Name: translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Vi vill tacka Jean-Claude Walser från Genetic Diversity Center Zürich för viktiga expertråd i den tidiga fasen av detta projekt. Arbetet i Vermeer labbet stöddes av en SNF professur stipendium (PP00P3_157524) och en R'EQUIP utrustning bidrag (316030_164086) från Swiss National Science Foundation (SNSF) tilldelas JEMV.

1. Kloning av transgen, transgenlinjeproduktion och val
<ol><li>Klona valfri promotor i lämplig ingångsvektor. Använd en rekombinationsbaserad kloningsmetod (Tabell över material) och kombinera om initiativtagarna i pDONRP4-P1r. KlonA RPL18 (med affinitetstagg eller lysrörsprotein) med hjälp av rekombinationsbaserad kloning i pDONRP1-P249.</li>
	<li>Kombinera ingångsvektorn som innehåller RPL18 med den promotorhaltiga ingångsvektorn i en två fragmentrekombinat...

Verifiering av RPL18-lokaliseringsmönster Avgörande för att undvika feltolkning av data från alla TRAP-experiment är det korrekta uttrycksmönstret för den taggade ribosomala underenheten. Därför tillåter införlivandet av GFP som en epitoptagg till RPL18 mycket elegant kontroll av det önskade uttrycksmönstret och i följd, pulldown av polysomefraktionen från samma vävnad. Mer invasiva metoder för att säkerställa korrekt promotor mönster följs av Jiao och Mayerowitz 2010, vilket krä...

