Name: using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00
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Os autores reconhecem bolsas da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81771971, 81970442, 81703470 e 81570422), Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1005002), Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (17JC1400200), Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Municipal de Xangai (Grant No. 2017SHZDZX01) e Comissão Municipal de Educação de Xangai (Programa de Inovação 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Preparação do SF-GelMA carregado de células
<ol><li>Esterilize todos os materiais utilizando unidades de filtro de seringa de 0,22 μm. Realize todas as etapas em um armário de segurança biológica.</li>
	<li>Aqueça 1x PBS a 50 °C, e dissolva a gelatina no 1x PBS aquecido com agitação. A concentração final de gelatina na PBS deve ser de 10% (w/v).</li>
	<li>Adicione o anidrido de metáclico na solução de gelatina (razão de peso do anidrido de acrílico à gelatina de 0,6 a 1) lentamente com agitação,...

<ol>
	<li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting:+from+benches+to+translational+applications.">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510 (2019).</li><li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization,+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms.">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li><li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs.">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li><li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication.">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+tissues+and+organs.">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li><li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting.">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting.">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li><li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking.">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).</li><li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels.">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li></ol>

A estabilidade do sistema multicamadas é um ponto-chave para executar este protocolo com sucesso. Teoricamente calculamos a difusão de moléculas de SF na solução GelMA baseada no estudo de Nauman13. Verificou-se que a difusão de proteínas em solução estava relacionada ao seu peso molecular. O peso molecular médio (MW) da albumina de soro bovino (BSA) é de 66,5 kDa, e seu coeficiente de difusão é de 64-72 μm2/s. O MW médio de fibrinogênio é de 339,7 kDa, e seu coeficient...

A bioimpressão tridimensional (3D) tem sido um método promissor para a fabricação de réplicas arquitetônicas e funcionais complexas de tecidos nativos em biofabbricação e medicina regenerativa1,,2,3. As estratégias comuns de bioimpressão, incluindo jato de tinta, extrusão e impressão estereotipada, têm prós e contras de diferentes perspectivas4. Entre essas técnicas, o procedimento de extrusão é mais comumente utilizado devido ao seu custo-efetividade. A Bioink desempenha um papel fundamental na estabilidade do processo da bioimpressão de extrusão. O bioink ideal carregado de células não deve ser apenas biocompatível, mas também ser adequado para propriedades mecânicas5. Bioinks com baixa viscosidade são tipicamente apresentados como um estado líquido. Essas bioinks podem ser facilmente e rapidamente depositadas e evitar danos na membrana celular induzidos pelo alto estresse da tesoura durante a extrusão. No entanto, em casos complexos que requerem períodos de impressão de longo prazo, a baixa viscosidade muitas vezes dá origem à inevitável sedimentação das células encapsuladas no reservatório bioink, que geralmente é impulsionado pela gravidade e leva a uma dispersão celular inhomogênea no bioink6,7. Consequentemente, um bioink com dispersão celular inhomogênea dificulta a bioimpressão in vitro de uma construção de tecido funcional.
Vários estudos recentes com foco em bioinks relataram a promoção da dispersão homogênea das células encapsuladas. Um bioink alginato modificado baseado em crosslinking de dois estágios foi usado para a bioimpressão de extrusão8. Um polímero alginato foi modificado com peptídeos e proteínas neste estudo. As células apresentaram uma distribuição mais homogênea neste alginato modificado do que no alginato comumente utilizado devido aos locais de fixação fornecidos pelos peptídeos e proteínas. Alternativamente, bioinks misturados têm sido utilizados para resolver a sedimentação de células em bioink. Um bioink misturado contendo polietileno glicol (PEG) e gelatina ou gelatina methacryloyl (GelMA) com robustez mecânica melhorada foi utilizado em outro estudo9. As células encapsuladas apresentaram uma distribuição homogênea principalmente porque a viscosidade do bioink misturado foi melhorada. Em geral, há vários fatores que influenciam a dispersão das células encapsuladas no bioink, como a viscosidade do bioink, a gravidade das células, a densidade das células e a duração do período de trabalho. Entre esses fatores, a gravidade das células desempenha um papel fundamental na promoção da sedimentação. A flutuação e o atrito fornecidos pelo bioink viscoso foram investigados como as principais forças contra a gravidade até o momento10.
Nesse meio tempo, desenvolvemos uma nova estratégia para promover a dispersão homogênea das células encapsuladas em bioink manipulando múltiplas interfaces líquidas no reservatório de bioink. Essas interfaces líquidas criadas pela modificação multicamadas do bioink podem não apenas fornecer retenção interfacial, que retarda a sedimentação das células, mas também manter uma biocompatibilidade adequada e comportamento reológico do bioink. Na prática, modificamos a solução aquosa gelma (5%, w/v) com fibroine de seda (SF) de forma multicamadas para produzir longitudinalmente quatro interfaces, proporcionando tensões interfaciais no bioink misturado. Como resultado, o carregamento de gravidade nas células foi compensado pela tensão interfacial feita pelo homem, e uma dispersão quase homogênea das células encapsuladas no bioink foi obtida devido à menor sedimentação através das camadas adjacentes das células. Nenhum protocolo semelhante para retardar a sedimentação de células encapsuladas manipulando a retenção interfacial em bioinks líquidos foi relatado até o momento. Apresentamos nosso protocolo aqui para demonstrar uma nova maneira de resolver a sedimentação celular na bioimpressão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M64BK-QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900863MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276685MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution

