Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Den Aguirre Lab er støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institutes of Health under tildeling nummer K01HL135464 og af American Heart Association under tildeling nummer 19IPLOI34660342.

Alle dyr, der anvendes i de forsøg, der henvises til i dette papir blev behandlet ved hjælp af dyrepleje retningslinjer for Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tidsford parring af C57BL6/J mus til embryonproduktion
<ol><li>Når musene har nået ynglealderen (6-8 uger), sættes de sammen i haremavlsformat (dvs. to hunner pr. han). Sæt dem op til avl engang om eftermiddagen eller aftenen. BEMÆRK: Mus yngler ofte inden for 1 time, efter at ly...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Denne protokol udforsker de teknikker, der er involveret i analysen af hjerteudvikling i embryonale hjerter. Nogle begrænsninger af denne metode er den nødvendige fysiske fingerfærdighed for de forberedende teknikker, som kan kræve praksis, og dygtighed med mikroskop billeddannelse. Hvis skiverne opnået på kryoat er rodet, vil hæmatoxylin og eosin farvning ikke være klar, eller hvis billederne taget på mikroskopet har dårlig belysning, så den metode, der anvendes med ImageJ vil ikke arbejde. En begrænsning af...

CHD'er er den mest almindelige form for fødselsdefekt hos mennesker og er den hyppigste årsag til dødsfald som følge af fødselsdefekter1,2,3,4,5,6. Selv om omkring 90% af nyfødte børn overlever CHD, er det ofte forbundet med betydelig sygelighed og medicinske indgreb i årenes løb, pålægge en tung byrde for patienternes liv og sundhedssystemet7,8,9,10. Uden for rent genetiske faktorer, årsagerne til CHD er dårligt forstået4. Uidentificerede årsager tegner sig for ~ 56-66 % af alle CHD-tilfælde ifølge American Heart Association og andre kilder2,3,4,11. Velkendte faktorer omfatter genetiske mutationer, CNVs, de novo enkelt nukleotid varianter, og aneuploidi. Der er mistanke om, at miljø- og kostfaktorer også er vigtige kilder, der bidrager til CHD, som foreslået af epidemiologiske undersøgelser, der forbinder mødres livsstil2,12, økonomisk afsavn og race13og ved forskning i kosten faktorer såsom folinsyre11,14 og den bioaktive lipid retinsyre15,16. Det er vigtigt at undersøge mekanismerne og årsagerne til CHD og andre kardiovaskulære defekter for at udvikle forebyggende strategier og nye terapeutiske løsningsmodeller1,4,17,18,19.
Den udviklende mus er en hjørnesten model for at studere CHD i pattedyr. Men nogle af de anvendte metoder og analyser, såsom dissektioner bevare hjertemorfologi, analyse af udviklingsmæssige faser, og identifikation af CHD-relaterede defekter, kan være skræmmende for forskere, der er nye til analyse af murine hjerter. Målet med de metoder, der er beskrevet i denne protokol, er at tilbyde kvalitative og kvantitative retningslinjer for disse processer. Således forklarer vi i denne protokol, hvordan man udfører tidsvist parring er at producere embryoner af den ønskede svangerskabsuge fase, dissekere drægtige kvinder til intakt hjerte opsving (herunder tilhørende væv såsom udstrømning tarmkanalen), hjerte fiksering og forberedelse til kryot skæring, grundlæggende histologi metoder, kvantitative analyser af fælles hjertefejl, og kvalitativ analyse af hjertemusklen komprimering, en fælles forløber fænotype til nogle typer af CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Medfødte hjertefejl (CHD) er den mest almindelige form for fødselsdefekt hos mennesker, der påvirker op til 1% af alle levendefødte. De underliggende årsager til CHD er dog stadig dårligt forstået. Den udviklende mus er en værdifuld model for studiet af CHD, fordi hjerteudviklingsprogrammer mellem mus og mennesker er stærkt bevaret. Protokollen beskriver i detaljer, hvordan man producerer museembryoner af den ønskede svangerskabsfase, metoder til at isolere og bevare hjertet til downstream-behandling, kvantitative metoder til at identificere almindelige typer chd ved histologi (f.eks. ventrikulær septal defekter, atrieflimren septal defekter, patent ductus arteriosus), og kvantitative histomorphometri metoder til at måle fælles muskulære komprimere fænotyper. Disse metoder formulerer alle de trin, der er involveret i forberedelse, indsamling og analyse af prøver, så forskerne kan måle CHD korrekt og reproducerbart.

