Name: using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00
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लेखक चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81771971, 81970442) से अनुदान स्वीकार करते हैं, 81703470 और 81570422), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFC1005002), शंघाई नगर पालिका के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (17JC1400200), शंघाई नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रमुख परियोजना (अनुदान संख्या 2017SHZDZX01), और शंघाई नगर शिक्षा आयोग (नवाचार कार्यक्रम 2017-01-0 7-00-07-E00027) ।

1. सेल से लदे एसएफ-गेल्मा की तैयारी
<ol><li>0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके सभी सामग्रियों को स्टरलाइज करें। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सभी चरणों को करें।</li>
	<li>गर्म 1x पीबीएस 50 डिग्री सेल्सियस ?...

<ol>
	<li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting:+from+benches+to+translational+applications.">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510 (2019).</li><li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization,+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms.">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li><li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs.">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li><li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication.">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+tissues+and+organs.">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li><li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting.">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting.">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li><li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking.">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).</li><li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels.">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li></ol>

बहुस्तरीय प्रणाली की स्थिरता इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है। हमने सैद्धांतिक रूप से नौमान के अध्ययन13के आधार पर जेल्मा समाधान में एस एफ अणुओं के प्रसार की गणन?...

त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग बायोफैब्रिकेशन और पुनर्योजी,दवा1,2,3में देशी ऊतकों की जटिल वास्तुशिल्प और कार्यात्मक प्रतिकृतियों के निर्माण के लिए एक आशाजनक तरीका रहा है।, इंकजेट, एक्सट्रूशन और स्टीरियोलिथोग्राफी प्रिंटिंग सहित बायोप्रिंटिंग की साझा रणनीतियों में विभिन्न दृष्टिकोणों से पेशेवरों और विपक्ष हैं4। इन तकनीकों में, एक्सट्रूशन प्रक्रिया का उपयोग आमतौर पर इसकी लागत-प्रभावशीलता के कारण किया जाता है। बायोइंक एक्सट्रूशन बायोप्रिंटिंग की प्रक्रिया स्थिरता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आदर्श सेल से लदे बायोइंक न केवल जैव संगत होना चाहिए बल्कि यांत्रिक गुणों के लिए भी उपयुक्त होना चाहिए5। कम चिपचिपाहट वाले बायोइंक आमतौर पर तरल जैसी स्थिति के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। इन बायोइंक को आसानी से और जल्दी से जमा किया जा सकता है और एक्सट्रूशन के दौरान उच्च कतरनी तनाव से प्रेरित सेल झिल्ली क्षति से बचा जा सकता है। हालांकि, दीर्घकालिक मुद्रण अवधि की आवश्यकता वाले जटिल मामलों में, कम चिपचिपाहट अक्सर बायोइंक जलाशय में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के अपरिहार्य तलछट को जन्म देती है, जो आमतौर पर गुरुत्वाकर्षण से प्रेरित होती है और बायोइंक6,,7में एक असंगत कोशिका फैलाव की ओर ले जाती है। नतीजतन, इन्होमोजेनियस सेल फैलाव के साथ एक बायोइंक एक कार्यात्मक ऊतक निर्माण के इन विट्रो बायोप्रिंटिंग में बाधा डालता है।
बायोनिक्स पर ध्यान केंद्रित करने वाले हाल के कई अध्ययनों ने एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के समरूप फैलाव को बढ़ावा देने की सूचना दी है। एक्सट्रूसियन बायोप्रिंटिंग8के लिए ड्यूल-स्टेज क्रॉसलिंकिंग पर आधारित एक संशोधित एल्गिनेट बायोइंक का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में पेप्टाइड्स और प्रोटीन के साथ एक एल्गिनेट पॉलीमर को संशोधित किया गया था। कोशिकाओं ने पेप्टाइड्स और प्रोटीन द्वारा प्रदान की जाने वाली लगाव साइटों के कारण आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एल्गिनेट की तुलना में इस संशोधित एल्गिनेट में अधिक सजातीय वितरण प्रस्तुत किया। वैकल्पिक रूप से, बायोइंक में कोशिकाओं के तलछट को हल करने के लिए मिश्रित बायोइंक का उपयोग किया गया है। एक मिश्रित बायोइंक जिसमें पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और जिलेटिन या जिलेटिन या जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) बेहतर यांत्रिक मजबूती के साथ एक अन्य अध्ययन9में उपयोग किया गया था। समझाया कोशिकाओं ने मुख्य रूप से एक सजातीय वितरण प्रस्तुत किया क्योंकि मिश्रित बायोइंक की चिपचिपाहट में सुधार हुआ था। सामान्य तौर पर, बायोइंक में एनक्लोजर कोशिकाओं की फैलाव को प्रभावित करने वाले कई कारक होते हैं, जैसे बायोइंक की चिपचिपाहट, कोशिकाओं की गंभीरता, कोशिकाओं का घनत्व, और कार्य अवधि की अवधि। इन कारकों में, कोशिकाओं की गंभीरता तलछट को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । चिपचिपा बायोइंक द्वारा प्रदान किए गए उछाल और घर्षण की जांच10तारीख तक गुरुत्वाकर्षण के विरुद्ध मुख्य बलों के रूप में की गई है ।
इसके साथ ही, हमने बायोइंक जलाशय में कई तरल इंटरफेस में हेरफेर करके बायोइंक में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं की सजातीय फैलाव को बढ़ावा देने के लिए एक उपन्यास रणनीति विकसित की। बायोइंक के बहुस्तरीय संशोधन द्वारा बनाए गए ये तरल इंटरफेस न केवल इंटरफेशियल अवधारण प्रदान कर सकते हैं, जो कोशिकाओं के तलछट को मंद करता है, बल्कि बायोइंक के उपयुक्त जैव अनुकूलता और रियोलॉजिकल व्यवहार को भी बनाए रखता है। व्यवहार में, हमने एक बहुस्तरीय तरीके से रेशम फाइब्रोइन (एसएफ) के साथ जलीय जेल्मा समाधान (5%, w/v) को संशोधित किया ताकि मिश्रित बायोइंक में अंतरअनुजातीय तनाव प्रदान किया जा सके। नतीजतन, कोशिकाओं पर गुरुत्वाकर्षण लोड िंग मानव निर्मित अंतर-सन्नादार तनाव द्वारा ऑफसेट की गई थी, और कोशिकाओं की आसन्न परतों में कम तलछट के कारण बायोइंक में एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं का लगभग सजातीय फैलाव प्राप्त किया गया था। तरल बायोइंक में इंटरफेशियल रिटेंशन में हेरफेर करके एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के तलछट को धीमा करने के लिए कोई समान प्रोटोकॉल आज तक सूचित नहीं किया गया है । हम बायोप्रिंटिंग में सेल तलछट को हल करने के लिए एक नया तरीका प्रदर्शित करने के लिए यहां अपना प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M64BK-QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900863MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276685MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution

एक्सट्रूशन-आधारित त्रि-आयामी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान, कम चिपचिपाहट वाले तरल जैसे बायोइंक कोशिकाओं को कतरनी तनाव से प्रेरित झिल्ली क्षति से बचा सकते हैं और एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं। हालांकि, जलाशय में तेजी से गुरुत्वाकर्षण-संचालित कोशिका तलछट बायोप्रिंटेड संरचनाओं में एक असंगत कोशिका वितरण का कारण बन सकता है और इसलिए तरल जैसे बायोइंक के आवेदन में बाधा डालता है। यहां, हमने एन्केसेटेड कोशिकाओं के तलछट को रोकने के लिए तरल-जैसे बायोइंक (जैसे, कम चिपचिपाहट के साथ जिलेटिन मेथाक्रिलोइल) के लिए एक उपन्यास बहुस्तरीय संशोधित रणनीति विकसित की। इंटरफेशियल रिटेंशन प्रदान करने के लिए मल्टीलेयर बायोइंक में कई तरल इंटरफेस में हेरफेर किया गया था। नतीजतन, बहुस्तरीय प्रणाली में आसन्न परतों के पार जा रही कोशिका तलछट कार्रवाई बायोइंक जलाशय में मंद थी। यह पाया गया कि इंटरफेशियल रिटेंशन कोशिकाओं के तलछट पुल की तुलना में बहुत अधिक था, जो कोशिका तलछट को रोकने और बहुस्तरीय बायोइंक में कोशिकाओं के अधिक सजातीय फैलाव को बढ़ावा देने में अंतर-मांशियल प्रतिधारण की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन करता है।

सेल से लदे बायोइंस की तैयारी की एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिखाया गया है । विभिन्न बायोइंक तैयार करने के बाद, लोडिंग, रीहीटिंग और बायोप्रिंटिंग(चित्रा 2)किया गया। बायोइंक जलाशय में ?...