Driven av den ökande tillämpningen av nästa generations sekvenseringstekniker skulle rumslig upplösning i utvecklingsbiologi kunna utökas. Samtida studier syftar till att dissekera vävnader ner till specialiserade celltyper, om inte encellig nivå1,,2,,3,4. I detta syfte har en uppsjö av olika metoder utarbetats under de senaste femtio åren (se figur 1A)5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.
Många verktyg inom växtvetenskap har varit anpassningar av tekniker som var pionjärer inom djurforskning. Detta är inte fallet för den metod som vi inför i detalj här. Under 2005, utrustad med en stark bakgrund inom proteinöversättning, Bailey-Serres Lab syftar till att ingenjör ribosomala proteiner för efterföljande affinitet rening16. Således kunde de undvika tidskrävande och arbetsintensiv polysome profilering, som bygger på ultracentrifugering med en sackaros gradient och användes för att bedöma översätta ribosomer sedan 1960-talet17,18. Metoden har sedan dess kallat translationell ribosomaffinitetsrening (TRAP)16. Efter framgångsrika översättarstudier på växter, Heiman et al. anpassade TRAP för djur19 och andra utvidgas dess tillämpning till jäst20, Drosophila21, Xenopus22 och zebrafisk23,24.
Även om genetisk modifiering av modellsystemet är en förutsättning för TRAP, som begränsar dess tillämpning till arter som kan användas för genetisk omvandling, kan man samtidigt utnyttja denna invändning mot målundergrupper av celler som är av särskilt intresse och i övrigt extremt svårt att isolera från intakt vävnad/organ25 (t.ex. höggrenade dendritiska celler i en mushjärna eller svamphyfa i infekterad växtvävnad). I växter hålls alla celler på plats via cellväggar som ligger till grund för det hydrostatiska skelettet26. För att frigöra en växtcell från denna matris, forskare har antingen fysiskt skära cellen ur sin omgivande vävnad genom laser fånga microdissection (LCM)27 eller utförs enzymatisk matsmältning av cellväggarna28. Bland de senare cellerna, så kallade protoplaster, är populationen av intresse fluorescerande märkt och kan separeras via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)7. LCM kräver vanligtvis ett prov som skall fastställas och inbäddad i vax, vilket i slutändan försämrar kvaliteten på dess RNA29. FACS-baserade metoder ger högkvalitativa RNA, men processen att protoplasting själv introducerar skillnader i genuttryck30 och vävnader med modifierade och tjocka sekundära cellväggar är notoriskt svåra att behandla. Dessutom antas många utvecklingsprocesser i anläggningar förlita sig på mekaniskt överförda signaler och därför är cellväggens integritet av största vikt31. Två metoder, som använder en genväg för att kringgå cellisolering genom att arbeta på nivån av kärnor, är fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) och isolering av kärnor taggade i specifika celltyper (INTAKT). Liksom i TRAP använder de celltypspecifika promotorer för att markera kärnor, som därefter berikas via sortering eller pull down,respektive 8,15. En stor utmaning för alla dessa metoder är att få tillräckligt RNA-material från delmängder av celler i en vävnad. Som TRAP fångar bara en bråkdel av den cellulära RNAs, prov insamling är en betydande flaskhals. Därför behövs särskilt känsliga biblioteksförberedelseprotokoll för att producera högkvalitativa data från låga indatamängder.
Sedan starten har TRAP antingen använts i kombination med DNA-mikroarrayer eller, som sekvensering kostnader minskat betydligt under de senaste åren, RNA-seq10,32,33. En mängd forskningsfrågor har redan klarlagts som granskats i Sablok et al.34. Vi är övertygade om att fler rapporter kommer att följa under de kommande åren eftersom tekniken är mycket mångsidig när man kombinerar olika initiativtagare för att rikta specifika celltyper. Så småningom, Detta kommer att ske även på ett inducerande sätt, och kan kombineras med sondering av anläggningens reaktion på många biotiska och abiotiska stressfaktorer. Dessutom, där stabila transgena linjer inte finns tillgängliga, håriga rot uttryckssystem har också framgångsrikt använts för att utföra TRAP i tomat och medicago35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> Figur 1: Omräkning av ribosomaffinitetsrening (TRAP) kompletterar analysportföljen "omics". A. Ökande nivåer av analytisk precision, ner till encellig eller till och med subcellulär upplösning kan uppnås genom en uppsjö av metoder eller kombinationer av dessa. Systemet ger en översikt över de verktyg som för närvarande finns tillgängliga på växt- och djurområdet. Vävnadssamling vid cellupplösning kan uppnås genom protokoll som LCM eller FACS, som sedan kopplas till standard transkriptom eller polysome profilering / översättaranalys. TRAP och INTACT integrerar både vävnadsfångst och RNA-isolering eftersom de är baserade på epitop-märkning. Intakt prover endast cellkärnor och utgör därför ett specialfall av transkriptom analys. En liten kanin ikon markerar nyutvecklade metoder inom djurområdet: Medan SLAM-ITseq och Flura-seq förlita sig på metabolisk targetting av begynnande RNAs med modifierade uracil baser i celler som uttrycker tillåtande enzym, Slide-seq använder sig av en bestruken glas bild med DNA-streckkoder som ger positionsinformation i cellområdet. En närhetsmärkning följs i APEX-seq för att prova RNA i specifika subcellulära fack. Framför allt kräver ökad upplösning ofta generering av transgent material (asterisker) och dessa metoder används därför främst för modellarter. TRAP är särskilt lämpad för växtvetenskapliga studier med cellvägg (CW) eller mekaniker signalering samt cellarter som är svåra att släppa från sin CW matris. B. Detaljerade våt-lab steg i TRAP förfarandet: Plantor som uttrycker GFP-märkt ribosomalt protein i olika celltyper (t.ex. rot endodermis) odlas på petriskålar i sju dagar och rotmaterial skördas genom snap frysning. Ett totalt RNA-kontrollprov samlas in från det homogeniserade råextraktet innan skräpet pelleteras via centrifugering. Magnetiska anti-GFP pärlor läggs till rensade extrakt för att utföra immunprecipitation. Efter inkubation och tre tvättsteg erhålls det polysome-associerade RNA (TRAP/polysome RNA) direkt via fenol-kloroformextraktion. LCM: mikroavskiljning av laseravskiljning, FACS/FLÄKTAR: fluorescensaktiverad cell-/kärnsortering. APEX-seq: metod baserad på konstruerad askorbatperoxidas, INTAKT: isolering av kärnor taggade i specifika celltyper, SLAM-ITseq: thiol(SH)-linked alkylation för metabolisk sekvensering av RNA i vävnad, Flura-seq: fluorouracil-märkt RNA-sekvensering (Skapad med Biorender.com) Klicka här för <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">att se en större version av denna figur.</a>
Målet med den här artikeln är att tillhandahålla en detaljerad beskrivning av TRAP-metoden, att markera kritiska steg och att ge vägledning för en möjlig biblioteksförberedelsemetod.
Ett generiskt TRAP-experiment kommer huvudsakligen att bestå av följande steg (se även figur 1B):(1) Beredning av växtmaterial, inklusive kloning av ribosommärkningskonstruktion, transgen linjeproduktion och val, odling och sammanslagning av frön, sterilisering och plätering samt stressapplicering/behandling (frivillig uppgift) och vävnadsskörd. (2) immunrening inklusive vävnad homogenisering och clearing av rå extrakt, pärla tvätt och immunrening, och tvätta steg; (3) RNA-utvinning och kvalitetsbedömning. och (4) biblioteksförberedelser.
