Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Aguirre Lab støttes av National Heart, Lung, og Blood Institute of the National Institutes of Health under prisnummer K01HL135464 og av American Heart Association under prisnummer 19IPLOI34660342.

Alle dyr som brukes i forsøkene som det refereres til i dette papiret ble behandlet ved hjelp av dyrepleieretningslinjene til Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tidsrettet parring av C57BL6/J-mus for embryoproduksjon
<ol><li>Når mus har nådd avlsalder (6-8 uker), sette dem sammen i harem avl format (dvs. to kvinner per en mann). Sett dem opp for avl en gang på ettermiddagen eller kvelden. MERK: Mus avler ofte innen 1 t etter at lysene er ...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Denne protokollen utforsker teknikkene som er involvert i analysen av hjerteutvikling i embryonale hjerter. Noen begrensninger av denne metoden er den nødvendige fysiske fingerferdigheten for forberedende teknikker, som kan kreve praksis, og dyktighet med mikroskopavbildning. Hvis skivene oppnådd ved kryostat er rotete, vil hematoksylin og eosinfarging ikke være klare, eller hvis bildene tatt på mikroskopet har dårlig belysning, vil metoden som brukes med ImageJ ikke fungere. En begrensning av terskelfunksjonen i Im...

CHDs er den vanligste typen fødselsdefekt hos mennesker og er den ledende årsaken til fødselsdefektrelaterte dødsfall1,2,3,4,5,6. Selv om om lag 90% av nyfødte barn overlever CHD, er det ofte forbundet med betydelig sykelighet og medisinske inngrep gjennom årene, og pålegger en tung byrde på pasientenes liv og helsevesenet7,8,9,10. Utenfor rent genetiske faktorer er årsakene til CHD dårlig forstått4. Uidentifiserte årsaker står for ~ 56-66% av alle CHD-tilfeller i henhold til American Heart Association og andre kilder2,3,4,11. Kjente faktorer inkluderer genetiske mutasjoner, CNVs, de novo enkelt nukleotid varianter, og aneuploidy. Det er mistanke om at miljø- og kostholdsfaktorer også er viktige kilder som bidrar til CHD, som foreslått av epidemiologiske studier som knytter mors livsstil2,12, økonomisk deprivasjon og rase13, og ved forskning på diettfaktorer som folsyre11,14 og bioaktivt lipid retinosyre15,16. Undersøke mekanismer og årsaker til CHD og andre kardiovaskulære defekter er viktig for å utvikle forebyggende strategier og nye terapeutiske alternativer1,4,17,18,19.
Den utviklende musen er en hjørnesteinsmodell for å studere CHD hos pattedyr. Imidlertid kan noen av metodene og analysene som brukes, for eksempel desseksjoner som bevarer hjertemorfologi, analyse av utviklingsstadier og identifisering av CHD-tilknyttede defekter, være skremmende for forskere som er nye til analyse av murine hjerter. Målet med metodene som er beskrevet i denne protokollen er å tilby kvalitative og kvantitative retningslinjer for disse prosessene. Derfor forklarer vi i denne protokollen hvordan du utfører tidsdeparringer for å produsere embryoer i ønsket svangerskapsstadium, dissekere gravide kvinner for intakt hjertegjenoppretting (inkludert tilhørende vev som utstrømningskanalen), hjertefiksering og forberedelse til kryostat snitting, grunnleggende histologi metoder, kvantitative analyser av vanlige hjertefeil, og kvalitativ analyse av hjerte muskel komprimering, en vanlig forløper fenotype til noen typer CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Medfødte hjertefeil (CHD) er den vanligste typen fødselsdefekt hos mennesker, som påvirker opptil 1% av alle levende fødte. De underliggende årsakene til CHD er imidlertid fortsatt dårlig forstått. Den utviklende musen utgjør en verdifull modell for studiet av CHD, fordi hjerteutviklingsprogrammer mellom mus og mennesker er svært bevart. Protokollen beskriver i detalj hvordan man produserer museembryoer i ønsket svangerskapsstadium, metoder for å isolere og bevare hjertet for nedstrøms behandling, kvantitative metoder for å identifisere vanlige typer CHD ved histologi (f.eks. ventrikulær septal defekter, atrieseptale defekter, patentductus arteriosus), og kvantitative histomorfoometri metoder for å måle vanlige muskel komprimering fenotyper. Disse metodene artikulerer alle trinnene som er involvert i prøveforberedelse, innsamling og analyse, slik at forskere kan riktig og reproduserbart måle CHD.