Durante o processo de bioimpressão tridimensional baseado em extrusão, bioinks semelhantes a líquidos com baixa viscosidade podem proteger as células contra danos na membrana induzidos pelo estresse da tesoura e melhorar a sobrevivência das células encapsuladas. No entanto, a rápida sedimentação celular movida pela gravidade no reservatório poderia levar a uma distribuição celular inhomogênea em estruturas bioimpressoras e, portanto, dificultar a aplicação de bioinks semelhantes a líquidos. Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (por exemplo, methacryloyl de gelatina com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas. Várias interfaces líquidas foram manipuladas no bioink multicamadas para fornecer retenção interfacial. Consequentemente, a ação de sedimentação celular que atravessa camadas adjacentes no sistema multicamadas foi retardada no reservatório de bioink. Verificou-se que a retenção interfacial era muito maior do que a atração sedimental das células, demonstrando um papel crítico da retenção interfacial na prevenção da sedimentação celular e promovendo uma dispersão mais homogênea das células no bioink multicamadas.

Um esquema da preparação de bioinks carregados de células é mostrado na Figura 1. Após a preparação dos diferentes bioinks, foram realizados carregamentos, reaquecimentos e bioimpressões(Figura 2). Para avaliar a distribuição das células encapsuladas no reservatório bioink, foi realizado um procedimento de bioimpressão utilizando três bioinks carregados de células diferentes em três placas de 96 poços(Figura 3A). Do...

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Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (gelatina methacryloyl com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas.

Usando bioink de hidrogel multicamadas em bioimpressão tridimensional para distribuição celular homogênea