Den Arabidopsis roten har varit en modell system för att studera växtutveckling ända sedan den infördes som en modell anläggning37,38. Här visas tillämpningen av TRAP upp i samband med växt lateral rot utveckling. I växter, uppbyggnaden av hela rotsystemet bygger på genomförandet av detta program och är därför mycket viktigt för överlevnaden av organismen39. I Arabidopsiskommer laterala rötter från pericycle vävnad som finns bredvid xylem fartyg och därför kallas xylem pole pericycle (XPP; se figur 2C)40. Vissa XPP celler, som ligger djupt inne i roten, förvärva en grundare cell identitet och, på en lokal hormonell trigger, börjar föröka sig genom svullnad och dela anticlinally41. Men på grund av närvaron av en styv cellvägg matris, utövar denna process mekanisk stress på de omgivande vävnaderna. I synnerhet påverkas den överliggande endodermis, som det är i vägen för den laterala rottillväxtaxeln42,43,44. Faktum är att den nybildande primordium måste växa genom den överliggande endodermis cellen (Figur 2C2) medan cortex och epidermis celler bara skjuts åt sidan för primordium att äntligen dyka upp45,46. Senaste arbetet i vårt labb har visat att endodermis aktivt bidrar till att tillgodose spridningen i pericycle. Riktad blockering av endodermal hormonell signalering är tillräcklig för att hämma även den allra första divisionen i XPP-cellerna47. Därför utgör pericycle-endodermis kommunikation en mycket tidig kontrollpunkt för lateral rot utveckling i Arabidopsis. Det är dock inte känt hur denna överhörning utförs. För att reda ut detta mysterium valde vi TRAP-seq-metoden för att rikta in sig på XPP och endodermala celler. För att berika för celler i det laterala rotprogrammet, härmade vi den hormonella utlösaren genom att exogent tillämpa en auxin analog (1-naftalenetiksyra, NAA)48, som samtidigt tillåtet att tidsmässigt lösa den inledande fasen av laterala rotbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterilization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach, 13%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214-1172/74/75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desiccator with porcelaine plate (DURAN)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl, 37%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4625.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate growth + harvesting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar plant for cell culture</td>
			<td>Applichem/Panreac</td>
			<td>A2111.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forcepts</td>
			<td>Rubis Switzerland</td>
			<td>5-SA model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore/surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAA</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes 120x120 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>688102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>VWR/Swann-Morton</td>
			<td>233-5454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissues, neutral, two-layered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any supplier of your choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoprecipitation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>e.g. gtma-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij-35</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1254-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (in accordance with centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>C0378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>113-7355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E174</td>
			<td>might have long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizers DUALL 23</td>
			<td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td>
			<td>SCERSP885450-0023 (set)</td>
			<td>SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-360</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2189.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mortar and pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470148-960 &#38; 470019-978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 091 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T143.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9780/AM9782</td>
			<td>for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, &#62;99.3%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol, p.a.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL02181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, p.a.</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf/Sigma</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td>LoBind</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>ThermoFisher/Ambion</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15/50 mL Tube Magnetic Separator</td>
			<td>Abraxis</td>
			<td>PN 472250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Kit D</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neodymium magnets</td>
			<td>Amazon/other</td>
			<td>6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024/1096</td>
			<td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer v4 kit</td>
			<td>Takara Bioscience</td>
			<td>634892</td>
			<td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>4200 Tapestation Instrument</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5400 Fragment Analyzer System</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChip</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td>
			<td>specialized equipment for RNA/DNA concentration determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA23</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: AGTGAGAATGAA 
			AGAAGAGAAGGG; 
			rev: GTGGCTGCGAAT 
			AATATGAATACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GH3.3</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: CAAACCAATCCT 
			CCAAATGAC; 
			rev: ACTTATCCGCAA 
			CCCGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBD29</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TCTCCAACAACA 
			GGTTGTGAAT; 
			rev: AAGGAGCCTTAG 
			TAGTGTCTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBC21</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td>fwd: TGCGACTCAGGG 
			AATCTTCT; 
			rev: TCATCCTTTCTT 
			AGGCATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Adv cDNA Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#172-5038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-1000-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-10-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 100 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-100-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-20-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>TF-200-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing company</td>
			<td>Novogene</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

