugas individuales limpios, preenfriados y etiquetados. Para eliminar las paredes celulares, los desechos y los orgánulos grandes, centrifugar las muestras y decantar el sobrenadante en tubos cónicos frescos y preenfriados para una segunda centrifugación. Mientras los tubos giran, aliquot 60 microlitros de cuentas magnéticas de GFP por muestra, en un tubo de 1,5 mililitros.Y coloque el tubo en un soporte magnético, para facilitar la extracción de sobrenadantes. Luego, lave las cuentas dos veces en un mililitro de tampón de lavado en frío por lavado, y vuelva a suspender las perlas en 60 microlitros de tampón de lavado por muestra. Inmediatamente después de la centrifugación, decantar el sobrenadante despejado en tubos etiquetados de 15 mililitros, y agregue 60 microlitros de perlas lavadas a cada muestra.A continuación, coloque todas las muestras horizontalmente en un cubo de hielo, durante una incubación de dos horas con balanceo. Al final de la incubación, recoja las perlas en un soporte magnético sobre hielo y agregue PMSF al búfer de extracción de polisoma restante. Después de desechar los sobrenadantes, agregue aproximadamente cinco mililitros de tampón de extracción de polisoma a las muestras, y vuelva a suspender las perlas dentro de las muestras con una inclinación suave.Mece las muestras durante 15 minutos en la coctelera sobre hielo, seguido de dos lavados con tampón de lavado fresco en el imán, como se ha demostrado. Después del último lavado, transfiera las muestras en un mililitro de tampón de lavado, a un tubo de 1,5 mililitros. Y recoger las cuentas una vez más en el soporte magnético, para eliminar todo el sobrenadante.A continuación, coloque los tubos sobre hielo hasta que se hayan procesado todas las muestras. Para el reacondicionamiento de los suministros de laboratorio, primero, enjuague todo el equipo en los residuos químicos. Lavar a mano los morteros, las plagas y los homogeneizadores con jabón, antes de enjuagar cada instrumento a fondo.A continuación, coloque el equipo en un recipiente seguro para el calor y hornee los materiales durante la noche a más de 220 grados centígrados. Cepille todos los tubos centrífugos limpios con detergente, antes de colocar los tubos en una bandeja autoclaveable con una llanta y una campana de humo. Vierta un mililitro de pirocarbonato líquido de dietil y un litro de solución de agua desionizada en los tubos durante tres a 18 horas.A continuación, recoja la solución antes de esterilizar la bandeja de tubos en el autoclave. Aquí se muestran las plantas representativas con señales GFP. La contramancha con yoduro propidium marca los contornos de la pared celular.Las líneas corresponden al patrón de localización de la endodermis y al periciclo de polo xilem. En estas mediciones representativas obtenidas a partir de ARN polisoma, la mayoría de las muestras mostraron muy poca degradación, con números de integridad del ARN que oscilaban entre nueve y 10. En estos gráficos, se pueden observar rastros de bibliotecas preparadas con éxito, destacando la robustez del procedimiento, a pesar de los volúmenes de reacción reducidos.Antes de que se produzca un conjunto de datos de expansión del genoma, el ARN TRAP de un experimento piloto puede ser sondeado por RTPCR cuantitativo para validar el éxito del tratamiento y/o las condiciones experimentales, así como la especificidad del tejido. En este análisis, la prueba de tres genes sensibles a la auxina confirmó una inducción hormonal exitosa después de dos horas de tratamiento. Los perfiles de genes marcadores específicos del tejido recuperados de los datos de secuenciación confirmaron la especificidad del tipo de célula.Siga los consejos de buenas prácticas cuando maneje el ARN. Trabaje en un banco estéril, limpie su equipo con una solución para remover arneses, use guantes y cámbielos inmediatamente cuando se contaminen. Asegúrese de manipular y desechar adecuadamente todos los productos químicos y gases tóxicos que se han utilizado durante el procedimiento, especialmente el gas de cloro fenol-DEPC y el nitrógeno líquido.En la cartera de estudios omic, TRAP ocupa un nicho importante, y ya se ha utilizado para responder a muchas preguntas biológicas, especialmente en biología del desarrollo, TRAP tiene un enorme potencial.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Campo geomagnético (Gmf) y evolución de las plantas: La investigación de los efectos de Gmf Reversión en<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Desarrollo y Expresión Génica

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...