Name: using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution at JoVE.com

Författarna erkänner bidrag från National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 och 81570422), Kinas nationella nyckelprogram för forskning och utveckling (2018YFC1005002), Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (bidrag nr 2017SHZDZX01) och Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Beredning av cell-lastad SF-GelMA
<ol><li>Sterilisera alla material med hjälp av 0,22 μm sprutfilterenheter. Utför alla steg i ett biologiskt säkerhetsskåp.</li>
	<li>Värm 1x PBS till 50 °C och lös upp gelatin i den uppvärmda 1x PBS med omrörning. Den slutliga koncentrationen av gelatin i PBS bör vara 10% (w/v).</li>
	<li>Tillsätt metakrylic anhydride i gelatinlösningen (viktförhållandet mellan metakrylicanhydrid till gelatin på 0,6 till 1) långsamt under omrörning och blanda komplexet i minst 1 h ...

<ol>
	<li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting:+from+benches+to+translational+applications.">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510 (2019).</li><li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization,+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms.">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li><li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs.">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li><li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioink+properties+before,+during+and+after+3D+bioprinting.">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).</li><li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication.">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+tissues+and+organs.">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li><li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting.">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting.">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li><li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking.">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).</li><li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels.">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li></ol>

Stabiliteten i det flerskiktade systemet är en viktig punkt för att utföra det här protokollet. Vi beräknade teoretiskt spridningen av SF-molekyler i GelMA-lösningen baserat på Naumans studie13. Det konstaterades att spridningen av proteiner i lösning var relaterad till deras molekylvikt. Den genomsnittliga molekylvikten (MW) av bovint serumalbumin (BSA) är 66,5 kDa och dess diffusionskoefficient är 64-72 μm2/s. Den genomsnittliga MW av fibrinogen är 339,7 kDa, och dess diff...

Tredimensionell (3D) bioprinting har varit en lovande metod för att tillverka komplexa arkitektoniska och funktionella kopior av inhemska vävnader i biofabricering och regenerativ medicin1,2,3. De gemensamma strategier för bioprinting, inklusive bläckstråleskrivare, extrudering och stereolitografi utskrift, har för-och nackdelar från olika perspektiv4. Bland dessa tekniker är extruderingsproceduren oftast används på grund av dess kostnadseffektivitet. Bioink spelar en nyckelroll i processen stabilitet extrudering bioprinting. Den idealiska cell-lastad bioink bör inte bara vara biokompatibel utan också vara lämplig för mekaniska egenskaper5. Bioinks med låg viskositet presenteras vanligtvis som ett flytande-liknande tillstånd. Dessa bioinks kan enkelt och snabbt deponeras och undvika cellmembranskador framkallas av hög skjuvning stress under extrudering. Men i komplexa fall som kräver långsiktiga tryckperioder, ger låg viskositet ofta upphov till den oundvikliga sedimenteringen av de inkapslade cellerna i bioinkbehållaren, som vanligtvis drivs av gravitationen och leder till en inhomogen cellspridning i bioink6,7. Följaktligen hämmar en bioink med inhomogen cell dispersitet in vitro bioprinting av en funktionell vävnad konstruktion.
Flera nyligen genomförda studier med fokus på bioinks har rapporterat främjande av homogen spridning av inkapslade celler. En modifierad alginatbioink baserad på dubbelstegstvärbindning användes för extrudering av bioprinting8. En alginatpolymer modifierades med peptider och proteiner i denna studie. Celler presenterade en mer homogen fördelning i denna modifierade alginat än i den vanliga alginat på grund av de tillbehör platser som tillhandahålls av peptiderna och proteinerna. Alternativt har blandade bioinks använts för att lösa sedimentering av celler i bioink. En blandad bioink som innehåller polyetylenglykol (PEG) och gelatin eller gelatinmetakryloyl (GelMA) med förbättrad mekanisk robusthet användes i en annan studie9. De inkapslade cellerna presenterade en homogen fördelning främst på grund av viskositeten hos den blandade bioink förbättrades. I allmänhet finns det flera faktorer som påverkar spridningen av de inkapslade cellerna i bioink, såsom viskositeten hos bioink, cellernas gravitation, cellernas densitet och arbetsperiodens varaktighet. Bland dessa faktorer spelar cellernas gravitation en avgörande roll för att främja sedimentering. Den flytkraft och friktion som den trögflytande bioink har undersökts som de viktigaste krafterna mot gravitationen hittills10.
Häri utvecklade vi en ny strategi för att främja homogen spridning av inkapslade celler i bioink genom att manipulera flera flytande gränssnitt i bioink reservoaren. Dessa flytande gränssnitt som skapats av flerskiktade modifiering av bioink kan inte bara ge interfacial retention, som fördröjer sedimentering av celler, men också upprätthålla en lämplig biokompatibilitet och reologiska beteende bioink. I praktiken modifierade vi vattenhaltig GelMA-lösning (5%, w/v) med silkefibroin (SF) på ett flerskiktat sätt för att längsgående producera fyra gränssnitt, vilket ger interfaciala spänningar i den blandade bioink. Som ett resultat, allvaret belastning på cellerna kompenserades av konstgjorda interfacial spänning, och en nästan homogen spridning av inkapslade celler i bioink erhölls på grund av mindre sedimentering över intilliggande lager av celler. Inget liknande protokoll för att bromsa sedimentering av inkapslade celler genom att manipulera interfacial retention i flytande bioinks har rapporterats hittills. Vi presenterar vårt protokoll här för att visa ett nytt sätt att lösa cellsedimentation i bioprinting.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M64BK-QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900863MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276685MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk fibroin</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using multilayered hydrogel bioink in three-dimensional bioprinting for homogeneous cell distribution

