Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Лаборатория Агирре поддерживается Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номером премии K01HL135464 и Американской ассоциацией сердца под номером 19IPLOI34660342.

Все животные, используемые в экспериментах, упомянутых в настоящем документе, лечились с использованием руководящих принципов по уходу за животными Комитета по уходу и использованию животных Мичиганского государственного университета (IACUC).
1. Приуроченное спаривание мы...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Этот протокол исследует методы, связанные с анализом сердечного развития в эмбриональных сердцах. Некоторые ограничения этого метода являются необходимой физической ловкости для подготовительных методов, которые могут потребовать практики, и мастерство с микроскопом изображения. Е?...

ИБС являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и являются основной причиной смерти, связанной с врожденными дефектами1,2,3,4,5,6. Хотя около 90% новорожденных детей выживают ИБС, это часто связано со значительной заболеваемости и медицинских вмешательств на протяжении многих лет, налагая тяжелое бремя на жизнь пациентов и системы здравоохранения7,8,9,10. Вне чисто генетических факторов, причины ИКД плохо изучены4. Неизвестные причины составляют 56-66% всех случаев ИКД в соответствии с Американской ассоциацией сердца и других источников2,3,4,11. Известные факторы включают генетические мутации, CNV, de novo одиночным нуклеотидным вариантом и анеуплоидией. Он подозревается, что экологические и диетические факторы также являются важными источниками, способствующими ИБС, как это предлагается эпидемиологических исследований, связывающих материнский образ жизни2,12, экономические лишения, и расы13, а также исследования диетических факторов, таких как фолиевая кислота11,14 и биоактивных липидной ретиноиновой кислоты15,16. Изучение механизмов и причин ИБС и других сердечно-сосудистых дефектов важно разработать профилактические стратегии и новые терапевтические варианты1,4,17,18,19.
Развивающаяся мышь является краеугольной моделью для изучения ИКВ у млекопитающих. Тем не менее, некоторые из используемых методов и анализов, таких как вскрытие, сохраняющее морфологию сердца, анализ стадий развития и выявление связанных с ИБС дефектов, могут быть пугающими для ученых, которые являются новыми для анализа сердца мурина. Цель методов, описанных в данном протоколе, заключается в предоставлении качественных и количественных руководящих принципов для этих процессов. Таким образом, в этом протоколе мы объясняем, как выполнять приуроченные спаривания для получения эмбрионов желаемой гестационной стадии, вскрыть беременных женщин для нетронутого восстановления сердца (в том числе связанных тканей, таких как отток тракта), фиксации сердца и подготовки к криостат секции, основные методы гистологии, количественный анализ общих пороков сердца, и качественный анализ уплотнения мышц сердца, общий фенотип прекурсора для некоторых типов ИБС.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей, затрагивающих до 1% всех живорождений. Тем не менее, основные причины ИКД по-прежнему плохо изучены. Развивающаяся мышь представляет собой ценную модель для изучения ИКД, потому что сердечные программы развития между мышами и людьми очень сохраняются. Протокол подробно описывает, как производить эмбрионы мыши желаемой гестационной стадии, методы изоляции и сохранения сердца для обработки ниже по течению, количественные методы выявления распространенных типов ИБС по гистологии (например, желудочковая перепдал дефекты, дефекты межпредсердной перегородки, патентный артериоз протока и количественные методы гистоморфометрии для измерения общих фенотипов мышечного уплотнения. Эти методы сформулировать все шаги, связанные с подготовкой образца, сбор омывании и анализа, что позволяет ученым правильно и воспроизводимо измерять ИБС.

Индекс уплотнения мышц был сравнен между сердцами, развивающимися в двух различных средах, контрольной и экспериментальной группой. Эти протоколы использовались для количественного анализа уплотнения мышечной ткани, что позволяло статистический анализ. Было показа...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

В этом протоколе мы описываем процедуры качественного и количественного анализа фенотипов развития у мышей, связанных с врожденными пороками сердца.

Анализ врожденных пороков сердца в эмбрионах маусов с использованием квалификационных и количественных гистологических методов