Muskelkomprimeringsindeksen ble sammenlignet mellom hjerter som utviklet seg under to forskjellige miljøer, en kontroll og en eksperimentell gruppe. Disse protokollene ble brukt til å analysere komprimering av muskelvev kvantitativt, som tillot statistisk analyse. Muskelkomprimering ble vist å være betydelig redusert i eksperimentelle hjerter i forhold til embryoene som utviklet seg under ikke-eksperimentelle forhold.
Embryo...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

I denne protokollen beskriver vi prosedyrer for å kvalitativt og kvantitativt analysere utviklingsfenotyper hos mus forbundet med medfødte hjertefeil.

Analyse av medfødte hjertefeil i museembryoer ved hjelp av kvalitative og kvantitative histologiske metoder

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Denne protokollen standardiserer nye vevanalyseteknikker slik at de kan brukes mer utbredt av andre grupper som også studerer medfødte hjertefeil. Ettersom både kvalitative og kvantitative analyseteknikker har sine fordeler og ulemper, bruker denne metodikken både for å løse det bredeste spekteret av eksperimentelle spørsmål. Disse teknikkene kan ha en positiv innvirkning på kardiologi diagnostiske metoder.Patologer kan for eksempel bruke våre mikroskopiske hjertevevsanalyseteknikker mot diagnostisering av menneskelig hjertesykdom fra biopsiprøver. Denne protokollen kan brukes til utviklingsk kardiologi eller generell kardiologiforskning. Imidlertid gir disse metodene også ulike nyttige teknikker som kan brukes mot enhver vevsanalyse.For å samle embryonale dag 15 til 15,5 hjerter, sikre lemmer av en gravid dam og starter rundt urinrøret opp til brystbenet, gjør forsiktig et I-formet snitt langs overkroppen. Bruk tang i en scooping bevegelse, forsiktig løfte livmoren ut av bukhulen gripe overfladiske vev av livmoren etter behov med fine tang for å hjelpe i utvinning. Bruk saks for å frigjøre livmoren fra magen.Etter å ha slikket livmoren i iskald PBS, pin orgelet i en disseksjonsrett. Bruk saks, kutt livmoren i individuelle seksjoner som hver inneholder et eget embryo. Bruk to par fine tang, forsiktig skrelle embryoene ut av livmorvevet og plasser dem i en ny petriskål som inneholder fire grader Celsius PBS-EDTA.For å samle hjertene, legg parabolen under et dissekeringsmikroskop og bruk to par fine tang for å plassere embryoet i liggende stilling. Etter å ha stabilisert tilgangen til brystet, bruk det skarpe punktet til et andre par fine tang for å gjøre et snitt langs brystbenet på embryoet som strekker seg mellom kledningene til navlen. Gjør veldig fine og overfladiske snitt mens du gradvis arbeider mot innsiden av brysthulen, åpne embryoets underliv.Når hjertet bare blir synlig, bruk et par tang til å klemme torso litt coddled til ribbeburet for å skrelle ribbeina åpne. Ved hjelp av sidene av ett par tang, ta forsiktig tak i lungeblodkarene uten å skille vevet og trekk hjertet ut av hulrommet. Rengjør hjertet i frisk PBS-EDTA i ett til to minutter før vevet fikses i 4 % paraformaldehyd i 45 til 60 minutter.Vask deretter hjertet tre ganger i 5 til 10 minutter per vask i PBS supplert med glycin. Før du lagrer hjertene i PBS på fire grader Celsius. For å forberede hjertet for kryoseksjon, legg prøvene i et rør på 30% sukrose og PBS ved fire grader Celsius i 24 til 40 timer.Når hjertene har sunket til bunnen av røret, bruk en Pasteur Pipette med en modifisert spiss for å forsiktig overføre hvert hjerte til et stykke lofri tørk. Etter en kort lufttørking plasserer du hver prøve i individuelle optimale skjæretemperaturformer i ønsket retninger for snitting. Senk vevet i optimal skjæretemperaturmedium uten bobler.Deretter lagrer du formene ved 20 grader Celsius i opptil noen dager før vevet fryses ved 80 grader Celsius i minst 24 timer før kryoseksjon. For å oppnå kryostatdeler av prøvene, bruk frisk optimal temperaturkuttemedium for å feste vevsblokken av