Under den extruderingsbaserade tredimensionella bioprintingprocessen kan vätskeliknande bioinkar med låg viskositet skydda celler från membranskador som orsakas av skjuvstress och förbättra överlevnaden för de inkapslade cellerna. Den snabba gravitationsdrivna cellsedimenteringen i reservoaren kan dock leda till en inhomogen cellfördelning i biotryckta strukturer och därmed hindra tillämpningen av vätskeliknande bioinks. Här utvecklade vi en ny flerskiktad modifierad strategi för vätskeliknande bioinks (t.ex. gelatinmetakryloyl med låg viskositet) för att förhindra sedimentering av inkapslade celler. Flera flytande gränssnitt manipulerades i multilayered bioink att ge interfacial retention. Följaktligen var cell sedimentering åtgärder som går över intilliggande lager i flerskiktade systemet fördröjs i bioink reservoaren. det konstaterades att den interfacialretentionen var mycket högre än sedimental dragningskraften hos celler, vilket visar på en kritisk roll för den interfaciala retentionen när det gäller att förhindra cellsedimentation och främja en mer homogen spridning av celler i den flerskiktade bioinken.

Ett schema för beredningen av celllastade bioinks visas i figur 1. Efter beredning av de olika bioinks, lastning, uppvärmning och bioprinting utfördes (figur 2). För att utvärdera fördelningen av de inkapslade cellerna i bioinkbehållaren utfördes ett bioprintingförfarande med tre olika celllastade bioinks i tre 96-brunnsplattor (figur 3A). Två kontrollgrupper (orörda GelMA och SF-1-GelMA bioinks) och den experimentella gr...

Watch this Scientific Journal Video about Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution at JoVE.com

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Här utvecklade vi en ny flerskiktad modifierad strategi för vätskeliknande bioinks (gelatinmetakryloyl med låg viskositet) för att förhindra sedimentering av inkapslade celler.

Använda flerskiktad Hydrogel Bioink i tredimensionell bioprinting för homogen cellfördelning

