Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Das Aguirre Lab wird vom National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health unter der Nummer K01HL135464 und von der American Heart Association unter der Nummer 19IPLOI34660342 unterstützt.

Alle Tiere, die in den in diesem Papier genannten Experimenten verwendet wurden, wurden nach den Tierpflegerichtlinien des Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) behandelt.
1. Zeitliche Paarung von C57BL6/J-Mäusen für die Embryoproduktion
<ol><li>Sobald Mäuse das Brutalter erreicht haben (6-8 Wochen), stellen Sie sie in Haremszuchtformat zusammen (d.h. zwei Weibchen pro Männchen). Richten Sie sie für die Zucht irgendwann am Nachmittag oder Abend.<b...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Dieses Protokoll untersucht die Techniken, die an der Analyse der Herzentwicklung in embryonalen Herzen beteiligt sind. Einige Einschränkungen dieser Methode sind die erforderliche körperliche Geschicklichkeit für die Vorbereitenden Techniken, die Übung erfordern können, und Geschicklichkeit mit Mikroskop-Bildgebung. Wenn die am Kryostat erhaltenen Scheiben chaotisch sind, die Hämatoxylin- und Eosinfärbung nicht klar ist, oder wenn die am Mikroskop aufgenommenen Bilder eine schlechte Beleuchtung haben, dann funkti...

CHDs sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und sind die Hauptursache für Geburtsfehler-bedingte Todesfälle1,2,3,4,5,6. Obwohl etwa 90% der neugeborenen Kinder CHD überleben, wird es häufig mit signifikanter Morbidität und medizinischen Interventionen im Laufe der Jahre verbunden, was eine schwere Belastung für das Leben der Patienten und das Gesundheitssystem7,8,9,10. Außerhalb rein genetischer Faktoren sind die Ursachen der CHD schlecht verstanden4. Unbekannte Ursachen machen 56-66% aller CHD-Fälle nach der American Heart Association und anderen Quellen2,3,4,11. Bekannte Faktoren sind genetische Mutationen, CNVs, de novo Single Nukleotid-Varianten und Aneuploidie. Es wird vermutet, dass Umwelt- und Ernährungsfaktoren auch wichtige Quellen sind, die zur CHD beitragen, wie epidemiologische Studien nahelegen, die den mütterlichen Lebensstil2,12, wirtschaftliche Benachteiligung und Rasse13, und durch die Erforschung von Ernährungsfaktoren wie Folsäure11,14 und die bioaktive Lipid-Retinsäure15,16. Die Untersuchung der Mechanismen und Ursachen von CHD und anderen kardiovaskulären Defekten ist wichtig, um präventive Strategien und neuartige therapeutische Optionen zu entwickeln1,4,17,18,19.
Die sich entwickelnde Maus ist ein Eckpfeiler modellt, um CHD bei Säugetieren zu untersuchen. Einige der angewandten Methoden und Analysen, wie z. B. Sezierungen zur Erhaltung der Herzmorphologie, Analyse von Entwicklungsstadien und Identifizierung von CHD-assoziierten Defekten, können jedoch für Wissenschaftler, die neu in der Analyse muriner Herzen sind, beängstigend sein. Das Ziel der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist es, qualitative und quantitative Leitlinien für diese Prozesse anzubieten. So erklären wir in diesem Protokoll, wie man zeitnahe Paarungen durchführt, um Embryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums zu produzieren, schwangere Weibchen für eine intakte Herzregeneration (einschließlich assoziierter Gewebe wie dem Abflusstrakt), Herzfixierung und Kryostatschnitt, grundlegende histologische Methoden, quantitative Analysen von allgemeinen Herzfehlern und qualitative Analyse der Herzmuskelverdichtung, ein häufiger Vorläufer-Phänotyp für einige Arten von KHK.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Angeborene Herzfehler (CHD) sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und betreffen bis zu 1% aller Lebendgeburten. Die zugrunde liegenden Ursachen für DIE CHD sind jedoch noch immer schlecht verstanden. Die sich entwickelnde Maus stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung von CHD dar, da kardiale Entwicklungsprogramme zwischen Mäusen und Menschen stark konserviert sind. Das Protokoll beschreibt detailliert, wie Mausembryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums hergestellt werden können, Methoden zur Isolierung und Erhaltung des Herzens für die nachgeschaltete Verarbeitung, quantitative Methoden zur Identifizierung gängiger CHD-Typen durch Histologie (z. B. ventrikuläre Septum Defekte, vorgerichtliche Septumdefekte, Patent ductus arteriosus) und quantitative Histomorphometriemethoden zur Messung gängiger Muskelverdichtungsphänotypen. Diese Methoden artikulieren alle Schritte, die bei der Probenvorbereitung, -entnahme und -analyse erforderlich sind, sodass Wissenschaftler DIE CHD korrekt und reproduzierbar messen können.