Muskelkomprimeringsindekset blev sammenlignet mellem hjerter, der udviklede sig under to forskellige miljøer, en kontrol og en eksperimentel gruppe. Disse protokoller blev brugt til at analysere komprimering af muskelvæv kvantitativt, som tillod statistisk analyse. Muskelkomprimering viste sig at være signifikant reduceret i de eksperimentelle hjerter i forhold til de embryoner, der udviklede sig under ikke-eksperimentelle forhold.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

I denne protokol beskriver vi procedurer til kvalitativt og kvantitativt at analysere udviklingsfænotyper hos mus forbundet med medfødte hjertefejl.

Analyse af medfødte hjertefejl i museembryoner ved hjælp af kvalitative og kvantitative histologiske metoder

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Denne protokol standardiserer nye vævsanalyseteknikker, så de i højere udstrækning kan anvendes af andre grupper, der også studerer medfødte hjertefejl. Da både kvalitative og kvantitative analyseteknikker har deres fordele og ulemper, anvendes denne metode både til at behandle det bredeste udvalg af eksperimentelle spørgsmål. Disse teknikker kan have en positiv indvirkning på kardiologi diagnostiske metoder.For eksempel kunne patologer anvende vores mikroskopiske hjertevæv analyse teknikker til at diagnosticere menneskers hjertesygdom fra biopsi prøver. Denne protokol kan bruges til udviklingsmæssige kardiologi eller generel kardiologi forskning. Men disse metoder giver også forskellige nyttige teknikker, der kan anvendes i retning af enhver vævsanalyse.At indsamle embryonale dag 15 til 15,5 hjerter, sikre lemmer af en gravid dæmning og starter omkring urinrøret op til brystbenet, omhyggeligt lave en I-formet snit langs torso. Brug snævler i en scooping bevægelse, forsigtigt løfte livmoderen ud af bughulen gribe de overfladiske væv i livmoderen efter behov med fine snævring til støtte i udvinding. Brug en saks til at frigøre livmoderen fra maven.Efter iblødsætning livmoderen i iskold PBS, pin orglet i en dissektion fad. Ved hjælp af en saks skæres livmoderen i individuelle sektioner, der hver indeholder et separat embryon. Brug to par fine cæcener, forsigtigt skrælle embryoner ud af livmodervæv og placere dem i en ny petriskål, der indeholder fire grader Celsius PBS-EDTA.For at samle hjerterne skal du placere skålen under et dissekerende mikroskop og bruge to par fine kraftaffængere til at placere fosteret i liggende position. Efter stabilisering adgang til brystet, skal du bruge det skarpe punkt af et andet par fine kraftbefæstelser til at foretage et snit langs brystbenet af embryonet strækker sig mellem kraveben til navlen. Gør meget fine og overfladiske snit, mens gradvist arbejder hen imod indersiden af brysthulen, åbne maven af fosteret.Når hjertet bare bliver synligt, skal du bruge et par fortriver til at presse torsoen lidt kodrede til brystkassen for at skrælle ribbenene åbne. Ved hjælp af siderne af et par stæcener, forsigtigt fat i lunge blodkar uden at adskille vævet og trække hjertet ud af hulrummet. Rengør hjertet i frisk PBS-EDTA i et til to minutter, før væv i 4% Paraformaldehyd i 45 til 60 minutter.Derefter vaskes hjertet tre gange i 5 til 10 minutter pr. vask i PBS suppleret med glycin. Før opbevaring af hjerter i PBS ved fire grader Celsius. For at forberede hjertet til krysektion, placere prøverne i et rør på 30% saccharose og PBS ved fire grader Celsius i 24 til 40 timer.Når hjerterne er sunket til bunden af røret, skal du bruge en Pasteur Pipette med en modificeret spids til omhyggeligt at overføre hvert hjerte til et stykke fnugfri tørre. Efter en kort lufttørring anbringes hver prøve i individuelle optimale skæretemperaturforme i de ønskede retninger til skæring. Nedsænk vævene i optimal skæretemperatur medium uden bobler.Derefter opbevares formene ved 20 grader Celsius i op til et par dage før frysning af væv ved 80 grader Celsius i mindst 24 timer før krysinfektion. For at opnå kryostat dele af prøverne, skal du bruge frisk optimal temperatur skæremedium til at fastgøre væv blok af