Name: using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 og 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai kommunale vitenskap og teknologi store prosjekt (Grant nr. 2017SHZDZX01), og Shanghai kommunale utdanningskommisjon (Innovasjonsprogram 2017-01-07 -00-07-E00027).

1. Utarbeidelse av celle-laden SF-GelMA
<ol><li>Steriliser alle materialene ved hjelp av 0,22 μm sprøytefilterenheter. Utfør alle trinnene i et biologisk sikkerhetsskap.</li>
	<li>Varm 1x PBS til 50 °C, og oppløs gelatin i den oppvarmede 1x PBS med omrøring. Den endelige konsentrasjonen av gelatin i PBS bør være 10 % (m/v).</li>
	<li>Tilsett metakrylmatanhydrid i gelatinoppløsningen (vektforholdet mellom metakrylmaganhydrid til gelatin på 0,6 til 1) langsomt med omrøring, og bland komplekset i minst 1 timer ...

<ol>
	<li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting:+from+benches+to+translational+applications.">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510 (2019).</li><li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization,+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms.">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li><li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs.">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li><li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication.">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+tissues+and+organs.">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li><li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting.">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting.">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li><li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking.">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).</li><li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels.">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li></ol>

Stabiliteten til flerlagssystemet er et nøkkelpunkt for å utføre denne protokollen med hell. Vi beregnet teoretisk diffusjon av SF-molekyler i GelMA-løsningen basert på Naumans studie13. Det ble funnet at spredningen av proteiner i løsningen var relatert til deres molekylvekt. Gjennomsnittlig molekylvekt (MW) av storfe serum albumin (BSA) er 66,5 kDa, og dens diffusjonskoeffisient er 64-72 μm2/ s. Gjennomsnittlig MW fibrinogen er 339,7 kDa, og diffusjonskoeffisienten er 23-34 μm...

Tredimensjonal (3D) bioprinting har vært en lovende metode for å produsere komplekse arkitektoniske og funksjonelle kopier av innfødte vev i biofabrikasjon og regenerativ medisin1,,2,3. De vanlige strategiene for bioprinting, inkludert inkjet, ekstrudering og stereolitografiutskrift, har fordeler og ulemper fra ulike perspektiver4. Blant disse teknikkene brukes ekstruderingsprosedyren oftest på grunn av kostnadseffektiviteten. Bioink spiller en nøkkelrolle i prosessen stabilitet av ekstrudering bioprinting. Den ideelle celle-laden bioink bør ikke bare være biokompatibel, men også være egnet for mekaniske egenskaper5. Bioinks med lav viskositet er vanligvis presentert som en flytende-lignende tilstand. Disse bioinks kan enkelt og raskt deponeres og unngå cellemembranskader forårsaket av høy skjærstress under ekstrudering. Men i komplekse tilfeller som krever langsiktige utskriftsperioder, gir lav viskositet ofte opphav til den uunngåelige sedimenteringen av de innkapslede cellene i bioinkreservoaret, som vanligvis drives av tyngdekraften og fører til en uforstyrret cellespredning i bioink6,7. Følgelig hindrer en bioink med inhomogen celledispergering in vitro bioprinting av en funksjonell vevskonstruksjon.
Flere nyere studier med fokus på bioinks har rapportert fremme av homogen dispersitet av innkapslede celler. En modifisert alginat bioink basert på dual-stage krysskobling ble brukt for ekstrudering bioprinting8. En alginatpolymer ble modifisert med peptider og proteiner i denne studien. Celler presenterte en mer homogen fordeling i denne modifiserte alginat enn i den vanlige alginat på grunn av festestedene som tilbys av peptidene og proteinene. Alternativt har blandede bioinks blitt brukt for å løse sedimentering av celler i bioink. En blandet bioink som inneholder polyetylenglykol (PEG) og gelatin eller gelatin metakryloyl (GelMA) med forbedret mekanisk robusthet ble brukt i en annen studie9. De innkapslede cellene presenterte en homogen fordeling hovedsakelig fordi viskositeten til den blandede bioinken ble forbedret. Generelt er det flere faktorer som påvirker dispergering av innkapslede celler i bioink, for eksempel viskositeten til bioink, tyngdekraften av cellene, tettheten av cellene, og varigheten av arbeidsperioden. Blant disse faktorene spiller tyngdekraften av celler en kritisk rolle i å fremme sedimentering. Oppdrift og friksjon gitt av viskøse bioink har blitt undersøkt som de viktigste kreftene mot tyngdekraften til dags dato10.
Her utviklet vi en ny strategi for å fremme homogen spredning av de innkapslede cellene i bioink ved å manipulere flere flytende grensesnitt i bioinkreservoaret. Disse flytende grensesnittene som er opprettet av flerlagsmodifisering av bioink, kan ikke bare gi interfacial oppbevaring, som forsinker sedimenteringen av celler, men opprettholder også en passende biokompatibilitet og reologisk oppførsel av bioink. I praksis endret vi vandig GelMA-løsning (5%, w/v) med silkefibroin (SF) på en flerlags måte for å langsgående produsere fire grensesnitt, noe som gir interfacial spenninger i blandet bioink. Som et resultat ble tyngdekraften som lastet på cellene motvirket av den menneskeskapte interfaciale spenningen, og en nesten homogen spredning av de innkapslede cellene i bioink ble oppnådd på grunn av mindre sedimentering over de tilstøtende lagene av celler. Ingen lignende protokoll for å bremse sedimenteringen av innkapslede celler ved å manipulere interfacial oppbevaring i flytende bioinks har blitt rapportert til dags dato. Vi presenterer vår protokoll her for å demonstrere en ny måte å løse cellesedimentering på bioprinting.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M64BK-QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900863MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276685MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution

Under ekstruderingsbasert tredimensjonal bioprintingprosess kan væskelignende bioinks med lav viskositet beskytte celler mot membranskader forårsaket av skjærstress og forbedre overlevelsen av de innkapslede cellene. Imidlertid kan rask gravitasjonsdrevet cellesedimentering i reservoaret føre til en inhomogen cellefordeling i biotrykte strukturer og dermed hindre bruk av væskelignende bioinks. Her utviklet vi en ny flerlags modifisert strategi for væskelignende bioinks (f.eks gelatin methacryloyl med lav viskositet) for å forhindre sedimentering av innkapslede celler. Flere flytende grensesnitt ble manipulert i flerlags bioink for å gi interfacial oppbevaring. Følgelig ble cellesedimenteringshandlingen som gikk over tilstøtende lag i flerlagssystemet, tilbakestående i bioinkreservoaret. Det ble funnet at interfacial oppbevaring var mye høyere enn sedimental trekk av celler, viser en kritisk rolle av interfacial oppbevaring i å hindre celle sedimentering og fremme en mer homogen spredning av celler i flerlags bioink.

En skjematisk for utarbeidelse av celle-laden bioinks er vist i figur 1. Etter utarbeidelse av de forskjellige bioinks, lasting, oppvarming og bioprinting ble utført (Figur 2). For å evaluere fordelingen av de innkapslede cellene i bioinkreservoaret, ble det utført en biotrykkingsprosedyre ved hjelp av tre forskjellige cellebelastede bioinks i tre 96-brønnplater (figur 3A). To kontrollgrupper (uberørte GelMA og SF-1-GelMA bioin...

Watch this Scientific Journal Video about Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution at JoVE.com

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Her utviklet vi en ny flerlags modifisert strategi for væskelignende bioinks (gelatin metakryloyl med lav viskositet) for å forhindre sedimentering av innkapslede celler.

Bruke flerlags hydrogel bioink i tredimensjonal biotrykking for homogen cellefordeling