translating ribosome affinity purification (trap) to investigate arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale

I den här artikeln ger vi praktiska instruktioner för att erhålla översättningsdata från olika Arabidopsis thaliana rotcellstyper via metoden översätta ribosomaaffinitetsrening (TRAP) och på varandra följande optimerade biblioteksförberedelser med låg ingång.
Som utgångsmaterial använder vi växtlinjer som uttrycker GFP-märkt ribosomalt protein RPL18 på ett celltypspecifikt sätt med hjälp av lämpliga initiativtagare. Före immunorening och RNA-extraktion är vävnaden snäppfryst, vilket bevarar vävnadsintegriteten och samtidigt möjliggör utförande av tidsseriestudier med hög temporal upplösning. Framför allt förblir cellväggsstrukturerna intakta, vilket är en stor nackdel i alternativa förfaranden såsom fluorescensaktiverade cellsorteringsbaserade metoder som är beroende av vävnadsprotoplasting för att isolera olika cellpopulationer. Dessutom är ingen vävnad fixering nödvändig som i laser fånga mikrodissection-baserade tekniker, vilket gör att högkvalitativa RNA som skall erhållas.
Provtagning från subpopulationer av celler och endast isolera polysome-associerade RNA begränsar dock kraftigt RNA avkastning. Det är därför nödvändigt att tillämpa tillräckligt känsliga metoder för förberedelse av bibliotek för framgångsrik datainsamling av RNA-seq.
TRAP erbjuder ett idealiskt verktyg för växtforskning eftersom många utvecklingsprocesser involverar cellväggsrelaterade och mekaniska signalvägar. Användningen av initiativtagare för att rikta in sig på specifika cellpopulationer överbryggar klyftan mellan organ- och encellig nivå som i sin tur lider av små upplösningar eller mycket höga kostnader. Här tillämpar vi TRAP för att studera cellcellskommunikation i lateral rotbildning.

För kvalitetsbedömning bör ovannämnda förfarande undersökas vid flera mellanliggande steg: validering av uttrycksmönster i planta, kvalitetskontroll av det isolerade polysomala RNA och de slutliga biblioteken. qRT-PCR med hjälp av kända markörgener kan dessutom utföras för att bekräfta svaret på behandlingstillståndet eller för att finjustera försöksförhållandena.
Konfial analys av GFP-signaldistribut...

Watch this Scientific Journal Video about Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale at JoVE.com

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosomaffinitet rening (TRAP) erbjuder möjligheten att dissekera utvecklingsprogram med minimal bearbetning av organ och vävnader. Protokollet ger högkvalitativt RNA från celler riktade med ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt ribosomal underavdelning. Nedströms analysverktyg, till exempel qRT-PCR eller RNA-seq, avslöjar vävnads- och celltypspecifika uttrycksprofiler.