interesse til chucken av kryostaten og la mediet fryse til det er ugjennomsiktig hvitt. Sett inn et nytt blad og juster avstanden mellom vevsblokken og bladet slik at seksjoner kan oppnås.Trim blokken i 10 mikrometerskiver til interessepunktet er nådd. Når vevet kan observeres, bruk en liten flat pensel til å forsiktig trekke skiven mot stativet i en kontinuerlig skjærebevegelse. Når vevet er helt kuttet gjennom, bruk detaljbørsten til å klappe skiven ned flatt mot scenen.Hold avsnittet på plass i ca. 20 til 30 sekunder før du fjerner den detaljerte børsten og etterbehandling av skiven. Bruk begge pensler til å forsiktig flate skiven mot scenen hindre rulle og holde vevseksjonen mot scenen. Etter 20 til 30 sekunder, snu delen og flat den mot scenen igjen før du plasserer en elektrostatisk ladet lysbilde nær nok for stykket til å bli tiltrukket og holder seg til lysbildet uten å måtte berøre lysbildet til scenen.For å evaluere hjertevevsseksjonene for tilstedeværelse av vanlige hjertefeil, ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et kamera, få bilder på 5 til 10X og 40X forstørrelser. For hjertemuskelkomprimeringsanalyse, åpne et vev av interesse i et passende bildeanalyseprogram og sett bildet til 8-biters. Hvis du vil angi terskelen for bildet, klikker du på Bilde, Juster og Terskel og flytter den øverste linjen for å justere terskelen til bare pikslene for bakgrunnen er valgt.Deretter bruker du polygonvalgverktøyet til å tegne et interesseområde rundt vevet, og deretter klikker du Analyser, Angi målinger, Område og Begrens til terskel. Klikk analyser og mål for å måle området for de uthevede pikslene for å hente verdien for området for det negative området. Hvis du vil måle området for hele interesseområdet, klikker du Analyser, Angi målinger og fjerner merket for Begrens til terskel.Velg deretter Analyser og mål for å måle hele området i det valgte interesseområdet. For å beregne området av muskelvev, trekk området av negativ plass fra området av interesseområdet. Deretter dele området av muskelvev av området av regionen interesse for å beregne muskelkomprimering og X.Farging av vev skiver fra høstet embryonale hjerter, gir nok kontrast til å gjøre ut vev kantene, men er ikke så mørkt som å gjøre cellefunksjonene umulig å skille.I denne representative analysen ble muskelkomprimeringen observert å bli betydelig redusert i eksperimentelle hjerter i forhold til embryoene som utviklet seg under ikke-eksperimentelle forhold. Disse prøvene er verdifulle og krever lang tid å lage. Under necropsies og kryostatseksjon spesielt, sørg for å være tilsiktet om hver handling du utfører.Bevaring av vevet i Paraformaldehyd opprettholder antigenaktiviteten slik at prøvene kan brukes til tester som Aminofluorescein farging som bidrar til å identifisere patologiske årsaker funnet under morfologi vurdering. I laboratoriet vårt fikk vi kvantitativ representasjon av eksperimentelle behandlinger som kan hjelpe oss med å identifisere i hvilken grad ulike behandlinger påvirker prøvene våre. Paraformaldehyd kan fikse ethvert vev som det berører.Vær forsiktig med å alltid bruke hansker for å minimere eksponert hud og å arbeide i en filmhette når du arbeider med dette kjemikaliet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbel merking av nevrale kamceller og blodårer i kyllingembryoer ved hjelp av ChickGFP Neural Tube Grafting og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Kontrast Imaging i Mouse Embryoer hjelp Høyfrekvente ultralyd

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder for Nettopp Lokalisert Overføring av celler eller DNA i Early fostertap Mouse Embryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analyse av koronarkar i Slettet embryonale Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fosterets musen hjerte Imaging bruker høyfrekvente ultralyd (30 / 45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...