Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

يتم دعم مختبر أغيري من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة K01HL135464 وجمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 19IPLOI34660342.

تم علاج جميع الحيوانات المستخدمة في التجارب المشار إليها في هذه الورقة باستخدام المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من جامعة ولاية ميشيغان لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية (IACUC).
1. التزاوج في الوقت المناسب من الفئران C57BL6/J لإنتاج الأجنة
<ol><li>بمجرد أن تصل الفئران إلى سن التكا...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

يستكشف هذا البروتوكول التقنيات التي ينطوي عليها تحليل تطور القلب في القلوب الجنينية. بعض القيود المفروضة على هذه الطريقة هي البراعة البدنية المطلوبة للتقنيات التحضيرية ، والتي قد تتطلب الممارسة ، والمهارة مع التصوير المجهر. إذا كانت الشرائح التي تم الحصول عليها في cryostat فوضوية ، فإن تلطي?...

CHDs هي النوع الأكثر شيوعا من العيوب الخلقية في البشر وهي السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالعيوب الخلقية1،2،3،4، 5،6. على الرغم من أن حوالي 90٪ من الأطفال حديثي الولادة البقاء على قيد الحياة CHD، فإنه يرتبط في كثير من الأحيان مع المراضة كبيرة والتدخلات الطبية على مر السنين، وفرض عبء ثقيل على حياة المرضى ونظام الرعاية الصحية7،8،9،10. خارج العوامل الوراثية البحتة ، وأسباب CHD غير مفهومة بشكل جيد4. أسباب مجهولة تمثل ~ 56-66٪ من جميع الحالات CHD وفقا لجمعية القلب الأمريكية وغيرها من المصادر2،3،4،11. وتشمل العوامل المعروفة الطفرات الوراثية، CNVs، دي نوفو المتغيرات النيوكليوتيدات واحد، وaneuploidy. ويشتبه في أن العوامل البيئية والغذائية هي أيضا مصادر هامة تساهم في CHD، كما اقترحت الدراسات الوبائية التي تربط بين نمط الحياةالأمومي2،12،الحرمان الاقتصادي، والعرق13،وعن طريق البحث في العوامل الغذائية مثل حمض الفوليك11،14 وحمض الريتينويك الدهون النشطة بيولوجيا15،16. التحقيق في آليات وأسباب CHD وغيرها من عيوب القلب والأوعية الدموية من المهم وضع استراتيجيات وقائية وخيارات علاجية جديدة1،4،17،18،19.
الفأر النامية هو نموذج حجر الزاوية لدراسة CHD في الثدييات. ومع ذلك، فإن بعض الأساليب والتحليلات المستخدمة، مثل تشريح الحفاظ على مورفولوجيا القلب، وتحليل مراحل النمو، وتحديد العيوب المرتبطة بـ CHD، يمكن أن تكون شاقة للعلماء الجدد في تحليل قلوب المورين. والهدف من الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول هو تقديم مبادئ توجيهية نوعية وكمية لهذه العمليات. وهكذا ، في هذا البروتوكول نشرح كيفية إجراء التزاوج في الوقت المناسب لإنتاج أجنة من مرحلة الحمل المطلوبة ، وتشريح الإناث الحوامل لاستعادة القلب سليمة (بما في ذلك الأنسجة المرتبطة بها مثل القناة الخارج) ، وتثبيت القلب والاستعداد ل أقسام ة الكبوتورستات، وطرق الأنسجة الأساسية، والتحليلات الكمية لعيوب القلب الشائعة، والتحليل النوعي لضغط عضلة القلب، وهو النمط الظاهري السلائف الشائعة لبعض أنواع CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

عيوب القلب الخلقية (CHD) هي النوع الأكثر شيوعًا من العيوب الخلقية في البشر ، مما يؤثر على ما يصل إلى 1٪ من جميع المواليد الأحياء. ومع ذلك، لا تزال الأسباب الكامنة وراء CHD غير مفهومة بشكل جيد. الفأر النامية يشكل نموذجا قيما لدراسة CHD، وذلك لأن برامج النمو القلبي بين الفئران والبشر يتم الحفاظ عليها بدرجة عالية. يصف البروتوكول بالتفصيل كيفية إنتاج أجنة الفئران من مرحلة الحمل المطلوبة ، وأساليب لعزل والحفاظ على القلب للمعالجة النهائية ، والأساليب الكمية لتحديد الأنواع الشائعة من CHD حسب الأنسجة (على سبيل المثال ، الحاجز البطيني العيوب، وعيوب الحاجز الأذيني، وبراءة اختراع القناة الشريانية)، وطرق قياس الهيمتولوجيا الكمية لقياس الأنماط الظاهرية الشائعة للضغط العضلي. توضح هذه الأساليب جميع الخطوات التي ينطوي عليها إعداد العينات وجمعها وتحليلها ، مما يسمح للعلماء بقياس CHD بشكل صحيح ومستنسخ.

