Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

O Aguirre Lab é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde o número do prêmio K01HL135464 e pela American Heart Association o prêmio número 19IPLOI34660342.

Todos os animais utilizados nos experimentos mencionados neste artigo foram tratados utilizando as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC).
1. Acasalamento cronometrado de camundongos C57BL6/J para produção de embriões
<ol><li>Uma vez que os camundongos tenham atingido a idade de reprodução (6-8 semanas), coloque-os juntos em formato de reprodução de harém (ou seja, duas fêmeas por um macho...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Este protocolo explora as técnicas envolvidas na análise do desenvolvimento cardíaco em corações embrionários. Algumas limitações deste método são a destreza física necessária para as técnicas preparatórias, que podem exigir prática, e habilidade com imagens de microscópio. Se as fatias obtidas no criostato forem bagunçadas, a coloração de hematoxilina e eosina não será clara, ou se as imagens tiradas no microscópio tiverem pouca iluminação, então o método usado com imagej não funcionará. Uma ...

Os CHDs são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos e são a principal causa de mortes relacionadas a defeitos congênitos1,2,3,4,5,6. Embora cerca de 90% das crianças recém-nascidas sobrevivam à Dra, ela é frequentemente associada a significativa morbidade e intervenções médicas ao longo dos anos, impondo um fardo pesado na vida dos pacientes e no sistema de saúde7,8,9,10. Fora fatores puramente genéticos, as causas da DCh são mal compreendidas4. As causas não identificadas representam ~56-66% de todos os casos de CHD de acordo com a American Heart Association e outras fontes2,3,4,11. Fatores bem conhecidos incluem mutações genéticas, CNVs, variantes de novo nucleotídeo único e aneuploidia. Suspeita-se que fatores ambientais e dietéticos também sejam fontes importantes que contribuem para a DCH, como sugerem estudos epidemiológicos que ligam o estilo de vida materno2,12, privação econômica e raça13, e por pesquisas sobre fatores dietéticos como o ácido fólico11,14 e o ácido retinóico lipídico bioativo15,16. Investigar os mecanismos e causas da Doença e outros defeitos cardiovasculares é importante para desenvolver estratégias preventivas e novas opções terapêuticas1,4,17,18,19.
O camundongo em desenvolvimento é um modelo fundamental para estudar CHD em mamíferos. No entanto, alguns dos métodos e análises empregados, como dissecções que preservam a morfologia cardíaca, análise de estágios de desenvolvimento e identificação de defeitos associados à ChD, podem ser assustadores para os cientistas que são novos na análise de corações murina. O objetivo dos métodos descritos neste protocolo é oferecer diretrizes qualitativas e quantitativas para esses processos. Assim, neste protocolo explicamos como realizar acasalamentos cronometrados para produzir embriões do estágio gestacional desejado, dissecar fêmeas grávidas para recuperação cardíaca intacta (incluindo tecidos associados, como o trato de saída), fixação cardíaca e preparação para secção criostato, métodos básicos de histologia, análises quantitativas de defeitos cardíacos comuns e análise qualitativa da compactação muscular cardíaca, um fenótipo precursor comum para alguns tipos de CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Os defeitos cardíacos congênitos (DCh) são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos, afetando até 1% de todos os nascidos vivos. No entanto, as causas subjacentes à DCh ainda são pouco compreendidas. O camundongo em desenvolvimento constitui um modelo valioso para o estudo da ChD, porque os programas de desenvolvimento cardíaco entre camundongos e humanos são altamente conservados. O protocolo descreve em detalhes como produzir embriões de camundongos do estágio gestacional desejado, métodos para isolar e preservar o coração para processamento a jusante, métodos quantitativos para identificar tipos comuns de CHD por histologia (por exemplo, septal ventricular defeitos, defeitos septos atrial, patente ductus arteriosus) e métodos quantitativos de histomormormetria para medir fenótipos comuns de compactação muscular. Esses métodos articulam todas as etapas envolvidas na preparação, coleta e análise da amostra, permitindo aos cientistas medir corretamente e reprodutivelmente a CHD.

O índice de compactação muscular foi comparado entre os corações em desenvolvimento em dois ambientes diferentes, um controle e um grupo experimental. Esses protocolos foram utilizados para analisar quantitativamente a compactação do tecido muscular, o que permitiu a análise estatística. A compactação muscular mostrou-se significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões que se desenvolveram em condições não experimentais.
<p class="jove_...