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Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

यहां, हमने समझाया कोशिकाओं के तलछट को रोकने के लिए तरल की तरह बायोइंक (कम चिपचिपाहट के साथ जिलेटिन मेथाक्रिलोइल) के लिए एक उपन्यास बहुस्तरीय संशोधित रणनीति विकसित की।

सजातीय सेल वितरण के लिए त्रि-आयामी बायोप्रिंटिंग में बहुस्तरीय हाइड्रोजेल बायोइंक का उपयोग करना

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके, तरल जैसे बायोइंक कमजोर पड़ने की बहुस्तरीयता न केवल एनक्लोपेज कोशिकाओं की सजातीय फैलाव को बढ़ावा देती है बल्कि एक सेल-उपयुक्त बायोइंक वातावरण भी बनाए रखती है। हम एक्सट्रूशन प्रिंटिंग के दौरान कोशिकाओं को उच्च कतरनी तनाव लोड से बचने, बायोइंक जलाशय के भीतर एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं के तलछट को रोकने के लिए अंतरफेशियल तनाव का उपयोग करते हैं। इस तकनीक का उपयोग करके, हम एक सजातीय सेल वितरण के साथ 3 डी ऊतक निर्माण उत्पन्न कर सकते हैं, जो दवा स्क्रीनिंग और पुनर्जनन दवा अध्ययन में उपयोग के लिए एक कार्यात्मक इन विट्रो ऊतक मोल्ड प्रदान करता है।बायोइंक तैयार करते समय, प्रयोगात्मक तापमान और हाइग्रोगेल लोडिंग प्रक्रिया पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ये कारक स्याही की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। तैयारी शुरू करने से पहले, सभी सामग्रियों को स्टरलाइज करने के लिए 0.22-माइक्रोमीटर सिरिंज फिल्टर इकाइयों का उपयोग करें, और जैविक सुरक्षा कैबिनेट में 50-डिग्री-सेल्सियस पीबीएस में 10% अंतिम एकाग्रता में जिलेटिन को भंग करें। 50 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक घंटे के लिए धीमी गति से सरगर्मी के साथ एक 0.6 से एक वजन अनुपात पर जिलेटिन समाधान के लिए मेथाक्रिलिक एंहाइड्राइड जोड़ें।इनक्यूबेशन के अंत में, मिश्रित समाधान को बाँझ 50-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और समाधान को अपकेंद्रित्र द्वारा परतों में अलग करें। ऊपरी GelMA परत ले लीजिए, और 40 से 50 डिग्री-सेल्सियस deionized पानी की दो मात्रा के साथ एकत्र समाधान को पतला करें। 40 से 50 डिग्री सेल्सियस पर पांच से सात दिनों के लिए डिओनाइज्ड पानी के खिलाफ 12 से 14 किलोडडलटन आणविक वजन कटऑफ डायलिसिस झिल्ली के साथ गेल्मा समाधान को डायलाइज करें, पानी को रोजाना दो बार बदलें।डायलिसिस के अंत में, रात भर शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर GelMA समाधान फ्रीज करें। अगले तीन से पांच दिनों के लिए जेल्मा समाधान शून्य से 45 डिग्री सेल्सियस और दबाव के 0.2 मिलीबार पर एक फ्रीज ड्रायर में lyophilize। फिर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 25 मिलीमोलर एचईपीई, और 0.5% फोटोनिइटिएटर के साथ पूरक पीबीएस में लियोफिलाइज्ड गेल्मा को भंग करें।