interesse til chuck af kryostat og lad mediet til at fryse, indtil det er uigennemsigtig hvid. Sæt en ny klinge i, og juster afstanden mellem vævsblokken og klingen, så der kan opnås sektioner.Trim blokken i 10 mikrometer skiver, indtil det punkt af interesse er nået. Når vævet kan observeres, skal du bruge en lille flad pensel til forsigtigt at trække skiven mod stativet i en kontinuerlig skærebevægelse. Når vævet er helt skåret igennem, skal du bruge detaljebørsten til at klappe skiven fladt ned mod scenen.Hold sektionen på plads i ca. 20 til 30 sekunder, før du fjerner den detaljerede pensel og afslutter skiven. Brug begge pensler til forsigtigt at flade skiven mod scenen forhindrer enhver rullende og holde væv sektion mod scenen. Efter 20 til 30 sekunder skal du vende sektionen og flade den mod scenen igen, før du placerer et elektrostatisk opladet dias tæt nok til, at skiven kan tiltrækkes, og klæber til diaset uden at skulle røre ved diaset til scenen.At vurdere hjertevæv sektioner for tilstedeværelsen af fælles hjertefejl, ved hjælp af et mikroskop udstyret med et kamera, få billeder på 5 til 10X og 40X forstørrelser. For hjertemuskelkomprimering analyse, åbne et væv af interesse i et passende billede analyse software program og indstille billedet til 8-bit. Hvis du vil angive billedets tærskel, skal du klikke på Billede, Juster og Tærskel og flytte den øverste linje for at justere tærsklen, indtil kun pixel for baggrunden er markeret.Brug derefter værktøjet til polygonmarkemark til at tegne et område af interesse omkring vævet og derefter klikke på Analysér, Angiv målinger, område og grænse til tærskel. Klik på Analysér og målér for at måle området for de fremhævede pixel for at opnå værdien af området for det negative mellemrum. Hvis du vil måle området i hele området af interesse, skal du klikke på Analysér, Angiv målinger og fravælge Grænse til tærskel.Vælg derefter Analysér og mål for at måle hele området i det valgte interesseområde. For at beregne området for muskelvæv, trække området for negative rum fra området i regionen af interesse. Derefter opdele området af muskelvæv ved området i regionen af interesse for at beregne muskelkomprimering og X.The farvning af væv skiver fra høstede embryonale hjerter, giver nok kontrast til at gøre ud væv kanter, men er ikke så mørkt, at gøre cellen funktioner umulig at skelne.I denne repræsentative analyse blev muskelkomprimeringen observeret at være signifikant reduceret i de eksperimentelle hjerter i forhold til de embryoner, der udviklede sig under ikke-eksperimentelle forhold. Disse prøver er værdifulde og kræver lang tid at skabe. Under obduktioner og cryostat sektionsopde dele specifikt, sørg for at være bevidst om hver handling, du udfører.Bevarelse af væv i Paraformaldehyd fastholder antigenaktiviteten, der gør det muligt at anvende prøverne til test som aminofluoresceinfarvning, som hjælper med at identificere patologiske årsager, der blev fundet under morfologivurderingen. I vores laboratorium opnåede vi kvantitativ repræsentation af eksperimentelle behandlinger, som kan hjælpe os med at identificere, i hvilket omfang forskellige behandlinger påvirker vores prøver. Paraformaldehyd kan fastsætte væv, at det rører.Sørg for altid at bære handsker for at minimere eksponeret hud og til at arbejde i en film hætte, når du arbejder med dette kemikalie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbelt mærkning af neurale crest celler og blodkar i kyllingembryoner ved hjælp af ChickGFP Neural Tube Poding og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Kontrast Imaging i museembryoer Brug højfrekvent ultralyd

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder til Præcist Lokaliseret Overførsel af Celler eller DNA i Early implantation museembryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analyse af koronarkar i Cleared Embryonale hjerter

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Føtal mus kardiovaskulære Imaging ved hjælp af en høj frekvens ultralyd (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...