تمت مقارنة مؤشر ضغط العضلات بين القلوب النامية تحت اثنين من بيئات مختلفة، والسيطرة ومجموعة تجريبية. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لتحليل الضغط من الأنسجة العضلية كميا، مما سمح التحليل الإحصائي. وقد تبين أن ضغط العضلات قد انخفض بشكل كبير في القلوب التجريبية نسبة إلى الأج?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

في هذا البروتوكول، نصف إجراءات التحليل النوعي والكمي للأنماط الظاهرية التنموية لدى الفئران المرتبطة بعيوب القلب الخلقية.

تحليل عيوب القلب الخلقية في أجنة الفئران باستخدام أساليب النسيج النوعي والكمي

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

هذا البروتوكول يوحد تقنيات جديدة لتحليل الأنسجة بحيث يمكن استخدامها على نطاق أوسع من قبل مجموعات أخرى الذين يدرسون أيضا عيوب القلب الخلقية. وبما أن تقنيات التحليل النوعي والكمي لها مزاياها وعيوبها، فإن هذه المنهجية تستخدم كليهما لمعالجة أوسع نطاق من الأسئلة التجريبية. يمكن أن يكون لهذه التقنيات تأثير إيجابي على طرق تشخيص أمراض القلب.على سبيل المثال، يمكن لأخصائيي علم الأمراض تطبيق تقنيات تحليل الأنسجة القلبية المجهرية لدينا لتشخيص أمراض القلب البشرية من عينات الخزعة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لأمراض القلب أو أبحاث أمراض القلب العامة. ومع ذلك، توفر هذه الطرق أيضا تقنيات مفيدة مختلفة التي يمكن تطبيقها نحو أي تحليل الأنسجة.لجمع يوم الجنين 15 إلى 15.5 قلوب، وتأمين أطراف السد الحوامل والبدء في جميع أنحاء مجرى البول حتى القص، وجعل بعناية شق على شكل I على طول الجذع. باستخدام ملقط في حركة يغرف، ورفع بلطف الرحم من تجويف البطن استيعاب الأنسجة السطحية للرحم حسب الضرورة مع ملقط غرامة للمساعدة في الاستخراج. استخدم المقص لإطلاق الرحم من البطن.بعد نقع الرحم في برنامج تلفزيوني بارد، قم بتشريح العضو في طبق تشريح. باستخدام مقص، وقطع الرحم إلى أقسام فردية تحتوي كل منها على جنين منفصل. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، قشر بلطف الأجنة من أنسجة الرحم ووضعها في لطبق بيتري جديد يحتوي على أربع درجات مئوية PBS-EDTA.لجمع القلوب، ضع الطبق تحت مجهر تشريح واستخدم زوجين من ملقط غرامة لوضع الجنين في موقف supine. بعد تثبيت الوصول إلى الصدر، استخدم النقطة الحادة لزوج ثان من ملقط غرامة لجعل شق على طول القص للجنين تمتد بين الترقوة إلى السرة. صنع شقوق جيدة جدا وسطحية في حين تعمل تدريجيا نحو داخل تجويف الصدر، وفتح البطن من الجنين.عندما يصبح القلب مرئيًا ، استخدم زوجًا من ملقط للضغط على الجذعدل قليلاً إلى القفص الصدري لقشر الأضلاع المفتوحة. باستخدام جانبي زوج واحد من ملقط، والاستيلاء بلطف على الأوعية الدموية الرئوية دون فصل الأنسجة وسحب القلب من تجويف. تنظيف القلب في برنامج تلفزيوني جديد-EDTA لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل تحديد الأنسجة في 4٪ Paraformaldehyde لمدة 45 إلى 60 دقيقة.ثم، غسل القلب ثلاث مرات لمدة 5 إلى 10 دقائق لكل غسل في برنامج تلفزيوني تكمل مع الجليسين. قبل تخزين القلوب في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية. لإعداد القلب للتبريد، ضع العينات في أنبوب من 30٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 40 ساعة.عندما غرقت القلوب إلى أسفل الأنبوب ، استخدم Pipette باستور مع طرف معدل لنقل كل قلب بعناية إلى قطعة من مسح الوبر الحر. بعد تجفيف الهواء وجيزة، ضع كل عينة في الفردية المثلى قوالب درجة الحرارة القطع في التوجهات المطلوبة للقطع. غمر الأنسجة في المتوسط درجة الحرارة القطع الأمثل دون فقاعات.