Der Muskelverdichtungsindex wurde zwischen Herzen verglichen, die sich unter zwei verschiedenen Umgebungen, einer Steuerung und einer experimentellen Gruppe, entwickeln. Diese Protokolle wurden verwendet, um die Verdichtung von Muskelgewebe quantitativ zu analysieren, was statistische Analysen ermöglichte. Die Muskelverdichtung zeigte sich in den Versuchsherzen signifikant reduziert im Vergleich zu den Embryonen, die sich unter nichtexperimentellen Bedingungen entwickelten.
<p class=...

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Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Entwicklungsphänotypen bei Mäusen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.

Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Dieses Protokoll standardisiert neue Gewebeanalysetechniken, so dass sie von anderen Gruppen, die auch angeborene Herzfehler untersuchen, weiter verbreitet werden können. Da sowohl qualitative als auch quantitative Analysetechniken ihre Vor- und Nachteile haben, verwendet diese Methode sowohl die breiteste Palette experimenteller Fragen. Diese Techniken können sich positiv auf die kardiologischen Diagnosemethoden auswirken.Beispielsweise könnten Pathologen unsere mikroskopischen Herzgewebeanalysetechniken anwenden, um menschliche Herzkrankheiten aus Biopsieproben zu diagnossieren. Dieses Protokoll kann für die Entwicklungskardiologie oder die allgemeine Kardiologieforschung verwendet werden. Diese Methoden bieten jedoch auch verschiedene nützliche Techniken, die auf jede Gewebeanalyse angewendet werden können.Um den embryonalen Tag 15 bis 15,5 Herzen zu sammeln, sichern Sie die Gliedmaßen einer trächtigen Mutter und beginnen Sie um die Harnröhre bis zum Brustbein, machen Sie vorsichtig einen I-förmigen Schnitt entlang des Oberkörpers. Mit Zangen in einer Schaufelbewegung, heben Sie sanft die Gebärmutter aus der Bauchhöhle greifen die oberflächlichen Gewebe der Gebärmutter nach Bedarf mit feinen Zangen bei der Extraktion zu helfen. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter aus dem Bauch zu lösen.Nachdem Sie die Gebärmutter in eiskaltes PBS eintränkt haben, heften Sie das Organ in eine Sezierschale. Schneiden Sie die Gebärmutter mit einer Schere in einzelne Abschnitte, die jeweils einen separaten Embryo enthalten. Mit zwei Paaren feiner Zangen schälen Sie die Embryonen vorsichtig aus dem Gebärmuttergewebe und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit vier Grad Celsius PBS-EDTA.Um die Herzen zu sammeln, legen Sie die Schale unter ein Sezieren Mikroskop und verwenden Sie zwei Paare von feinen Zangen, um den Embryo in die Supine-Position zu positionieren. Nach der Stabilisierung des Zugangs zur Brust, verwenden Sie den scharfen Punkt eines zweiten Paar feine Zange, um einen Schnitt entlang des Brustbeins des Embryos, der zwischen den Schlüsseln bis zum Nabel erstreckt. Machen sehr feine und oberflächliche Schnitte, während nach und nach in Richtung der Innenseite der Brusthöhle arbeiten, öffnen Sie den Bauch des Embryos.Wenn das Herz gerade sichtbar wird, verwenden Sie ein Paar Zange, um den Oberkörper leicht in den Rippenkäfig zu drücken, um die Rippen zu schälen. Greifen Sie mit den Seiten eines Zangenpaares die Lungenblutgefäße sanft, ohne das Gewebe zu trennen, und ziehen Sie das Herz aus der Höhle. Reinigen Sie das Herz in frischem PBS-EDTA für ein bis zwei Minuten, bevor Sie das Gewebe in 4%Paraformaldehyd für 45 bis 60 Minuten fixieren.Dann waschen Sie das Herz dreimal für 5 bis 10 Minuten pro Wäsche in PBS mit Glycin ergänzt. Vor der Lagerung der Herzen in PBS bei vier Grad Celsius. Um das Herz auf die Kryosektion vorzubereiten, legen Sie die Proben 24 bis 40 Stunden lang in eine Röhre mit 30% Saccharose und PBS bei vier Grad Celsius.Wenn die Herzen auf den Boden der Röhre gesunken sind, verwenden Sie eine Pasteur Pipette mit einer modifizierten Spitze, um jedes Herz vorsichtig auf ein Stück fusselfreies Wischen zu übertragen. Nach einer kurzen Lufttrocknung jede Probe in individuelle optimale Schnitttemperaturformen in den gewünschten Ausrichtungen für das Schneiden aufstellen. Tauchen Sie das Gewebe in ein optimales Schnitttemperaturmedium ohne Blasen.Dann lagern Sie die Formen bei 20 Grad Celsius für bis zu ein paar Tage, bevor Sie das Gewebe bei 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden einfrieren, bevor Sie kryosectioning. Um Kryostatabschnitte der Proben zu erhalten, verwenden Sie frische optimale Temperaturschneidmedium, um den Gewebeblock von Interesse an das Futter des Kryostats zu befestigen und lassen Sie das Medium einfrieren, bis es undurchsichtig weiß ist. Setzen Sie eine neue Klinge ein, und passen Sie den Abstand zwischen dem Gewebeblock und der Klinge an, damit Abschnitte erhalten werden können.Schneiden Sie den Block in 10 Mikrometer-Scheiben, bis der Point of Interest erreicht ist. Wenn das Gewebe beobachtet werden kann, verwenden Sie einen kleinen flachen Pinsel, um die Scheibe vorsichtig gegen den Ständer in einer kontinuierlichen Schnittbewegung zu ziehen. Sobald das Gewebe vollständig durchgeschnitten wurde, verwenden Sie die Detailbürste, um die Scheibe flach gegen die Bühne zu klopfen.Halten Sie den Abschnitt ca. 20 bis 30 Sekunden an Ort und Stelle, bevor Sie den detaillierten Pinsel entfernen und die Scheibe fertigstellen. Verwenden Sie beide Pinsel, um die Scheibe sanft gegen die Bühne abzuflachen und das Rollen zu verhindern und halten Sie den Gewebeabschnitt gegen die Bühne. Nach 20 bis 30 Sekunden den Abschnitt umdrehen und wieder gegen die Bühne abflachen, bevor Sie eine elektrostatisch geladene Rutsche so nah stellen, dass die Scheibe angezogen und an der Folie haften kann, ohne die Folie auf die Bühne berühren zu müssen.Um die Herzgewebeabschnitte auf das Vorhandensein von häufigen Herzfehlern zu bewerten, erhalten Sie mit einem Mikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist, Bilder mit 5- bis 10-facher und 40-facher Vergrößerung. Für die Herzmuskelverdichtungsanalyse öffnen Sie ein Gewebe von Interesse in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm und stellen Sie das Bild auf 8-Bit ein. Um den Schwellenwert des Bildes festzulegen, klicken Sie auf Bild, Anpassen und Schwellenwert, und verschieben Sie die obere Leiste, um den Schwellenwert anzupassen, bis nur die Pixel für den Hintergrund ausgewählt sind.Verwenden Sie als Nächstes das Polygonauswahlwerkzeug, um einen Bereich von Interesse um das Gewebe zu zeichnen, und klicken Sie dann auf Analysieren, Messen festlegen, Fläche und Grenzwert auf Schwellenwert begrenzen. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um den Bereich der hervorgehobenen Pixel zu messen, um den Wert der Fläche des negativen Raums zu erhalten. Um den Bereich der gesamten Interessensregion zu messen, klicken Sie auf Analysieren, Festlegen von Messungen und deaktivieren Sie limit to threshold.Wählen Sie dann Analysieren und Messen aus, um den gesamten Bereich der ausgewählten Interessenregion zu messen. Um den Bereich des Muskelgewebes zu berechnen, subtrahieren Sie den Bereich des negativen Raums vom Bereich der Interessenregion. Dann teilen Sie den Bereich des Muskelgewebes durch den Bereich der Region des Interesses, um die Muskelverdichtung und X zu berechnen. Die Färbung von Gewebescheiben aus geernteten embryonalen Herzen, bietet genügend Kontrast, um die Geweberänder zu machen, ist aber nicht so dunkel, dass die Zellmerkmale ununterscheidbar zu machen.In dieser repräsentativen Analyse wurde beobachtet, dass die Muskelverdichtung in den versuchsreichen Herzen im Vergleich zu den Embryonen, die sich unter nicht experimentellen Bedingungen entwickelten, signifikant reduziert wurde. Diese Beispiele sind wertvoll und erfordern eine lange Zeit zu erstellen. Während Der Nekropsien und der Kryostat-Sektion speziell, stellen Sie sicher, dass absichtlich über jede Aktion, die Sie durchführen.Die Erhaltung der Gewebe in Paraformaldehyd hält die Antigenaktivität aufrecht, die es ermöglicht, die Proben für Tests wie Aminofluorescein-Färbung zu verwenden, die helfen, pathologische Ursachen zu identifizieren, die während der Morphologiebewertung gefunden wurden. In unserem Labor haben wir eine quantitative Darstellung experimenteller Behandlungen erhalten, die uns helfen können, das Ausmaß zu identifizieren, in dem verschiedene Behandlungen unsere Proben beeinflussen. Paraformaldehyd kann jedes Gewebe reparieren, das es berührt.Achten Sie darauf, immer Handschuhe zu tragen, um die exponierte Haut zu minimieren und in einer Filmhaube zu arbeiten, wenn Sie mit dieser Chemikalie arbeiten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...