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Usando nosso protocolo, a multicamadas das diluições de bioink semelhantes a líquidos não só promove uma dispersão homogênea das células encapsuladas, mas também mantém um ambiente de bioink adequado para células. Utilizamos a tensão interfacial para impedir a sedimentação das células encapsuladas dentro do reservatório de bioink, evitando a alta carga de estresse de tesoura para as células durante a impressão de extrusão. Usando essa tecnologia, podemos gerar construções de tecido 3D com uma distribuição celular homogênea, fornecendo um molde de tecido in vitro funcional para uso em estudos de triagem de medicamentos e medicina de regeneração.Ao preparar o bioink, é importante prestar atenção à temperatura experimental e ao procedimento de carregamento de higrâne, pois esses fatores podem afetar a qualidade da tinta. Antes de iniciar a preparação, utilize unidades de filtro de seringa de 0,22 micrômetros para esterilizar todos os materiais e dissolver a gelatina para uma concentração final de 10% em PBS de 50 graus Celsius em um armário de segurança biológica. Adicione o anidrido de metacrílico à solução de gelatina a uma relação de peso de 0,6 a um com agitação lenta por pelo menos uma hora a 50 graus Celsius.No final da incubação, transfira a solução mista para um tubo estéril de 50 mililitros e separe a solução em camadas por centrifugação. Colete a camada superior de GelMA e dilua a solução coletada com dois volumes de água deionizada de 40 a 50 graus Celsius. Diálise a solução GelMA com uma membrana de corte de peso molecular de 12 a 14 quilodalton contra água desionizada por cinco a sete dias a 40 a 50 graus Celsius, mudando a água duas vezes por dia.No final da diálise, congele a solução GelMA a menos 80 graus Celsius durante a noite. Em seguida, lyophilize a solução GelMA por três a cinco dias em uma secadora congelante a menos 45 graus Celsius e 0,2 milibais de pressão. Em seguida, dissolva o GelMA liofilizado em PBS complementado com soro bovino 10%, 25 milimólares HEPES e 0,5% fotoinitidor.Para obter os bioinks gelma de fibroina de seda, misture a solução GelMA com diferentes volumes de solução inicial de fibroine de seda e diferentes volumes de PBS como sugerido na tabela. Quando todos os bioinks tiverem sido preparados, sonicar a solução por 10 a 20 minutos. Enquanto as tintas estão sonicando, colete as células de uma cultura celular NIH/3T3 80% confluente em um tubo cônico de 15 mililitros por solução de bioink, e pelota as células por centrifugação.Em seguida, aspire cuidadosamente os supernacantes e resuspenque as células em cada tubo com dois mililitros de bioink em uma vez 10 para as seis células por mililitro de concentração de solução bioink. Para carregar o bioink para impressão, adicione 400 microliters aspirados de fibroin de seda carregado de células 0,5 GelMA à camada inferior de uma seringa de dois mililitros. Coloque a seringa em um banho de água gelada de zero graus Celsius por cinco minutos para transformar o bioink de camada inferior em um estado de gel antes de carregar 400 microliters de fibroine de seda carregada de células 0,75 GelMA bioink sobre a camada de fibroine de seda 0,5 GelMA.Em seguida, devolva a seringa ao banho de gelo por cinco minutos, continuando a adicionar cada concentração adicional de bioink carregado de células à seringa da mesma maneira. Quando um sistema de bioink multicamadas com diferentes concentrações de fibroin de seda dentro das diferentes camadas foi alcançado, reaqueça o bioink em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. No final da incubação, carregue um bocal de impressão de 27 bitolas na seringa e ajuste a velocidade de fluxo para 50 microliters por minuto, a velocidade móvel do bocal para dois mililitros por segundo, e a altura do bocal para um milímetro.Em seguida, imprima a construção do tecido de forma extrusiva usando uma bioimpressora personalizada à temperatura ambiente, e cruze a construção de tecido bioimpresso com 365 nanômetros de luz ultravioleta por 40 segundos a 800 miliwatts. Em seguida, cultura a construção de tecido transversal no DMEM complementado com soro bovino 10% fetal e 1%penicilina-estreptomicina em uma incubadora de cultura celular, mudando o meio a cada oito horas durante os dois primeiros dias e a cada dois ou três dias depois. Nesta análise representativa, à medida que o procedimento de bioimpressão progrediu, a densidade de células nos poços alvos diminuiu em todos os grupos.No grupo de fibroina de seda zero GelMA, aproximadamente 70% das células foram depositadas na camada inferior. Na fibroina de seda um grupo De GelMA, aproximadamente 40% das células foram depositadas na camada inferior, e aproximadamente 5% das células foram depositadas na camada superior. No grupo gelma multicamada de fibroina de seda, a deposição de células encapsuladas foi mais homogênea do que a dos grupos de controle.A parte mais crítica deste protocolo é o carregamento das multicamadas de bioink SF-GelMA. Este protocolo pode ser aplicado a outras análises de bioimpressão de extrusão que usam bioinks semelhantes a líquidos.

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