सिल्क फाइब्रोइन गेल्मा बायोइंक्स प्राप्त करने के लिए, जेल्मा समाधान को प्रारंभिक रेशम फाइब्रोइन समाधान के विभिन्न संस्करणों और तालिका में सुझाए गए पीबीएस के विभिन्न संस्करणों के साथ मिलाएं। जब सभी बायोनिक्स तैयार हो चुके हैं, तो 10 से 20 मिनट के लिए समाधान को सोनिकेट करें। जबकि स्याही sonicating हैं, एक ८०% ढुलमुल NIH/3T3 सेल संस्कृति से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब प्रति बायोइंक समाधान में कोशिकाओं को इकट्ठा, और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं गोली ।फिर सुपरनेटैंट को ध्यान से एस्पिरेट करें और प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं को एक बार 10 बार बायोइंक समाधान एकाग्रता के प्रति मिलीलीटर छह कोशिकाओं के साथ बायोइंक के दो मिलीलीटर के साथ फिर से खर्च करें। मुद्रण के लिए बायोइंक लोड करने के लिए, सेल से लदे रेशम फाइब्रोइन 0.5 गेल्मा के 400 माइक्रोलीटर को दो मिलीलीटर सिरिंज की निचली परत में जोड़ें। सिरिंज को शून्य डिग्री-सेल्सियस बर्फ के पानी के स्नान में पांच मिनट के लिए रखें ताकि रेशम फाइब्रोइन 0.5 जेल्मा की परत पर सेल से लदे रेशम फाइब्रोइन 0.75 जेल्मा बायोइंक के 400 माइक्रोलीटर लोड करने से पहले नीचे की परत बायोइंक को जेल राज्य में बदल दिया जा सके।फिर सिरिंज को पांच मिनट के लिए आइस बाथ में वापस करें, उसी तरीके से सिरिंज में सेल से लदे बायोइंक की प्रत्येक अतिरिक्त एकाग्रता को जोड़ना जारी रखें। जब विभिन्न परतों के भीतर रेशम फाइब्रोइन की विभिन्न सांद्रता के साथ एक बहुस्तरीय बायोइंक प्रणाली हासिल की गई है, तो बायोइंक को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में फिर से गरम करें। इनक्यूबेशन के अंत में, सिरिंज पर 27 गेज प्रिंटिंग नोजल लोड करें, और प्रति मिनट 50 माइक्रोलीटर तक प्रवाह की गति निर्धारित करें, नोजल की गति को दो मिलीलीटर प्रति सेकंड तक, और नोजल की ऊंचाई एक मिलीमीटर तक।अगला प्रिंट ऊतक कमरे के तापमान पर कस्टम-निर्मित बायोप्रिंटर का उपयोग करके एक एक्सट्रूज़न तरीके से निर्माण करता है, और 800 मिलीवाट पर 40 सेकंड के लिए पराबैंगनी प्रकाश के 365 नैनोमीटर के साथ बायोप्रिंटेड ऊतक का निर्माण को क्रॉस-लिंक करता है। फिर संस्कृति डीएमईएम में क्रॉस-लिंक्ड ऊतक निर्माण 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक होता है, पहले दो दिनों के दौरान और उसके बाद हर दो से तीन दिनों में माध्यम बदलता है। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, जैसे-जैसे बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया आगे बढ़ी, सभी समूहों में लक्षित कुओं में कोशिकाओं का घनत्व कम हो गया।सिल्क फाइब्रोइन जीरो जेल्मा ग्रुप में लगभग 70% कोशिकाएं बॉटम लेयर में जमा थीं। रेशम फाइब्रोइन एक गेल्मा समूह में, लगभग 40% कोशिकाएं निचली परत में जमा की गई थीं, और लगभग 5% कोशिकाएं शीर्ष परत में जमा की गई थीं। रेशम फाइब्रोइन मल्टीलेयर गेल्मा समूह में, एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं का जमाव नियंत्रण समूहों की तुलना में अधिक समरूप था।इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा एसएफ-जेल्मा बायोइंक मल्टीलेयर की लोडिंग है। यह प्रोटोकॉल अन्य एक्सट्रूशन बायोप्रिंटिंग विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है जो तरल जैसे बायोिंक का उपयोग करते हैं।

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