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Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Neste protocolo, descrevemos procedimentos para analisar qualitativamente e quantitativamente fenótipos de desenvolvimento em camundongos associados a defeitos cardíacos congênitos.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Este protocolo padroniza novas técnicas de análise de tecidos para que possam ser mais amplamente utilizadas por outros grupos que também estudam defeitos cardíacos congênitos. Como tanto as técnicas de análise qualitativa quanto quantitativa têm seus prós e contras, essa metodologia utiliza tanto para abordar a mais ampla gama de questões experimentais. Essas técnicas podem ter um impacto positivo nos métodos de diagnóstico de cardiologia.Por exemplo, os patologistas poderiam aplicar nossas técnicas de análise de tecido cardíaco microscópico para diagnosticar doenças cardíacas humanas a partir de amostras de biópsia. Este protocolo pode ser usado para pesquisa de cardiologia de desenvolvimento ou cardiologia geral. No entanto, esses métodos também fornecem várias técnicas úteis que podem ser aplicadas para qualquer análise tecidual.Para coletar corações embrionários de 15 a 15,5 corações, fixar os membros de uma represa grávida e começar ao redor da uretra até o esterno, cuidadosamente fazer uma incisão em forma de I ao longo do tronco. Usando fórceps em um movimento de colher, levante suavemente o útero da cavidade abdominal segurando os tecidos superficiais do útero conforme necessário com fórceps finos para ajudar na extração. Use uma tesoura para soltar o útero do abdômen.Depois de absorver o útero em PBS gelado, fixe o órgão em um prato de dissecção. Usando uma tesoura, corte o útero em seções individuais, cada uma contendo um embrião separado. Usando dois pares de fórceps finos, retire suavemente os embriões do tecido uterino e coloque-os em uma nova placa de Petri contendo quatro graus Celsius PBS-EDTA.Para coletar os corações, coloque o prato sob um microscópio dissecando e use dois pares de fórceps finos para posicionar o embrião na posição supina. Após estabilizar o acesso ao peito, use o ponto afiado de um segundo par de fórceps finos para fazer uma incisão ao longo do esterno do embrião estendendo-se entre as clavículas até o umbigo. Fazer incisões muito finas e superficiais enquanto trabalha gradualmente em direção ao interior da cavidade torácica, abra o abdômen do embrião.Quando o coração se tornar visível, use um par de fórceps para espremer o tronco ligeiramente preso à caixa torácica para descascar as costelas abertas. Usando as laterais de um par de fórceps, pegue suavemente os vasos sanguíneos pulmonares sem separar o tecido e puxe o coração para fora da cavidade. Limpe o coração em PBS-EDTA fresco por um a dois minutos antes de fixar o tecido em 4% Paraformaldeído por 45 a 60 minutos.Em seguida, lave o coração três vezes por 5 a 10 minutos por lavagem em PBS complementado com glicina. Antes de armazenar os corações na PBS a quatro graus Celsius. Para preparar o coração para a crioseção, coloque as amostras em um tubo de 30% de sacarose e PBS a quatro graus Celsius por 24 a 40 horas.Quando os corações tiverem afundado na parte inferior do tubo, use uma Pasta de Pipeta com uma ponta modificada para transferir cuidadosamente cada coração para um pedaço de lenço livre de fiapos. Após uma breve secagem do ar, coloque cada amostra em moldes de temperatura de corte ideais individuais nas orientações desejadas para secção. Submergir os tecidos em meio de temperatura de corte ideal sem bolhas.Em seguida, armazene os moldes a 20 graus Celsius por até alguns dias antes de congelar os tecidos a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas antes de criosectioning. Para obter seções criostatas das amostras, use um meio de corte de temperatura ideal fresco para anexar o bloco de tecido de interesse ao mandril do criostat e permitir que o meio congele até que seja branco opaco. Insira uma nova lâmina e ajuste a distância entre o bloco tecidual e a lâmina para permitir que seções sejam obtidas.Corte o bloco em fatias de 10 micrômetros até que o ponto de interesse seja atingido. Quando o tecido puder ser observado, use um pequeno pincel plano para puxar suavemente a fatia contra o suporte em um movimento de corte contínuo. Uma vez que o tecido tenha sido completamente cortado, use a escova de detalhes para acariciar a fatia plana contra o palco.Mantenha a seção no lugar por aproximadamente 20 a 30 segundos antes de remover o pincel detalhado e terminar a fatia. Use ambas as pincéis para achatar suavemente a fatia contra o palco impedindo qualquer rolamento e segure a seção do tecido contra o palco. Após 20 a 30 segundos, gire a seção e achate-a contra o palco novamente antes de colocar um slide eletroessalticamente carregado perto o suficiente para que a fatia seja atraída e adere ao slide sem ter que tocar o slide para o palco.Para avaliar as seções do tecido cardíaco para a presença de defeitos cardíacos comuns, utilizando um microscópio equipado com uma câmera, obtenha imagens a 5 a 10X e ampliações de 40X. Para análise de compactação muscular cardíaca, abra um tecido de interesse em um programa de análise de imagem apropriado e defina a imagem para 8 bits. Para definir o limiar da imagem, clique em Imagem, Ajuste e Limiar e mova a barra superior para ajustar o limiar até que apenas os pixels para o plano de fundo sejam selecionados.Em seguida, use a ferramenta de seleções de polígonos para desenhar uma região de interesse em torno do tecido e, em seguida, clique em Analisar, Definir Medidas, Área e Limite ao limiar. Clique em Analisar e Medir para medir a área dos pixels destacados para obter o valor da área do espaço negativo. Para medir a área de toda a região de interesse, clique em Analisar, Definir Medidas e desmarcar Limite para limite.Em seguida, selecione Analisar e Medir para medir toda a área da região selecionada de interesse. Para calcular a Área de tecido muscular, subtraia a Área de Espaço Negativo da Área da Região de Interesse. Em seguida, divida a Área do Tecido Muscular pela Área da Região de Interesse para calcular a compactação muscular e X.A coloração de fatias de tecido de corações embrionários colhidos, proporciona contraste suficiente para ver as bordas teciduais, mas não é tão escura a ponto de tornar as características celulares indistinguíveis.Nesta análise representativa, observou-se que a compactação muscular foi significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões desenvolvidos em condições não experimentais. Essas amostras são valiosas e requerem muito tempo para serem criadas. Durante a necropsia e a seção criostate especificamente, certifique-se de ser intencional sobre cada ação que você executar.A preservação dos tecidos em Paraformaldeído mantém a atividade de antígeno permitindo que as amostras sejam usadas para testes como a coloração de Aminofluoresceína que ajudam a identificar causas patológicas encontradas durante a avaliação da morfologia. Em nosso laboratório, obtivemos representação quantitativa de tratamentos experimentais que podem nos ajudar a identificar até que ponto diferentes tratamentos afetam nossas amostras. Paraformaldeído pode consertar qualquer tecido que toque.Tome cuidado para sempre usar luvas para minimizar a pele exposta e trabalhar em um capuz de filme sempre que trabalhar com este produto químico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Biologia do Desenvolvimento

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...