Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

מעבדת אגירי נתמכת על ידי הלב הלאומי, הריאות, ומכון הדם של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס K01HL135464 ועל ידי איגוד הלב האמריקני תחת מספר הפרס 19IPLOI34660342.

כל בעלי החיים המשמשים את הניסויים המוזכרים במאמר זה טופלו באמצעות הנחיות לטיפול בעלי חיים של המדינה מישיגן טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השימוש (IACUC).
1. מתוזמן ההזדווגות של עכברים C57BL6/J לייצור העובר
<ol><li>ברגע שעכברים הגיעו לגיל הרבייה (6-8 שבועות), לשים אותם יחד ב הרמון בפו?...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

פרוטוקול זה בוחן את הטכניקות המעורבות בניתוח של התפתחות הלב בלבבות עובריים. חלק מהמגבלות של שיטה זו הן המיומנות הפיזית הנדרשת עבור טכניקות ההכנה, שעשויות לדרוש תרגול, ומיומנות עם דימות מיקרוסקופ. אם הפרוסות המתקבלות בקריוסטט מלוכלכות, המטאוקסילין והאאוזין כתמים לא יהיו ברורים, או אם התמו...

Chds הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם הלידה בבני אדם הם הגורם המוביל של לידה מוות פגמים הקשורים1,2,3,4,5,6. למרות כ 90% של הילדים היילוד לשרוד CHD, הוא משויך לעתים קרובות עם תחלואה משמעותית התערבויות רפואיות במהלך השנים, הטלת נטל כבד על חיי החולים ומערכת הבריאות7,8,9,10. מחוץ לגורמים גנטיים גרידא, הגורמים ל-CHD מובנים בצורה עלובה4. לא מזוהה גורם לחשבון של ~ 56-66% של כל המקרים CHD על פי איגוד הלב האמריקני ומקורות אחרים2,3,4,11. גורמים ידועים כוללים מוטציות גנטיות, CNVs, דה נובו נוקלאוטיד יחיד משתנים, ו aneuploidy. הוא חשד כי גורמים סביבתיים ותזונתיים הם גם מקורות חשובים לתרום CHD, כפי שהוצע על ידי מחקרים אפידמיולוגיים קישור אורח חיים אימהי2,12, מחסור כלכלי, ומרוץ13, ועל ידי מחקר לתוך גורמים תזונתיים כגון חומצה פולית11,14 ואת חומצה retinoic השומנים הביואקטיבית15,16. חקירת מנגנונים וגורמים של מומים וכלי דם אחרים חשוב לפתח אסטרטגיות מניעה ואפשרויות הטיפול הרומן1,4,17,18,19.
העכבר המתפתח הוא דגם אבן פינה ללימוד CHD ביונקים. עם זאת, חלק מהשיטות והניתוחים המועסקים, כגון ניתוח שמירה על מורפולוגיה של הלב, אנליזה של שלבים התפתחותיים וזיהוי של פגמים משויכים ב-CHD, יכולים להרתיע מדענים החדשים לניתוח לבבות מורתיים. מטרת השיטות המתוארות בפרוטוקול זה היא להציע קווים מנחים איכותיים וכמותיים לתהליכים אלה. כך, בפרוטוקול זה אנו מסבירים כיצד לבצע מצות מתוזמן כדי לייצר עוברים בשלב ההריון הרצוי, לנתח נשים הרות להתאוששות לב שלמה (כולל רקמות הקשורות כגון מערכת הזרימה), קיבעון לב והכנה ל קריוסטט התגובה, בסיסי שיטות היסטולוגיה, ניתוחים כמותיים של מומים לב נפוצות, ניתוח איכותני של compaction שריר הלב, הקודמן משותף פנוטיפים לסוגים מסוימים של CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

מומים לב מולדים (CHD) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם, המשפיעים על 1% של כל לידות חי. עם זאת, הסיבות הבסיסיות ל-CHD עדיין מובנות בצורה עלובה. העכבר המתפתח מהווה מודל חשוב למחקר של CHD, מכיוון תוכניות התפתחותיות לב בין עכברים ובני אדם הם שמרו במידה רבה. הפרוטוקול מתאר בפרוטרוט כיצד לייצר עוברי העכבר של שלב ההיריון הרצוי, שיטות לבידוד ולשמר את הלב עבור עיבוד במורד הזרם, שיטות כמותיים כדי לזהות סוגים נפוצים של CHD על ידי היסטולוגיה (g., במחיצה הבין-חדרית פגמים, פרפור מומים בעלי גביע, כמותי מסוג דוטוס, ושיטות כמותית למדידת הפנוטיפים השכיחים של השרירים. שיטות אלה לבטא את כל השלבים המעורבים הכנה לדוגמה, איסוף, וניתוח, המאפשר למדענים למדוד בצורה נכונה מחקר CHD.

