Name: using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00
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Les auteurs reconnaissent les subventions de la National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 et 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC10050002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01), et Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Préparation de SF-GelMA chargé de cellules
<ol><li>Stériliser tous les matériaux à l’aide d’unités de filtre à seringues de 0,22 μm. Effectuez toutes les étapes d’une armoire de sécurité biologique.</li>
	<li>Chauffer 1x PBS à 50 °C et dissoudre la gélatine dans le PBS chauffé 1x en remuant. La concentration finale de gélatine dans pbs devrait être de 10% (w/v).</li>
	<li>Ajouter lentement l’anhydride méthacrylique dans la solution gélatine (rapport poids de l’anhydride méthacrylique à...

<ol>
	<li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting:+from+benches+to+translational+applications.">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510 (2019).</li><li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization,+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms.">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li><li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs.">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li><li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication.">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+tissues+and+organs.">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li><li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting.">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting.">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li><li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking.">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).</li><li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels.">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li></ol>

La stabilité du système multicouches est un point clé pour effectuer ce protocole avec succès. Nous avons théoriquement calculé la diffusion des molécules SF dans la solution GelMA sur la base de l’étude de Nauman13. Il a été constaté que la diffusion des protéines dans la solution était liée à leur poids moléculaire. Le poids moléculaire moyen (MW) de l’albumine de sérum bovin (BSA) est de 66,5 kDa, et son coefficient de diffusion est de 64-72 μm2/s. Le MW moyen ...

La bioimpression tridimensionnelle (3D) a été une méthode prometteuse pour fabriquer des répliques architecturales et fonctionnelles complexes de tissus indigènes en biofabrication et en médecine régénérative1,2,3. Les stratégies communes de bioimpression, y compris l’impression à jet d’encre, extrusion et stéréolithographie, ont des avantages et des inconvénients de différentes perspectives4. Parmi ces techniques, la procédure d’extrusion est le plus couramment utilisée en raison de son rapport coût-efficacité. Bioink joue un rôle clé dans la stabilité du processus de bioimpression de l’extrusion. Le bioink idéal chargé de cellules doit non seulement être biocompatible, mais aussi être adapté aux propriétés mécaniques5. Les bioinks à faible viscosité sont généralement présentés comme un état liquide. Ces bioinks peuvent être facilement et rapidement déposés et éviter les dommages à la membrane cellulaire induits par un stress de cisaillement élevé pendant l’extrusion. Cependant, dans les cas complexes nécessitant des périodes d’impression à long terme, la faible viscosité donne souvent lieu à la sédimentation inévitable des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, qui est habituellement entraîné par la gravité et conduit à une dispersion inhomogène des cellules dans le bioink6,7. Par conséquent, un bioink avec dispersion inhomogeneous de cellules entrave la bioimpression in vitro d’une construction fonctionnelle de tissu.
Plusieurs études récentes portant sur les bioinks ont rapporté la promotion de la dispersion homogène des cellules encapsulées. Un bioink d’alginate modifié basé sur le crosslinking à deux étages a été utilisé pour la bioimpression d’extrusion8. Un polymère d’alginate a été modifié avec des peptides et des protéines dans cette étude. Les cellules ont présenté une distribution plus homogène dans cet alginate modifié que dans l’alginate couramment utilisé en raison des sites d’attachement fournis par les peptides et les protéines. Alternativement, les bioinks mélangés ont été utilisés pour résoudre la sédimentation des cellules dans le bioink. Un bioink mélangé contenant du polyéthylène glycol (PEG) et de la gélatine ou de la gélatine méthacryloyl (GelMA) avec une robustesse mécanique améliorée a été utilisé dans une autre étude9. Les cellules encapsulées ont présenté une distribution homogène principalement parce que la viscosité du bioink mélangé a été améliorée. En général, il existe plusieurs facteurs influençant la dispersion des cellules encapsulées dans le bioink, tels que la viscosité du bioink, la gravité des cellules, la densité des cellules et la durée de la période de travail. Parmi ces facteurs, la gravité des cellules joue un rôle essentiel dans la promotion de la sédimentation. La flottabilité et la friction fournies par le bioink visqueux ont été étudiées comme les principales forces contre la gravité à ce jour10.
Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie pour promouvoir la dispersion homogène des cellules encapsulées dans le bioink en manipulant plusieurs interfaces liquides dans le réservoir de bioink. Ces interfaces liquides créées par la modification multicouches du bioink peuvent non seulement fournir une rétention interfaciale, ce qui retarde la sédimentation des cellules, mais aussi maintenir une biocompatibilité appropriée et le comportement rhéologique du bioink. Dans la pratique, nous avons modifié la solution aqueuse GelMA (5%, w/v) avec la fibroine de soie (SF) d’une manière multicouches pour produire longitudinalement quatre interfaces, fournissant des tensions interfaciales dans le bioink mélangé. En conséquence, la charge de gravité sur les cellules a été compensée par la tension interfaciale artificielle, et une dispersion presque homogène des cellules encapsulées dans le bioink a été obtenue en raison de moins de sédimentation à travers les couches adjacentes des cellules. Aucun protocole similaire pour ralentir la sédimentation des cellules encapsulées en manipulant la rétention interfaciale dans les bioinks liquides n’a été rapporté à ce jour. Nous présentons notre protocole ici pour démontrer une nouvelle façon de résoudre la sédimentation cellulaire dans la bioimpression.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M64BK-QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900863MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276685MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution

Pendant le processus de bioimpression tridimensionnell à base d’extrusion, les bioinks liquides à faible viscosité peuvent protéger les cellules contre les dommages membranaires induits par le stress de cisaillement et améliorer la survie des cellules encapsulées. Toutefois, la sédimentation cellulaire rapide par gravité dans le réservoir pourrait entraîner une distribution inhomogène des cellules dans les structures bioimprimées et donc entraver l’application de bioinks semblables à des liquides. Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (p. ex., le méthacryloyl gélatineux à faible viscosité) pour prévenir la sédimentation des cellules encapsulées. Plusieurs interfaces liquides ont été manipulées dans le bioink multicouches pour fournir la rétention interfaciale. Par conséquent, l’action de sédimentation cellulaire qui traverse les couches adjacentes du système à plusieurs niveaux a été retardée dans le réservoir de bioink. Il a été constaté que la rétention interfaciale était beaucoup plus élevée que l’attraction sédimentaire des cellules, démontrant un rôle critique de la rétention interfaciale dans la prévention de la sédimentation cellulaire et la promotion d’une dispersion plus homogène des cellules dans le bioink multicouches.

Un schéma de préparation des bioinks chargés de cellules est illustré à la figure 1. Après la préparation des différents bioinks, le chargement, le réchauffage et la bioimpression ont été effectués (figure 2). Pour évaluer la distribution des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, une procédure de bioimpression a été effectuée à l’aide de trois bioinks différents chargés de cellules dans trois plaques de 96 puits (<strong class...

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Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (gélatine méthacryloyl à faible viscosité) pour empêcher la sédimentation des cellules encapsulées.

Utilisation de Bioink Hydrogel multicouches dans la bioimpression tridimensionnelle pour la distribution homogène des cellules