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Med hjälp av vårt protokoll främjar flerskiktningen av de vätskeliknande bioinkutspädningarna inte bara en homogen spridning av de inkapslade cellerna utan upprätthåller också en cell-lämplig bioink-miljö. Vi använder den interfaciala spänningen för att stoppa sedimenteringen av de inkapslade cellerna i bioinkreservoaren, och undviker den höga skjuvbelastningsbelastningen till cellerna under extruderingsutskrift. Med hjälp av denna teknik kan vi generera 3D-vävnadskonstruktioner med en homogen cellfördelning, vilket ger en funktionell in vitro-vävnadsmögel för användning i läkemedelsscreening och regenereringsmedicinstudier.När man förbereder bioinken är det viktigt att vara uppmärksam på den experimentella temperaturen och begrogel-inläsningsproceduren, eftersom dessa faktorer kan påverka bläckens kvalitet. Innan du påbörjar beredningen, använd 0,22-mikrometer spruta filterenheter för att sterilisera alla material, och lös gelatin till en 10%slutlig koncentration i 50-grader-Celsius PBS i ett biologiskt säkerhetsskåp. Tillsätt metakryfisk anhydrid till gelatinlösningen vid ett 0,6 till ett viktförhållande med långsam omrörning i minst en timme vid 50 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen överför du den blandade lösningen till ett sterilt 50-milliliterrör, och separera lösningen i lager genom centrifuger. Samla upp det övre GelMA-skiktet, och späd den uppsamlade lösningen med två volymer av 40 till 50 grader-Celsius avjoniserat vatten. Dialyze gelma-lösningen med ett 12 till 14 kilodaltons molekylviktsavskurnande dialysmembran mot avjoniserat vatten i fem till sju dagar vid 40 till 50 grader Celsius, vilket ändrar vattnet två gånger dagligen.Vid slutet av dialysen fryser du GelMA-lösningen vid minus 80 grader Celsius över natten. Nästa lyophilize GelMA-lösningen i tre till fem dagar i en frystork vid minus 45 grader Celsius och 0,2 millibars tryck. Sedan lösa lyophilized GelMA i PBS kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum, 25 millimolar HEPES, och 0,5%photoinitiator.För att erhålla silkefibrolet GelMA-bioinkerna, blanda GelMA-lösningen med olika volymer av initial silkefibroinlösning och olika volymer av PBS enligt förslag i tabellen. När alla bioinker har förberetts, sonikera lösningen i 10 till 20 minuter. Medan bläcken är sonicating, samla in cellerna från en 80%konfluent NIH/3T3 cellkultur i en 15-milliliter koniska röret per bioink lösning, och pellet cellerna genom centrifugeringen.Sedan försiktigt aspirera supernatanterna och resuspend cellerna i varje rör med två milliliter bioink på en gånger 10 till de sex cellerna per milliliter av bioink lösning koncentration. För att ladda bioink för utskrift, tillsätt aspirate 400 mikroliter av cell-lastad silkitini 0,5 GelMA till bottenskiktet av en två-milliliter spruta. Placera sprutan i ett nollgradig-Celsius isvattenbad i fem minuter för att omvandla det nedre lagret bioink till ett geltillstånd innan du laddar 400 mikroliter av cell-lastad sidenfibroin 0,75 GelMA-bioink över lagret av silkefibroin 0,5 GelMA.Sedan tillbaka sprutan till isbadet i fem minuter, fortsätter att lägga till varje ytterligare koncentration av cell-lastad bioink till sprutan på samma sätt. När ett flerskiktat bioinksystem med olika koncentrationer av silkefibroin inom de olika skikten har uppnåtts, värm upp bioinken i en 37-graders-Celsius inkubator i 30 minuter. I slutet av inkubationen, ladda en 27-gauge utskriftsmunstycke på sprutan, och ställ in flödeshastigheten till 50 mikroliter per minut, munstyckets rörliga hastighet till två milliliter per sekund, och munstyckets höjd till en millimeter.Nästa skriva ut vävnaden konstruera på ett strängsprutningssätt med hjälp av en skräddarsydd bioskrivare vid rumstemperatur, och tvärlänka den biotryckta vävnadskonstruktionen med 365 nanometer ultraviolett ljus i 40 sekunder vid 800 milliwatt. Sedan kultur tvärbunden vävnad konstruera i DMEM kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum och 1%penicillin-streptomycin i en cell kultur inkubator, ändra mediet var åttonde timme under de första två dagarna och varannan till var tredje dag därefter. I denna representativa analys, allt eftersom bioprintingförfarandet fortskred, minskade cellernas densitet i målvälerna i alla grupperna.I gruppen silk fibroin noll GelMA, var cirka 70%av cellerna deponeras i bottenskiktet. I silkefibroin en GelMA grupp, ungefärligt 40%av cellerna sattes in i det bottna lagrar, och ungefärligt 5%av cellerna sattes in i det bästa lagrar. I gruppen silk fibroin multilayer GelMA var nedfallet av inkapslade celler mer homogen än den för kontrollgrupperna.Den mest kritiska delen av detta protokoll är lastningen av SF-GelMA-multilagerarna för bioink. Detta protokoll kan tillämpas på andra extrudering bioprinting analys som använder vätskeliknande bioinks.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstrukt användning av en vävnadsspecifik Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Storskalig, automatiserad produktion av fett-härledda stamcellsfäroider för 3D-bioprintning

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Beredning och karakterisering av grafenbaserat 3D-biohybridhydrogelbiobläck för perifer neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Phototunable Bioprinted Hydrogels to Probe Cellular Responses to ECM Stiffening

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Understanding Chronic Lung Diseases Using 3D Printed Phototunable Hydrogels (Video) | JoVE

3D-bioprintning av fotoavstämbara hydrogeler för att studera fibroblastaktivering

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Scalable Generation of Uniform Cell Spheroids Using a 3D Acoustic Assembly Device

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Development of a Scaffold-Free Acoustic Assembly Method for High-Quality 3D Cell Spheroid Culture (Video) | JoVE

Tredimensionell akustisk monteringsanordning för masstillverkning av cellsfäroider

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

IDG-SW3 cellodling i en tredimensionell extracellulär matris

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...