Name: using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution at JoVE.com

Авторы признают гранты Национального фонда естественных наук Китая (81771971, 81970442, 81703470 и 81570422), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2018YFC1005002), Комиссия по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (17JC1400200), Шанхайский муниципальный научно-технический крупный проект (Грант No 2017H'S'X01), и Шанхайская комиссия по муниципальному образованию (Инновационная программа 2017-01-07) -00-07-E00027).

1. Подготовка клеточного нагруженных SF-GelMA
<ol><li>Стериллизовать все материалы с помощью 0,22 м шприц фильтр единиц. Выполните все шаги в кабинете биологической безопасности.</li>
	<li>Теплый 1x PBS до 50 градусов по Цельсию, и растворить желатин в нагретом 1x PBS с перемешиванием. Окончательная конце...

<ol>
	<li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting:+from+benches+to+translational+applications.">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510 (2019).</li><li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization,+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms.">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li><li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs.">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li><li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication.">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+tissues+and+organs.">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li><li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting.">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting.">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li><li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking.">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).</li><li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels.">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li></ol>

Стабильность многослойной системы является ключевым моментом для успешного выполнения этого протокола. Теоретически мы рассчитали диффузию молекул SF в решении GelMA на основе исследования Наумана13. Выяснилось, что диффузия белков в растворе связана с их молекулярным весом...

Трехмерная (3D) биопечать была перспективным методом для производства сложных архитектурных и функциональных копий местных тканей в биофабрике и регенеративной медицине1,2,3. Общие стратегии биопечати, в том числе струйной, экструзии и стереолитографии печати, имеют плюсы и минусы с разных точек зрения4. Среди этих методов, экструзионная процедура наиболее часто используется из-за его рентабельности. Биоинк играет ключевую роль в процессе стабильности экструзионной биопечати. Идеальный клеточный биоинков должен быть не только биосовместимым, но и подходит для механических свойств5. Биоинки с низкой вязкостью обычно представлены как жидкое состояние. Эти биоinks могут быть легко и быстро хранение и избежать повреждения клеточной мембраны, вызванной высоким стрессом сдвига во время экструзии. Однако, в сложных случаях, требующих длительных периодов печати, низкая вязкость часто приводит к неизбежной осадки инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре, который обычно приводит к гравитации и приводит к дисперсии inhomogeneous клеток в биоинке6,7. Следовательно, биоинк с дисперсиями inhomogeneous клетки препятствует биопечати в пробирке функциональной конструкции ткани.
Несколько недавних исследований, посвященных биоинксам, сообщили о продвижении однородной дисперсии инкапсулированных клеток. Модифицированный биоинкт альгината на основе двухсценировки двухсценивания использовался для экструзионной биопечати8. Альгинатный полимер был модифицирован с пептидами и белками в этом исследовании. Клетки представили более однородное распределение в этом модифицированном альгинате, чем в широко используемом альгинате из-за участков вложения, предоставляемых пептидами и белками. Кроме того, смешанные биоинки были использованы для решения осаждения клеток в биоинк. В другом исследовании9был использован смешанный биоинк, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ) и желатин или желатиновый метакрилоил (GelMA) с улучшенной механической прочностью. Инкапсулированные клетки представляли однородное распределение главным образом потому, что вязкость смешанного биоинка была улучшена. В целом, существует несколько факторов, влияющих на дисперсию инкапсулированных клеток в биоинке, такие как вязкость биоинка, гравитация клеток, плотность клеток и продолжительность рабочего периода. Среди этих факторов, гравитация клеток играет важную роль в содействии осаждения. Плавучесть и трение, предоставляемые вязкой биоинка были исследованы в качестве основных сил против тяжести на сегодняшний день10.
При этом мы разработали новую стратегию, направленную на содействие однородной дисперсии инкапсулированных клеток в биоинке путем манипулирования несколькими жидкими интерфейсами в биоинковом резервуаре. Эти жидкие интерфейсы, созданные многослойной модификацией биоинка, могут не только обеспечить межфодное удержание, которое замедляет осадок клеток, но и поддерживать подходящую биосовместимость и реологическое поведение биоинка. На практике мы модифицировали aqueous раствор GelMA (5%, w/v) с шелковым фиброном (SF) многослойным способом, чтобы продольно производить четыре интерфейса, обеспечивая межпараленийные напряжения в смешанном биоинке. В результате гравитационная нагрузка на клетки была компенсирована антропогенным межвидовым напряжением, и почти однородная дисперсия инкапсулированных клеток в биоинке была получена из-за меньшего осаждения через соседние слои клеток. До настоящего времени не было зарегистрировано ни одного подобного протокола, чтобы замедлить осаждение инкапсулированных клеток путем манипулирования межфомационным удержанием жидких бионавов. Мы представляем наш протокол здесь, чтобы продемонстрировать новый способ решения осаждения клеток в биопечати.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M64BK-QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900863MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276685MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution

Во время экструзио-основанного трехмерного процесса биопечати, жидко-подобные биоинки с низкой вязкостью могут защитить клетки от повреждения мембраны, вызванного стрессом сдвига и улучшить выживание инкапсулированных клеток. Однако быстрое гравитационно-управляемое осадок клеток в резервуаре может привести к неоднородному распределению клеток в биопечатных структурах и, следовательно, затруднить применение жидковидных биоинков. Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидкого биоинка (например, желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток. В многослойной биоинкации манипулировали несколькими жидкими интерфейсами, чтобы обеспечить межфрусное удержание. Следовательно, действие осаждения клеток, идущее через соседние слои в многослойной системе, было отложено в биоинковом резервуаре. Было установлено, что межфрагментальное удержание было гораздо выше, чем осадочный притяжение клеток, демонстрируя важную роль межфрагментационного удержания в предотвращении осаждения клеток и содействии более однородной дисперсации клеток в многослойной биомарке.

Схема подготовки клеточного биоинкаса показана на рисунке 1. После подготовки различных биоinks, погрузка, разогрев и биопечать были выполнены(рисунок 2). Для оценки распределения инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре была проведена процедура ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution at JoVE.com

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидковидных биоинков (желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток.

Использование многослойного гидрогеля Bioink в трехмерной биопечати для однородного распределения клеток