מדד השריר שרירים הושווה בין לבבות המתפתחים בשתי סביבות שונות, שליטה וקבוצה ניסיונית. פרוטוקולים אלה שימשו כדי לנתח את הדחיסה של רקמת שריר רקמות, אשר התיר ניתוח סטטיסטי. דחיסת שרירים הוכח להצטמצם באופן משמעותי בלבבות הניסיוניים ביחס לעוברים שפותחו בתנאים שאינם ניסיוניים...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליכים באיכות ובכמת לנתח פנוטיפים התפתחותיים בעכברים הקשורים למומים מולדים לב.

ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

פרוטוקול זה מתקנן טכניקות חדשות לניתוח רקמות כך שהן יכולות להיות בשימוש נרחב יותר על ידי קבוצות אחרות אשר גם ללמוד מומים מולדים בלב. מכיוון שלטכניקות ניתוח איכותיות וכמותיות יש את היתרונות והחסרונות שלהן, מתודולוגיה זו משתמשת הן כדי לענות על הטווח הרחב ביותר של שאלות ניסיוניות. טכניקות אלה יכולות להיות השפעה חיובית על שיטות אבחון קרדיולוגיה.לדוגמה, פתולוגים יכולים ליישם את טכניקות ניתוח רקמת הלב המיקרוסקופית שלנו לקראת אבחון מחלות לב אנושיות מדגימות ביופסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש לקרדיולוגיה התפתחותית או למחקר קרדיולוגי כללי. עם זאת, שיטות אלה מספקות גם טכניקות שימושיות שונות שניתן ליישם כלפי כל ניתוח רקמות.כדי לאסוף יום עוברי 15 עד 15.5 לבבות, לאבטח את הגפיים של סכר בהריון ולהתחיל סביב השופכה עד עצם החזה, בזהירות לעשות חתך בצורת I לאורך פלג הגוף העליון. באמצעות מדפים בתנועה סקופ, בעדינות להרים את הרחם מתוך חלל הבטן תופס את הרקמות השטחיות של הרחם לפי הצורך עם מטחנים עדין כדי לסייע בחילוץ. השתמש במספריים כדי לשחרר את הרחם מהבטן.לאחר השריית הרחם ב- PBS קר כקרח, הצמד את האיבר לתוך צלחת ניתוח. בעזרת מספריים, חותכים את הרחם לחלקים בודדים שכל אחד מהם מכיל עובר נפרד. באמצעות שני זוגות של מדפים עדין, בעדינות לקלף את העוברים מתוך רקמת הרחם ולמקום אותם לצלחת פטרי חדשה המכילה ארבע מעלות צלזיוס PBS-EDTA.כדי לאסוף את הלבבות, מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש בשני זוגות של מטלפים עדין כדי למקם את העובר לתוך המיקום supine. לאחר ייצוב הגישה לחזה, השתמש בנקודה החדה של זוג מלקחיים עדין שני כדי לבצע חתך לאורך עצם החזה של העובר המשתרע בין עצם הבריח לטבור. ביצוע חתכים עדין מאוד שטחי תוך כדי עבודה הדרגתית לכיוון החלק הפנימי של חלל החזה, לפתוח את הבטן של העובר.כאשר הלב רק הופך גלוי, להשתמש בזוג מדפים כדי לסחוט את פלג הגוף העליון מעט מתפנק לכלוב הצלעות לקלף את הצלעות פתוחות. באמצעות הצדדים של זוג אחד של מדפים, בעדינות לתפוס את כלי הדם ריאתי מבלי להפריד את הרקמה ולמשוך את הלב מתוך החלל. נקו את הלב ב-PBS-EDTA טרי למשך שעה עד שתי דקות לפני תיקון הרקמה ב-4% Paraformaldehyde למשך 45 עד 60 דקות.לאחר מכן, לשטוף את הלב שלוש פעמים במשך 5 עד 10 דקות לשטוף PBS בתוספת גליצין. לפני אחסון הלבבות ב PBS בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את הלב להקפאה, מניחים את הדגימות לתוך צינור של 30% סוכרוז ו PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 עד 40 שעות.כאשר הלבבות שקעו לתחתית הצינור, השתמש פיפיטור עם קצה שונה להעביר בזהירות כל לב אל חתיכת מנגב חינם מוך. לאחר ייבוש אוויר קצר, מניחים כל דגימה בתבניות טמפרטורת חיתוך אופטימליות בודדות בכיוון הרצוי לחיתוך. לטביע את הרקמות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי ללא בועות.