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

En utilisant notre protocole, le multicouche des dilutions bioink liquides favorise non seulement une dispersion homogène des cellules encapsulées, mais maintient également un environnement bioink adapté aux cellules. Nous utilisons la tension interfaciale pour arrêter la sédimentation des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, en évitant la charge de stress de cisaillement élevée pour les cellules lors de l’impression d’extrusion. En utilisant cette technologie, nous pouvons générer des constructions de tissus 3D avec une distribution cellulaire homogène, fournissant un moule fonctionnel de tissu in vitro pour une utilisation dans les études de médecine de dépistage et de régénération des médicaments.Lors de la préparation du bioink, il est important de prêter attention à la température expérimentale et la procédure de chargement hygrogel, car ces facteurs peuvent affecter la qualité de l’encre. Avant de commencer la préparation, utilisez des unités de filtre à seringues de 0,22 micromètre pour stériliser tous les matériaux et dissoudre la gélatine à une concentration finale de 10 % en PBS de 50 degrés Celsius dans un cabinet de sécurité biologique. Ajouter l’anhydride méthacrylique à la solution de gélatine à un rapport de poids de 0,6 à un avec agitation lente pendant au moins une heure à 50 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, transférer la solution mixte dans un tube stérile de 50 millilitres et séparer la solution en couches par centrifugation. Recueillir la couche supérieure de GelMA et diluer la solution recueillie avec deux volumes d’eau déionisée de 40 à 50 degrés Celsius. Dialyz la solution GelMA avec une membrane de dialyse de 12 à 14 kilodaltons de coupure de poids moléculaire contre l’eau déionisée pendant cinq à sept jours à 40 à 50 degrés Celsius, changeant l’eau deux fois par jour.À la fin de la dialyse, congeler la solution GelMA à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Lyophiliser ensuite la solution GelMA pendant trois à cinq jours dans un séchoir à congélation à moins 45 degrés Celsius et 0,2 millibars de pression. Puis dissoudre le GelMA lyophilisé dans PBS complété par 10% sérum bovin fœtal, 25 millimolar HEPES, et 0,5% photoinitiateur.Pour obtenir les bioinks gelma fibroin de soie, mélangez la solution GelMA avec différents volumes de solution initiale de fibroine de soie et différents volumes de PBS comme suggéré dans le tableau. Lorsque tous les bioinks ont été préparés, sonicate la solution pendant 10 à 20 minutes. Pendant que les encres sonifient, recueillez les cellules d’une culture cellulaire NIH/3T3 confluente de 80 % dans un tube conique de 15 millilitres par solution de bioink, et granulez les cellules par centrifugation.Ensuite, aspirez soigneusement les supernatants et resuspendez les cellules dans chaque tube avec deux millilitres de bioink à une fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration de solution de bioink. Pour charger le bioink pour l’impression, ajouter aspirer 400 microlitres de fibrocine de soie chargée de cellules 0,5 GelMA à la couche inférieure d’une seringue de deux millilitres. Placez la seringue dans un bain d’eau glacée de zéro degré Celsius pendant cinq minutes pour transformer le bioink de la couche inférieure en un état de gel avant de charger 400 microlitres de fibroine de soie chargée de cellules 0,75 gelma bioink sur la couche de fibroine de soie 0,5 GelMA.Ensuite, retournez la seringue au bain de glace pendant cinq minutes, en continuant d’ajouter chaque concentration supplémentaire de bioink chargé de cellules à la seringue de la même manière. Lorsqu’un système de bioink multicououche avec différentes concentrations de fibroine de soie dans les différentes couches a été réalisé, réchauffer le bioink dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, chargez une buse d’impression de calibre 27 sur la seringue et réglez la vitesse d’écoulement à 50 microlitres par minute, la vitesse de déplacement de la buse à deux millilitres par seconde et la hauteur de la buse à un millimètre.Ensuite, imprimez le tissu construit d’une manière d’extrusion à l’aide d’un bioimprimeur sur mesure à température ambiante, et reliez la construction de tissu bioimprimé avec 365 nanomètres de lumière ultraviolette pendant 40 secondes à 800 milliwatts. Puis la culture de la construction de tissu inter-lié dans DMEM complété avec 10% sérum bovin foetal et 1% pénicilline-streptomycine dans un incubateur de culture cellulaire, changeant le milieu toutes les huit heures pendant les deux premiers jours et tous les deux à trois jours par la suite. Dans cette analyse représentative, au fur et à mesure que la procédure de bioimpression progressait, la densité des cellules dans les puits cibles diminuait dans tous les groupes.Dans le groupe gelma de fibroine de soie zéro, approximativement 70% des cellules ont été déposées dans la couche inférieure. Dans la fibroine de soie un Groupe gelma, environ 40% des cellules ont été déposées dans la couche inférieure, et environ 5% des cellules ont été déposées dans la couche supérieure. Dans le groupe gelMA multicouche de fibroine de soie, le dépôt des cellules encapsulées était plus homogène que celui des groupes témoin.La partie la plus critique de ce protocole est le chargement des multicouches bioink SF-GelMA. Ce protocole peut être appliqué à d’autres analyses de bioimpression d’extrusion qui utilisent des bioinks liquides.

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