Översätta Ribosom Affinity Rening (TRAP) för att undersöka Arabidopsis thaliana Root Development på en celltyp-specifik skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Med TRAP kan vi undersöka utvecklingsbearbetning vid cellulär upplösning. Vi använder cell-typ-specifika initiativtagare för att köra en taggad ribosomal sub-enhet, och därifrån kan vi isolera polysome RNA. Detta protokoll ger hög kvalitet RNA, men i mycket begränsade mängder, därför, metoder som är specialiserade för ultra-låg input behövs för att tillförlitligt producera högkvalitativa RNA bibliotek.TRAP är ett idealiskt verktyg för växtforskning, eftersom många utvecklingsprocesser är beroende av cellväggsrelaterade och mekaniska signalvägar. Vi använder TRAP för att studera cell-cell kommunikation i lateral rotbildning. Som erhålla god kvalitet RNA visat sig inte så rakt fram som vi väntat, hoppas vi att denna steg-för-steg video instruktion kommer att öka TRAP tillämplighet och bidra till att främja denna kraftfulla teknik.För att sterilisera de förökade homozygous linjer, spridas mindre än 300 mikroliter frön jämnt på 12 av 12 centimeter kvadrat Petri rätter, och stapla disken på en 60 liters desiccator. Efter gassterilisering över natten, låt gasen avdunsta innan du samlar fröna i en 50 milliliter lagringsrör. Innan bordläggning, späd de steriliserade fröna med 0,1%agar för att erhålla en milliliter imbibed frö mix per platta.För att plattan fröet mix, använd fyrkantiga Petriskål lock för att skapa en laminerad mallhållare för plantering tre rader frön per tallrik, och placera tomma agar plattor i mallen innehavaren. Fördela en milliliter av de imbibed fröna jämnt på tre rader av plattor. Och placera de bearbetade plattorna i staplar i ett laminär flöde, tills fröna är torra.När frön har fastnat på agarytan, stäng locken och försegla varje platta med mikroporstejp. För exogen behandling av Arabidopsis rötter med ett medel av intresse, förbereda 1,5 till två centimeter breda, 10 centimeter långa, remsor av mjukpapper. Blötlägg silkespapper i 10 mikromolar NAA, och använd pincett för att applicera en remsa av silkespapper på varje rad av rötter.Tryck sedan försiktigt ut eventuella luftbubblor och töm överflödig vätska från plattan, innan du märker plattan med tiden. Vid lämplig experimentell slutpunkt, använd tång för att försiktigt ta bort remsorna vävnadspapper från varje platta utan att lossa rötterna, och använda ett kirurgiskt blad för att skära en gång per rad längs shoot-root korsningen, i en enda bestämd stroke. Använd pincett för att svepa längs rötterna i varje rad, för att samla rötterna i tre buntar.Och töm rötterna i ett 50 milliliter rör fyllt med flytande kväve, för att snäppa nedfrysning. När alla rotprover per behandling har samlats in, dekantera överskottet flytande kväve med hjälp av röret locket för att förhindra rötterna från att spilla. Och placera röret i en doer fartyg, för en 80 grader celsius lagring.För vävnadslipning och homogenisering, använd bomullshandskar under vanliga labbhandskar, och lägg till PMSF till polysome extraktionsbufferten. Töm vävnadsprovet i en mortel som innehåller flytande kväve, och använd en kyld mortelstöt för att noggrant mala vävnaderna tills allt material visas som ett vitt pulver. När hela vävnaden har slipats, tillsätt fem milliliter polysome extraktionsbuffert till provet, och blanda snabbt de frysta vävnadsfragmenten med pulvret innan bufferten fryser.Så snart blandningen kan överföras, tömma uppslamning i ett glas homogenisator på is, och använda ytterligare två milliliter polysome extraktion buffert för att skölja mortel och mortelstöt. Slipa flytgödseln manuellt tills extraktet är homogent. Häll sedan rårotextraktet i ett 50 milliliter centrifugrör på is och bearbeta nästa prov som visats.För total RNA-samling överför du 200 mikroliter-alikvoter av varje råprov till enskilda rena, färdigkylda, märkta mikrocentrifugrör. För att avlägsna cellväggar, skräp och stora organeller centrifugerna proverna och dekantera supernatanten i färska, förkylda koniska rör för en andra centrifugering. Medan rören snurrar, alikvoter 60 mikroliter av magnetiska GFP pärlor per prov, i en 1,5 milliliter rör.Och placera röret på ett magnetiskt stativ, för att underlätta supernatant borttagning. Sedan tvätta pärlorna två gånger i en milliliter kall tvätt buffert per tvätt, och