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Этот протокол стандартизирует новые методы анализа тканей, чтобы они могли быть более широко использованы другими группами, которые также изучают врожденные пороки сердца. Поскольку как качественные, так и количественные методы анализа имеют свои плюсы и минусы, эта методология использует как для решения широкого круга экспериментальных вопросов. Эти методы могут оказать положительное влияние на методы кардиологической диагностики.Например, патологоанатомы могли бы применить наши микроскопические методы анализа сердечной ткани для диагностики заболеваний сердца человека из образцов биопсии. Этот протокол может быть использован для развития кардиологии или общих кардиологических исследований. Тем не менее, эти методы также обеспечивают различные полезные методы, которые могут быть применены к любому анализу тканей.Для сбора эмбриональных день от 15 до 15,5 сердца, обеспечить конечности беременной плотины и, начиная вокруг уретры до грудины, тщательно сделать I-образный разрез вдоль туловища. Используя щипцы в черпая движении, нежно поднимите uterus из брюшной полости схватая поверхностные ткани uterus по мере необходимости с точной щипцы для того чтобы помочь в извлечении. Используйте ножницы, чтобы освободить матку от живота.После замачивания матки в ледяной PBS, контактный орган в рассечение блюдо. Используя ножницы, разрежьте матку на отдельные секции, каждый из которых содержит отдельный эмбрион. Используя две пары тонких типсов, аккуратно вычистите эмбрионы из ткани матки и поместите их в новую чашку Петри, содержащую четыре градуса по Цельсию PBS-EDTA.Чтобы собрать сердца, поместите блюдо под рассечение микроскопа и использовать две пары тонких типсов, чтобы распоставить эмбрион в положение на спине. После стабилизации доступа к груди, используйте острую точку второй пары тонких типсов, чтобы сделать разрез вдоль грудины эмбриона, простирающейся между ключицы до пупка. Делая очень тонкие и поверхностные разрезы, постепенно работая в направлении внутренней части грудной полости, откройте брюшную полость эмбриона.Когда сердце просто становится видимым, использовать пару типсов, чтобы сжать туловище слегка coddled к грудной клетке, чтобы очистить ребра открытыми. Используя стороны одной пары типсов, аккуратно схватите легочные кровеносные сосуды, не отделяя ткань и вытащите сердце из полости. Очистите сердце в свежем PBS-EDTA в течение одной-двух минут, прежде чем исправить ткани в 4%Paraformaldehyde в течение 45 до 60 минут.Затем мыть сердце три раза в течение 5 до 10 минут за стирку в PBS дополняется глицином. Перед хранением сердца в PBS при четырех градусах по Цельсию. Чтобы подготовить сердце к криозеции, поместите образцы в трубку 30% сахарозы и PBS при четырех градусах по Цельсию в течение 24 до 40 часов.Когда сердца опустились на дно трубки, используйте Pasteur Pipette с измененным наконечником, чтобы тщательно передать каждое сердце к куску ворса свободной салфетки. После краткого высыхания воздуха поместите каждый образец в отдельные оптимальные формы температуры резки в желаемых ориентациях для секционирования. Погрузим ткани в оптимальную температурную среду без пузырьков.Затем храните формы при 20 градусах по Цельсию в течение нескольких дней, прежде чем заморозить ткани при 80 градусах по Цельсию, по крайней мере за 24 часа до криозирования. Для получения криостата разделы образцов, использовать свежие оптимальной температуры резки среды приложить блок ткани интерес к патрон криостата и позволяют среде заморозить, пока она не является непрозрачной белой. Вставьте новое лезвие и отрегулируйте расстояние между блоком ткани и лезвием, чтобы позволить получить секции.Обрезать блок на 10 микрометров ломтиками до тех пор, пока точка интереса не будет достигнута. Когда ткань может наблюдаться, используйте небольшую плоскую кисть, чтобы аккуратно потяните ломтик к стенду в непрерывном движении резки. После того, как ткань была полностью прорезана, используйте деталь кисти погладить ломтик вниз плашмя против сцены.Держите раздел на месте в течение примерно 20 до 30 секунд, прежде чем удалить подробную кисть и закончить ломтик. Используйте обе кисти, чтобы аккуратно сгладить ломтик против стадии предотвращения любого прокатки и провести ткань разделе против сцены. Через 20-30 секунд переверните секцию и снова сровняйте ее со сценой, прежде чем поместить электростатически заряженный слайд достаточно близко, чтобы срез был привлечен и придерживался слайда без касания слайда к сцене.Для оценки секций сердечной ткани на наличие распространенных пороков сердца, с помощью микроскопа, оснащенного камерой, получить изображения на 5 до 10X и 40X увеличения. Для анализа уплотнения сердечной мышцы откройте ткани, представляющие интерес в соответствующей программе анализа изображений, и установите изображение на 8-битное. Чтобы установить порог изображения, нажмите Изображение, Отрегулируйте и Порог и переместите верхнюю планку, чтобы настроить порог до тех пор, пока не будут выбраны только пиксели для фона.Далее используйте инструмент выбора полигонов, чтобы нарисовать область интереса вокруг ткани, а затем нажмите Анализ, Установить измерения, площадь, и предел порога. Нажмите Анализ и Мера для измерения области выделенных пикселей, чтобы получить значение области отрицательного пространства. Чтобы измерить область всего интересного региона, щелкните Analyze, Set Measurements и отвестите предел порога.Затем выберите Анализ и Измерение для измерения всей области выбранного региона интереса. Чтобы рассчитать площадь мышечной ткани, вычесть область отрицательного пространства из области области интересов. Затем разделите область мышечной ткани на область региона интересов, чтобы рассчитать уплотнение мышц и X.The окрашивание ломтиков тканей из собранных эмбриональных сердец, обеспечивает достаточно контраста, чтобы разработать края ткани, но не так темно, чтобы сделать клеточные особенности неотличимыми.В этом репрезентативном анализе было отмечено, что уплотнение мышц значительно снижается в экспериментальных сердцах по сравнению с эмбрионами, которые развивались в неиспециализных условиях. Эти образцы являются ценными и требуют длительного времени для создания. Во время некропсии и криостата секции конкретно, убедитесь, что преднамеренное о каждом действии вы выполняете.Сохранение тканей в Параформальдегиде поддерживает антигенную активность, позволяя использовать образцы для таких тестов, как окрашивание аминофлюоресцента, которые помогают выявить патологические причины, обнаруженные в ходе оценки морфологии. В нашей лаборатории мы получили количественное представление экспериментальных методов лечения, которые могут помочь нам определить, в какой степени различные методы лечения влияют на наши образцы. Параформальдегид может исправить любую ткань, к ней прикасается.Позаботьтесь, чтобы всегда носить перчатки, чтобы свести к минимуму подвергаются кожи и работать в капюшоне пленки, когда работает с этим химическим веществом.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Двойная маркировка нервных клеток Креста и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах сиспользованием Чик GFP нейронной трубки прививки и карбоцианина красителя DiI инъекции

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Методы Именно локализованного передачи ячеек или ДНК в начале постимплантационных эмбрионов мыши

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Анализ коронарных сосудов сердца в Сбрасывается эмбриональных сердец

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Плода мышь сердечнососудистой визуализации с помощью системы высокой частоты ультразвука (30/45 МГц)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...