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Используя наш протокол, многослойность жидких разбавлений биоотвода не только способствует однородной дисперсии инкапсулированных клеток, но и поддерживает биоинквую среду, подходящую для клеток. Мы используем межрасовое напряжение, чтобы остановить осаждение инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре, избегая высокой нагрузки снятия стресса на клетки во время экструзионные печати. Используя эту технологию, мы можем генерировать 3D ткани конструкций с однородной распределения клеток, обеспечивая функциональный in vitro ткани формы для использования в скрининга наркотиков и регенерации медицины исследований.При подготовке биоинки важно обращать внимание на экспериментальную температуру и процедуру погрузки гигрогеля, так как эти факторы могут повлиять на качество чернил. Перед началом подготовки используйте 0,22-микрометровый шприц-фильтр для стерилизации всех материалов и растворяете желатин до 10%окончательной концентрации в 50-градусной-цельсийной PBS в кабинете биологической безопасности. Добавьте метакриический ангидрид в раствор желатина при соотношении веса 0,6 к одному с медленным перемешиванием в течение по крайней мере одного часа при 50 градусах Цельсия.В конце инкубации перенесите смешанный раствор в стерильную 50-миллилитровую трубку и разделите раствор на слои центрифугой. Соберите верхний слой GelMA и разбавьте собранный раствор двумя томами деионизированной воды 40-50 градусов по Цельсию. Диализ решение GelMA с 12 до 14-килодальтон молекулярного веса отсечения диализа мембраны против деионизированной воды в течение пяти-семи дней при 40 до 50 градусов по Цельсию, изменяя воду два раза в день.В конце диализа заморозьте раствор GelMA при температуре минус 80 градусов по Цельсию за одну ночь. Далее лиофилизируйте раствор GelMA в течение трех-пяти дней в заморозке при температуре минус 45 градусов по Цельсию и 0,2 миллибара давления. Затем растворите лиофилизированный гельма в PBS, дополненный 10%-фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 25 миллимолярем HEPES и 0,5%фотоинициатором.Для получения биоинкс шелкового фиброина GelMA смешайте раствор GelMA с различными объемами исходного раствора фиброина шелка и различными объемами PBS, как это предлагается в таблице. Когда все биоинки были подготовлены, sonicate раствор в течение 10 до 20 минут. В то время как чернила sonicating, собирать клетки из 80% стечения NIH/3T3 клеточной культуры в один 15-миллилитровый конической трубки на биоинк раствор, и гранулы клеток центрифугации.Затем тщательно аспирировать supernatants и повторно использовать клетки в каждой трубке с двумя миллилитров биоинка в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр биоинк раствора концентрации. Чтобы загрузить биоинк для печати, добавьте аспират 400 микролитров клеточного шелкового фиброина 0,5 ГельМА в нижний слой двухми миллилитрового шприца. Поместите шприц в ванну с ледяной водой с нулевым градусом по Цельсию в течение пяти минут, чтобы преобразовать биоинк нижний слой в гельное состояние перед загрузкой 400 микролитров клеточного фиброина шелка 0,75 биоинкуса GelMA над слоем шелкового фиброина 0,5 Гельма.Затем верните шприц в ледяную ванну в течение пяти минут, продолжая добавлять каждую дополнительную концентрацию клеточного био цинка в шприц таким же образом. Когда многослойная биоинковая система с различными концентрациями шелкового фиброина в различных слоях была достигнута, разогреть биоинк в 37-градусный инкубатор по Цельсию в течение 30 минут. В конце инкубации загрузите 27-калибровочный печатный сопло на шприц и установите скорость потока до 50 микролитров в минуту, скорость перемещения сопла до двух миллилитров в секунду и высоту сопла до одного миллиметра.Далее печать ткани построить в экструзии образом с помощью изготовленного на заказ биопринтера при комнатной температуре, и перекрестное соединение биопечатной ткани построить с 365 нанометров ультрафиолетового света в течение 40 секунд при 800 милливатт. Затем культура перекрестной ткани построить в DMEM дополняется 10%fetal быvine сыворотки и 1%пенициллин-стрептомицин в инкубаторе клеточной культуры, изменение среды каждые восемь часов в течение первых двух дней и каждые два-три дня после этого. В этом репрезентативном анализе по мере развития процедуры биопечати плотность клеток в целевых скважинах снизилась во всех группах.В шелковой фиброин нулевой группе GelMA, около 70% клеток были отложены в нижнем слое. В шелковом фиброине одной группы GelMA, приблизительно 40% клеток были отложены в нижнем слое, и приблизительно 5% клеток были отложены в верхнем слое. В группе многослойных многослойных шелковистых фиброин Гельма осаждение инкапсулированных клеток было более однородным, чем у контрольных групп.Наиболее важной частью этого протокола является загрузка многослойных биослойных систем SF-GelMA. Этот протокол может быть применен к другим экструзии биопечати анализа, которые используют жидкие биоинки.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Создаёт Использование Тканеспецифическая гидрогелевых Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D-биопечать фотонастраиваемых гидрогелей для изучения активации фибробластов

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Scalable Generation of Uniform Cell Spheroids Using a 3D Acoustic Assembly Device

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Development of a Scaffold-Free Acoustic Assembly Method for High-Quality 3D Cell Spheroid Culture (Video) | JoVE

Трехмерное акустическое сборочное устройство для массового производства клеточных сфероидов

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Клеточная культура IDG-SW3 в трехмерном внеклеточном матриксе

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...