לאחר מכן, לאחסן את התבניות ב 20 מעלות צלזיוס עד כמה ימים לפני הקפאת הרקמות ב 80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לפני cryosectioning. כדי להשיג קטעי קריוסטט של הדגימות, השתמש בינוני חיתוך טמפרטורה אופטימלית טרי כדי לחבר את בלוק הרקמה של עניין צ'אק של cryostat ולאפשר למדיום להקפיא עד שהוא לבן אטום. הכנס להב חדש והתאם את המרחק בין בלוק הרקמה ללהב כדי לאפשר השגת מקטעים.חותכים את הבלוק בפרוסות 10 מיקרומטר עד להגעת נקודת העניין. כאשר ניתן לצפות ברקמה, השתמש במברשת צבע שטוחה קטנה כדי למשוך בעדינות את הפרוסה כנגד הדוכן בהיתוך מתמשך. לאחר הרקמה נחתכה לחלוטין דרך, להשתמש במברשת הפרטים כדי לטפוח את הפרוסה שטוחה על הבמה.החזק את החלק במקומו למשך כ- 20 עד 30 שניות לפני הסרת המברשת המפורטת וסיום הפרוסה. השתמשו בשתי מברשות הצבע כדי לשטח בעדינות את הפרוסה על הבמה המונעת גלגול ולהחזיק את קטע הרקמה על הבמה. לאחר 20 עד 30 שניות, הפוך את המקטע ושטח אותו שוב על הבמה לפני הצבת שקופית טעונה אלקטרוסטטית קרוב מספיק כדי לפרוסה להימשך לדבוק בשקופית מבלי לגעת בשקופית לבמה.כדי להעריך את מקטעי רקמת הלב לנוכחות של מומים נפוצים בלב, באמצעות מיקרוסקופ המצויד במצלמה, השג תמונות בהגדלות של פי 5 עד 10X ו- 40X. לניתוח דחיסת שריר לב, פתח רקמה מעניינת בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה והגדר את התמונה ל- 8 סיביות. כדי לקבוע את סף התמונה, לחצו על 'תמונה', 'התאם' ו'סף' והזיזו את הסרף העליון להתאמת הסף עד שנבחרו רק הפיקסלים לרקע.לאחר מכן, השתמש בכלי בחירות מצולע כדי לצייר אזור עניין סביב הרקמה ולאחר מכן לחץ על נתח, הגדר מדידות, שטח וגבלה לסף. לחצו על 'נתח' ו'מדוד' כדי למדוד את אזור הפיקסלים המסומן כדי לקבל את ערך אזור הרווח השלילי. למדידת האזור של אזור הריבית כולו, לחצו על 'נתח', 'קבע מידות' ו'בטלו את הסימון באפשרות 'הגבל לסף'.לאחר מכן, בחר נתח ולמדוד כדי למדוד את כל האזור של אזור העניין שנבחר. כדי לחשב את אזור רקמת השריר, הפחת את אזור החלל השלילי מאזור אזור העניין. ואז לחלק את האזור של רקמת השריר על ידי האזור של אזור העניין כדי לחשב את דחיסת השריר X.The הכתם של פרוסות רקמה מלבבות עובריים שנקטפו, מספק ניגוד מספיק כדי להפוך את קצוות הרקמה, אבל הוא לא כל כך כהה כמו כדי להפוך את תכונות התא בלתי ניתן להבחנה.בניתוח מייצג זה, דחיסת השרירים נצפתה להיות מופחתת באופן משמעותי בלבבות הניסוי ביחס לעוברים שהתפתחו בתנאים שאינם ניסיוניים. דגימות אלה הן בעלות ערך ודורשות זמן רב ליצירתן. במהלך necropsies ואת ניתוח קריוסטט במיוחד, הקפד להיות מכוון על כל פעולה שאתה מבצע.שימור הרקמות בפרפורמלדהיד שומר על פעילות האנטיגן המאפשרת שימוש בדגימות לבדיקות כמו כתמי Aminofluorescein המסייעים בזיהוי גורמים פתולוגיים שנמצאו במהלך הערכת המורפולוגיה. במעבדה שלנו, השגנו ייצוג כמותי של טיפולים ניסיוניים שיכולים לעזור לנו לזהות את מידת הטיפולים השונים המשפיעים על הדגימות שלנו. Paraformaldehyde יכול לתקן כל רקמה שהוא נוגע.יש לדאוג תמיד ללבוש כפפות כדי למזער את העור החשוף ולעבוד ברדס הסרט בכל פעם עובד עם זה כימי.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...