Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Aguirre Lab은 수상 번호 K01HL135464에 따라 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소와 수상 번호 19IPLOI34660342에 따라 미국 심장 협회에 의해 지원됩니다.

이 논문에서 언급된 실험에 사용된 모든 동물은 미시간 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 동물 관리 지침을 사용하여 처리되었습니다.
1. 배아 생산을 위한 C57BL6/J 마우스의 시간 적시 짝짓기
<ol><li>일단 마우스가 번식 연령 (6-8 주)에 도달하면 하렘 사육 형식 (즉, 한 남성 당 두 마리의 암컷)로 함께 넣습니다. 오후 나 저녁에 언젠가 번식을 위해 그들을 설정합...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

이 프로토콜은 배아 심장에서 심장 발달의 분석에 관련된 기술을 탐구합니다. 이 방법의 몇몇 제한은 현미경 화상 진찰을 가진 사례 및 기술, 필요로 할 수 있는 예비 기술에 필요한 물리적 손재주입니다. 저온 유지 작업에서 얻은 조각이 지저분하면 헤마톡실린 및 에오신 얼룩이 명확하지 않거나 현미경에서 찍은 이미지가 조명이 좋지 않은 경우 ImageJ와 함께 사용되는 방법이 작동하지 않습니다....

CHD는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형이고 출생 결함 관련 죽음의 주요한 원인1,2,3,4,5,6. 신생아의 약 90 %가 CHD에서 생존하지만, 환자의 삶과 의료 시스템에 무거운 부담을 부과, 수년에 걸쳐 상당한 이환율 및 의료 개입과 자주연관7,8,9,10. 순전히 유전 적 요인 의 외부, CHD의 원인은 제대로 이해4. 미국 심장 협회 및 기타 소스 에 따라 모든 CHD 케이스의 ~ 56-66 %를 차지하는 미확인 원인2,3,4,11. 잘 알려진 인자는 유전 적 돌연변이, CNV, 드 노보 단일 뉴클레오티드 변이체, 및 이수성염을 포함한다. 모성생활2,12,경제적 박탈, 인종13을연결하는 역학 연구에서 제시한 바와 같이 환경 및 식이 요인이 CHD에 기여하는 중요한 원천이라고 의심되며 엽산11,14 및 생리활성 지질 망막 산15,16과같은 식이 인자를 연구하여 연구한다. CHD 및 기타 심혈관 결함의 메커니즘 및 원인을 조사하는 것은 예방 전략 및 새로운 치료 옵션1,4,17,18,19를개발하는 것이 중요하다.
개발 마우스는 포유류에서 CHD를 공부하기위한 초석 모델입니다. 그러나, 심장 형태를 보존하는 해부, 발달 단계의 분석 및 CHD 관련 결함의 확인과 같은 채택된 방법 및 분석의 몇몇은, murine 심혼의 분석에 새로운 과학자를 위해 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 방법의 목표는 이러한 프로세스에 대한 정성적 및 정량적 지침을 제공하는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜에서는 원하는 임신 단계의 배아를 생산하기 위해 시간 적 짝짓기를 수행하는 방법, 임신 한 여성을 그대로 심장 회복 (유출 관과 같은 관련 조직 포함), 심장 고정 및 준비에 대한 해부하는 방법을 설명합니다. 저온 절제, 기본 운동학 방법, 일반적인 심장 결함의 정량적 분석 및 심장 근육 다짐의 정성적 분석, CHD의 일부 유형에 대한 일반적인 전구체 표현형.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

선천성 심장 결함 (CHD)는 모든 살아있는 출생의 1%까지 영향을 미치는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형입니다. 그러나, CHD에 대 한 근본 원인은 여전히 제대로 이해. 개발 마우스는 마우스와 인간 사이의 심장 발달 프로그램이 매우 보존되기 때문에 CHD의 연구를위한 가치있는 모델을 구성한다. 이 프로토콜은 원하는 임신 단계의 마우스 배아를 생산하는 방법, 하류 처리를 위해 심장을 분리하고 보존하는 방법, 조직학에 의한 일반적인 유형의 CHD를 식별하는 정량적 방법(예: 심실 중격)을 상세히 기술합니다. 결함, 심방 중격 결함, 특허 덕터스 동맥 동맥 및 일반적인 근육 다짐 표현형을 측정하는 정량적 조직 적 방법. 이러한 방법은 시료 준비, 수집 및 분석과 관련된 모든 단계를 명확하게 하여 과학자들이 CHD를 정확하고 재현가능하게 측정할 수 있도록 합니다.