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Ved hjelp av vår protokoll fremmer flerlagsingen av de væskelignende bioinkfortynene ikke bare en homogen dispersitet av innkapslede celler, men opprettholder også et cellespes egnet bioinkmiljø. Vi bruker den interfaciale spenningen til å stoppe sedimenteringen av de innkapslede cellene i bioinkreservoaret, og unngår den høye skjærstressbelastningen til cellene under ekstruderingsutskrift. Ved hjelp av denne teknologien kan vi generere 3D-vevskonstruksjoner med en homogen cellefordeling, noe som gir en funksjonell in vitro vevsform for bruk i legemiddelscreening og regenereringsmedisinstudier.Når du forbereder bioink, er det viktig å ta hensyn til eksperimentell temperatur og hygrogel lasting prosedyre, da disse faktorene kan påvirke kvaliteten på blekket. Før du begynner preparatet, bruk 0,22-mikrometer sprøyte filterenheter for å sterilisere alle materialene, og oppløse gelatin til en 10% endelig konsentrasjon i 50 grader Celsius PBS i et biologisk sikkerhetsskap. Tilsett methakrylanhydrid til gelatinoppløsningen med et vektforhold på 0,6 til én med langsom omrøring i minst en time ved 50 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, overfør den blandede løsningen til et sterilt 50-milliliter rør, og skill løsningen i lag ved sentrifugering. Samle det øvre GelMA-laget, og fortynne den oppsamlede løsningen med to volumer på 40 til 50 grader Celsius deionisert vann. Dialyze GelMA-løsningen med en 12 til 14 kilodalton molekylær vekt cutoff dialysemembran mot avionisert vann i fem til syv dager ved 40 til 50 grader Celsius, endre vannet to ganger daglig.På slutten av dialysen, frys GelMA-løsningen ved minus 80 grader Celsius over natten. Deretter lyofiliserer GelMA-løsningen i tre til fem dager i en frysetørker ved minus 45 grader Celsius og 0,2 millibar trykk. Oppløs deretter den lyofiliserte GelMA i PBS supplert med 10% fosterbovinserum, 25 millimolar HEPES og 0,5% fotoinitiator.For å oppnå silkefibroin GelMA bioinks, bland GelMA-løsningen med forskjellige volumer av innledende silkefibroinløsning og forskjellige volumer av PBS som foreslått i tabellen. Når alle bioinks er forberedt, sonicate løsningen i 10 til 20 minutter. Mens blekket sonikerer, samler cellene fra en 80% samløpet NIH/ 3T3 cellekultur i en 15-milliliter konisk rør per bioinkløsning, og pellet cellene ved sentrifugering.Deretter forsiktig aspirere supernativa og gjenbruke cellene i hvert rør med to milliliter bioink på en gang 10 til de seks cellene per milliliter bioink løsning konsentrasjon. For å laste bioink for utskrift, tilsett aspirere 400 mikroliter celle-laden silke fibroin 0,5 GelMA til det nederste laget av en to-milliliter sprøyte. Plasser sprøyten i et nullgrads-Celsius isvannbad i fem minutter for å forvandle bunnlaget bioink til en geltilstand før du laster 400 mikroliter med cellebelastede silkefibroin 0,75 GelMA bioink over laget av silkefibroin 0,5 GelMA.Deretter returnerer du sprøyten til isbadet i fem minutter, og fortsetter å legge til hver ekstra konsentrasjon av cellebelastet bioink til sprøyten på samme måte. Når et flerlags bioinksystem med forskjellige konsentrasjoner av silkefibroin i de forskjellige lagene er oppnådd, varmes bioinken opp i en 37-graders Celsius inkubator i 30 minutter. På slutten av inkubasjonen legger du en 27-gauge utskriftsdyse på sprøyten, og setter strømningshastigheten til 50 mikroliter per minutt, dysens bevegelige hastighet til to milliliter per sekund, og høyden på dysen til en millimeter.Deretter skriver vevet konstruere på en ekstrudering måte ved hjelp av en skreddersydd bioprinter ved romtemperatur, og kryss-link bioprinted vev konstruere med 365 nanometer ultrafiolett lys i 40 sekunder ved 800 milliwatt. Deretter kultur kryssbundet vev konstruere i DMEM supplert med 10% fosterbovin serum og 1% penicillin-streptomycin i en celle kultur inkubator, endre mediet hver åttende time i løpet av de to første dagene og hver to til tre dager deretter. I denne representative analysen, etter hvert som bioutskriftsprosedyren utviklet seg, gikk tettheten av celler i målbrønnene ned i alle gruppene.I silkefibroin null GelMA-gruppen ble ca. 70% av cellene deponert i det nederste laget. I silkefibroin en GelMA gruppe, ca 40% av cellene ble deponert i det nederste laget, og ca 5% av cellene ble deponert i det øverste laget. I silkefibroin flerlags GelMA-gruppen var avsetningen av innkapslede celler mer homogen enn for kontrollgruppene.Den mest kritiske delen av denne protokollen er lasting av SF-GelMA bioink multilag. Denne protokollen kan brukes på andre ekstrudering bioprinting analyse som bruker væske-lignende bioinks.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjelp av en Tissue-spesifikke hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Storskala, automatisert produksjon av fettavledede stamcellesfæroider for 3D-bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Fremstilling og karakterisering av grafenbasert 3D biohybrid hydrogelbioblekk for perifer nevroteknologi

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D bioprinting fototunable hydrogeler for å studere fibroblastaktivering

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Scalable Generation of Uniform Cell Spheroids Using a 3D Acoustic Assembly Device

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Development of a Scaffold-Free Acoustic Assembly Method for High-Quality 3D Cell Spheroid Culture (Video) | JoVE

Tredimensjonal akustisk monteringsanordning for masseproduksjon av cellesfæroider

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

IDG-SW3 cellekultur i en tredimensjonal ekstracellulær matrise

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...