ثم، وتخزين قوالب في 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى بضعة أيام قبل تجميد الأنسجة في 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل القاء الكرياض. للحصول على أقسام التبريد من العينات، واستخدام جديدة مثالية خفض درجة الحرارة المتوسطة لإرفاق كتلة الأنسجة من الفائدة إلى تشاك من التبريد والسماح للوسيط لتجميد حتى أنها بيضاء مبهمة. أدخل شفرة جديدة واضبط المسافة بين كتلة الأنسجة والشفرة للسماح بالحصول على المقاطع.تقليم كتلة في 10 شرائح ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى نقطة الفائدة. عندما يمكن ملاحظة الأنسجة، استخدم فرشاة طلاء مسطحة صغيرة لسحب الشريحة برفق ضد الحامل في حركة قطع مستمرة. مرة واحدة وقد تم قطع الأنسجة تماما من خلال، واستخدام فرشاة التفاصيل لبات شريحة أسفل شقة ضد المرحلة.ضع القسم في مكانه لمدة 20 إلى 30 ثانية تقريبًا قبل إزالة الفرشاة التفصيلية والانتهاء من الشريحة. استخدام كل من فرش الطلاء لتسطيح بلطف شريحة ضد المرحلة منع أي المتداول وعقد قسم الأنسجة ضد المرحلة. بعد 20 إلى 30 ثانية، الوجه القسم وتتسطح على المرحلة مرة أخرى قبل وضع شريحة مشحونة كهربائيا قريبة بما فيه الكفاية للشريحة أن تنجذب والالتزام الشريحة دون الحاجة إلى لمس الشريحة إلى المرحلة.لتقييم أقسام أنسجة القلب لوجود عيوب القلب الشائعة، وذلك باستخدام مجهر مجهز بكاميرا، الحصول على صور في 5 إلى 10X و 40X التكبير. لتحليل ضغط عضلة القلب، افتح نسيجًا مهمًا في برنامج تحليل الصور المناسب، وحدد الصورة على 8 بت. لتعيين عتبة الصورة، انقر فوق صورة، وضبط، وعتبة، ثم حرك الشريط العلوي لضبط العتبة حتى يتم تحديد وحدات البكسل فقط للخلفية.بعد ذلك، استخدم أداة تحديدات المضلع لرسم منطقة ذات أهمية حول الأنسجة ثم انقر فوق تحليل، تعيين القياسات، المنطقة، والحد إلى العتبة. انقر فوق تحليل و قياس لقياس مساحة بكسل المميز للحصول على قيمة مساحة المساحة السالبة. لقياس المنطقة التي تهمك بأكملها، انقر فوق تحليل، تعيين القياسات، ثم قم بإلغاء تحديد حد العتبة.ثم حدد تحليل وقياس لقياس المنطقة المحددة بالكامل. لحساب منطقة الأنسجة العضلية، اطرح مساحة المساحة السالبة من منطقة منطقة الاهتمام. ثم تقسيم منطقة الأنسجة العضلية من قبل منطقة منطقة الاهتمام لحساب ضغط العضلات و X.The تلطيخ شرائح الأنسجة من قلوب جنينية حصادها، ويوفر ما يكفي من التباين لجعل حواف الأنسجة، ولكن ليس الظلام بحيث تجعل ملامح الخلية لا يمكن التفريق.في هذا التحليل التمثيلي، لوحظ أن ضغط العضلات قد انخفض بشكل كبير في القلوب التجريبية نسبة إلى الأجنة التي تطورت في ظروف غير تجريبية. هذه العينات قيمة وتتطلب وقتا طويلا لإنشاء. أثناء necropsies والقطع التبريد على وجه التحديد، تأكد من أن تكون متعمدة حول كل عمل تقوم به.يحافظ الحفاظ على الأنسجة في Paraformaldehyde على نشاط المستضد الذي يسمح باستخدام العينات لاختبارات مثل تلطيخ Aminofluorescein الذي يساعد على تحديد الأسباب المرضية التي تم العثور عليها أثناء تقييم المورفولوجيا. في مختبرنا، حصلنا على تمثيل كمي للعلاجات التجريبية التي يمكن أن تساعدنا على تحديد الدرجة التي تؤثر بها العلاجات المختلفة على عيناتنا. يمكن لـ Paraformaldehyde إصلاح أي نسيج يلمسه.احرص على ارتداء القفازات دائمًا لتقليل الجلد المكشوف والعمل في غطاء محرك الفيلم كلما كنت تعمل مع هذه المادة الكيميائية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

القلب والأوعية الدموية التصوير باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالية التردد (MHZ 30/45) الجنينية الماوس

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...