근육 다짐 지수는 두 개의 서로 다른 환경, 대조군 및 실험 군에서 발전하는 심장 사이에서 비교되었다. 이 프로토콜은 통계 분석을 허용하는 근육 조직의 압축을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. 근육 다짐은 비실험 조건에서 개발된 배아에 비해 실험심에서 현저히 감소되는 것으로 나타났다.
관찰 타이밍이 부정확?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.

정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

이 프로토콜은 선천성 심장 결함을 연구하는 다른 그룹에서 더 널리 사용될 수 있도록 새로운 조직 분석 기술을 표준화합니다. 정성적 및 정량적 분석 기술이 모두 장단점을 가지고 있기 때문에 이 방법론은 두 가지 를 모두 사용하여 가장 광범위한 실험 적 질문을 해결합니다. 이 기술은 심장 진단 방법에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다.예를 들면, 병리학자는 생검 견본에서 인간 적인 심장병을 진단하는 쪽으로 우리의 현미경 심장 조직 분석 기술을 적용할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 발달 심장학 또는 일반적인 심장학 연구에 사용될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 또한 임의의 조직 분석에 적용할 수 있는 다양 한 유용한 기술을 제공.배아의 날 15~15.5개의 하트를 수집하려면 임신한 댐의 팔다리를 확보하고 요도주변에서 흉골까지 시작하여 몸통을 따라 I자형 절개를 조심스럽게 만듭니다. 스쿱 모션에 집게를 사용하여, 추출에 도움이 미세 집게와 필요에 따라 자궁의 피상 적 조직을 파악 하는 복강에서 자궁을 부드럽게 들어 올립니다. 가위를 사용하여 복부에서 자궁을 방출하십시오.차가운 PBS에 자궁을 담근 후, 해부 접시에 오르간을 고정. 가위를 사용하여 자궁을 각각 별도의 배아를 포함하는 개별 섹션으로 자른다. 두 쌍의 미세 한 개의 포셉을 사용하여 자궁 조직에서 배아를 부드럽게 껍질을 벗기고 섭씨 4도가 함유 된 새로운 페트리 접시에 넣습니다.심혼을 수집하기 위하여는, 해부현미경의 밑에 접시를 놓고 양상을 supine 위치에 태아를 놓기 위하여 미세 한 집게의 2 쌍을 이용합니다. 가슴에 대한 접근을 안정화한 후, 두 번째 미세 집게의 날카로운 점을 사용하여 clavicles 사이배꼽으로 확장되는 배아의 흉골을 따라 절개를 합니다. 점차적으로 가슴 구멍의 내부를 향해 작업하는 동안 매우 미세하고 피상적 인 절개를하고, 배아의 복부를 엽니 다.심장이 막 보이면 몸통을 갈비뼈에 약간 끼워 갈비뼈가 열리도록 짜냅니다. 한 쌍의 집게의 측면을 사용하여 조직을 분리하지 않고 폐 혈관을 부드럽게 잡고 심장을 구멍에서 끌어 냅니다. 45~60분 동안 4%의 파라포름알데히드로 조직을 고정하기 전에 신선한 PBS-EDTA에서 1~2분 동안 심장을 청소하십시오.그런 다음, 글리신으로 보충 PBS에서 세척 당 5 ~ 10 분 동안 심장을 세 번 씻습니다. 4섭씨에서 PBS에 하트를 저장하기 전에. 저온 절제를 위해 심장을 준비하려면 샘플을 섭씨 4도에서 섭씨 30 %와 PBS의 튜브에 24 ~ 40 시간 동안 배치하십시오.하트가 튜브 의 바닥에 침몰했을 때, 각 심장을 보풀 없는 물티슈 조각으로 조심스럽게 옮기려면 변형된 팁이 있는 파스퇴르 파이펫을 사용하십시오. 짧은 공기 건조 후, 단면에 대한 원하는 방향으로 개별 최적의 절단 온도 금형에 각 샘플을 배치합니다. 기포없이 최적의 절삭 온도 매체에 조직을 잠급.그런 다음 금형을 섭씨 20도까지 보관한 후 극저온 절제 전에 최소 24시간 동안 80°C의 조직을 동결하십시오. 시료의 극저온 부분을 얻으려면 신선한 최적의 온도 절단 매체를 사용하여 저온의 척에 관심있는 조직 블록을 부착하고 불투명한 흰색이 될 때까지 매체가 얼릴 수 있도록하십시오. 