åter upphäva pärlorna i 60 mikroliter tvättbuffert per prov. Omedelbart efter centrifugeringen, dekantera den rensade supernatanten i märkta 15 milliliterrör, och tillsätt 60 mikroliter av tvättade pärlor till varje prov.Placera sedan alla prover horisontellt i en ishink, för en två timmars inkubation med gungning. Vid slutet av inkubationen, samla pärlorna på ett magnetiskt stativ på is, och lägg TILL PMSF till den återstående polysome extraktionsbufferten. När du har kastat supernatanterna, tillsätt cirka fem milliliter polysome extraktionsbuffert till proverna, och åter upphäva pärlorna i proverna med mild lutning.Vagga proverna i 15 minuter på skakmaskinen på is, följt av två tvättar med färsk tvättbuffert på magneten, som visats. Efter den sista tvätten överför du proverna i en milliliter tvättbuffert, till ett 1,5 milliliterrör. Och samla pärlorna en gång till på magnetstativ, för att ta bort alla supernatant.Placera sedan rören på is tills alla prover har bearbetats. För rekonditionering av labbet leveranser, först skölj all utrustning i det kemiska avfallet. Handtvätta mortlarna, mortelerna och homogenisatorerna med tvål, innan du sköljer varje instrument noggrant.Därefter placerar du utrustningen i en värmesäker behållare och gräddar materialen över natten vid större än 220 grader celsius. Borsta alla centrifugrör rena med rengöringsmedel, innan du placerar rören på en autoklaverbar bricka med en fälg och en draghuva. Häll en milliliter flytande diethyl pyrocarbonat och en liter avjoniserad vattenlösning på rören i tre till 18 timmar.Samla sedan upp lösningen innan du steriliserar facket med rör i autoklaven. Här visas representativa anläggningar med GFP-signaler. Motfärgning med propidiummid markerar cellväggens konturer.Linjerna motsvarar lokaliseringsmönstret för endodermis, och xylem-pol pericycle. I dessa representativa mätningar som erhållits från polysome RNA, de flesta prover visade mycket lite nedbrytning, med RNA integritet nummer från nio till 10. I dessa diagram kan spår av framgångsrikt förberedda bibliotek observeras, vilket belyser robustheten i förfarandet, trots nedskalade reaktionsvolymer.Innan en genomspantningsdatauppsättning produceras kan TRAP-RNA från ett pilotexperiment undersökas av kvantitativa RTPCR för att validera behandlingsframgången och/eller de experimentella förhållandena, samt vävnadseskriheten. I denna analys bekräftade testning av tre auxin-lyhörda gener en lyckad hormoninduktion efter två timmars behandling. Vävnadsspecifika markörgenprofiler som hämtats från sekvenseringsdata bekräftade specificiteten av celltyp.Följ råd om god praxis när du hanterar RNA. Arbeta på en steril bänk, rengör din utrustning med RNA-borttagningslösning, använd handskar och byt omedelbart om dem när de blir kontaminerade. Var noga med att på lämpligt sätt hantera och kassera alla giftiga kemikalier och gaser som har använts under förfarandet, särskilt fenol-DEPC klorgas och flytande kväve.I portföljen av omic studier, TRAP upptar en viktig nisch, och har redan använts för att svara på många biologiska frågor, särskilt i utvecklingsbiologi, trap har en enorm potential.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Geomagnetic Field (Gmf) och växt Evolution: att undersöka effekterna av Gmf Återföring på<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Utveckling och Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analysera<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migration använder Cell Transplantationer och Time-lapse avbildning i Zebrafish embryon

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Att bygga Finita Element Modeller för att undersöka Zebrafish Jaw biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammare för långsiktig konfokalbildning av rot- och hypokotylutveckling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Ljusmedierad reversibel modulering av den mitogenaktiverade proteinkinasvägen under celldifferentiering och<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonisk utveckling

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Fröämnet odling för Live-cell Imaging av zygot polarisering och Embryo mallning i Arabidopsis thaliana.

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av Larval zebrafiskar som ett djur-modell för att undersöka Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...