새 블레이드를 삽입하고 티슈 블록과 블레이드 사이의 거리를 조정하여 섹션을 얻을 수 있도록 합니다.관심 지점에 도달할 때까지 블록을 10 마이크로미터 슬라이스로 트리밍합니다. 조직을 관찰할 수 있을 때, 작은 플랫 페인트브러시를 사용하여 연속 절단 동작으로 스탠드에 슬라이스를 부드럽게 당깁니다. 조직이 완전히 잘린 후 세부 브러시를 사용하여 슬라이스를 스테이지에 대고 평평하게 두드려보십시오.자세한 브러시를 제거하고 슬라이스를 마무리하기 전에 약 20~30초 동안 섹션을 제자리에 고정합니다. 두 페인트 브러시를 사용하여 스테이지에 슬라이스를 부드럽게 평평하게 하여 롤링을 방지하고 스테이지에 대한 조직 섹션을 잡습니다. 20~30초 후에는 단면을 뒤집어 스테이지에 다시 평평하게 놓고 정전기로 충전된 슬라이드를 가까이 배치하여 슬라이스를 끌어들이고 슬라이드를 스테이지로 터치하지 않고도 슬라이드를 부착합니다.일반적인 심장 결함의 존재를 위한 심혼 조직 단면도를 평가하기 위하여는, 카메라가 장착된 현미경을 사용하여, 5 10X 및 40X 배율에서 심상을 얻습니다. 심장 근육 다짐 분석을 위해 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램에 관심있는 조직을 열고 이미지를 8 비트로 설정합니다. 이미지의 임계값을 설정하려면 이미지, 조정 및 임계값을 클릭하고 맨 위 막대를 이동하여 배경의 픽셀만 선택할 때까지 임계값을 조정합니다.그런 다음 다각형 선택 도구를 사용하여 조직 주위의 관심 영역을 그린 다음 분석, 측정 설정, 영역 및 임계값제한을 클릭합니다. 강조 표시된 픽셀의 영역을 측정하여 음수 공간의 값을 얻으려면 분석 및 측정을 클릭합니다. 관심 영역 전체의 영역을 측정하려면 분석, 측정 설정 및 임계값 제한을 선택 해제합니다.그런 다음 분석 및 측정을 선택하여 선택한 관심 영역의 전체 영역을 측정합니다. 근육 조직의 영역을 계산하려면 관심 영역의 영역에서 부정적인 공간의 영역을 뺍니다. 그런 다음 근육 조직의 영역을 관심 영역별로 나누어 근육 다짐과 X.수확된 배아 심혼에서 조직 조각의 염색은 조직 가장자리를 만들기에 충분한 대조를 제공하지만 세포 특징을 구별할 수 있도록 너무 어둡지는 않습니다.이러한 대표적인 분석에서, 근육 다짐은 비실험적 조건하에서 개발된 배아에 비해 실험적인 심장에서 현저히 감소되는 것으로 관찰되었다. 이러한 샘플은 가치가 있으며 만드는 데 오랜 시간이 필요합니다. 부검과 특히 극저온 절개 하는 동안, 수행 하는 모든 행동에 대 한 의도적이어야 합니다.Paraformaldehyde에서 조직을 보존하는 것은 형태 평가 도중 찾아낸 병리학적인 원인을 확인하는 것을 돕는 Aminofluorescein 얼룩 같이 시험을 위해 이용되는 견본을 허용하는 항원 활동을 유지합니다. 우리의 실험실에서, 우리는 다른 처리가 우리의 견본에 영향을 미치는 정도를 확인하는 것을 도울 수 있는 실험 처리의 정량적인 표현을 얻었습니다. 파라포멀데히드는 닿는 모든 조직을 고칠 수 있습니다.항상 노출된 피부를 최소화하고 이 화학 물질로 작업할 때마다 필름 후드에서 작업할 수 있도록 장갑을 착용하십시오.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

병아리GFP 신경관 이식 및 카르보시아닌 염료 DiI 주입을 사용하여 닭 배아 내신경염 세포 및 혈관의 이중 라벨링

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

연구

발생학

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

태아 마우스 심장 혈관 이미징 높은 주파수 초음파 (30/45 m h Z) 시스템을 사용 하 여

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...