Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

El Laboratorio Aguirre es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K01HL135464 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342.

Todos los animales utilizados en los experimentos a los que se hace referencia en este documento fueron tratados utilizando las directrices de cuidado animal del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC).
1. Acoplamiento cronometrado de ratones C57BL6/J para la producción de embriones
<ol><li>Una vez que los ratones hayan alcanzado la edad reproductiva (6-8 semanas), colóquelos en formato de cría de harem (es decir, dos hembras por ca...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Este protocolo explora las técnicas involucradas en el análisis del desarrollo cardíaco en corazones embrionarios. Algunas limitaciones de este método son la destreza física requerida para las técnicas preparatorias, que pueden requerir práctica, y habilidad con imágenes de microscopio. Si las rodajas obtenidas en el criostato son desordenadas, la tinción de hematoxilina y eosina no será clara, o si las imágenes tomadas en el microscopio tienen mala iluminación, entonces el método utilizado con ImageJ no fun...

Las CHD son el tipo más común de defecto de nacimiento en humanos y son la principal causa de muertes relacionadas con defectos de nacimiento1,2,3,4,5,6. Aunque alrededor del 90% de los niños recién nacidos sobreviven a la enfermedad coronaria, con frecuencia se asocia con una morbilidad significativa e intervenciones médicas a lo largo de los años, imponiendo una pesada carga sobre la vida de los pacientes y el sistema de salud7,8,9,10. Fuera de los factores puramente genéticos, las causas de la ENFERMEDAD se entienden mal4. Las causas no identificadas representan el 56-66% de todos los casos de CHD según la Asociación Americana del Corazón y otras fuentes2,3,4,11. Los factores bien conocidos incluyen mutaciones genéticas, CNVs, variantes de nucleótidos individuales de novo y aneuploidía. Se sospecha que los factores ambientales y dietéticos son también fuentes importantes que contribuyen a la enfermedad de Son obligatorias, como sugieren los estudios epidemiológicos que vinculan el estilo de vida materno2,12,la privación económica y la carrera13,y mediante la investigación en factores dietéticos como el ácido fólico11,14 y el ácido retinoico lipídico bioactivo15,16. Investigar los mecanismos y causas de la ENFERMEDAD y otros defectos cardiovasculares es importante desarrollar estrategias preventivas y nuevas opciones terapéuticas1,4,17,18,19.
El ratón en desarrollo es un modelo de piedra angular para el estudio de la CHD en mamíferos. Sin embargo, algunos de los métodos y análisis empleados, como las disecciones que preservan la morfología del corazón, el análisis de las etapas del desarrollo y la identificación de defectos asociados a la CHD, pueden ser desalentadores para los científicos que son nuevos en el análisis de los corazones murinos. El objetivo de los métodos descritos en este protocolo es ofrecer directrices cualitativas y cuantitativas para estos procesos. Así, en este protocolo explicamos cómo realizar aparejos cronometrados para producir embriones de la etapa gestacional deseada, diseccionar a las hembras embarazadas para la recuperación intacta del corazón (incluyendo los tejidos asociados como el tracto de salida), la fijación del corazón y la preparación para seccionamiento de criostatos, métodos de histología básica, análisis cuantitativos de defectos cardíacos comunes y análisis cualitativos de la compactación del músculo cardíaco, un fenotipo precursor común para algunos tipos de CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos, afectando hasta el 1% de todos los nacimientos vivos. Sin embargo, las causas subyacentes de la ENFERMEDAD de Haya todavía se entienden mal. El ratón en desarrollo constituye un modelo valioso para el estudio de la CHD, ya que los programas de desarrollo cardíaco entre ratones y humanos están altamente conservados. El protocolo describe en detalle cómo producir embriones de ratón de la etapa gestacional deseada, métodos para aislar y preservar el corazón para el procesamiento posterior, métodos cuantitativos para identificar tipos comunes de CHD por histología (por ejemplo, septal ventricular defectos, defectos interauriculares, conducto arterial patentado) y métodos cuantitativos de histomorfometría para medir fenotipos comunes de compactación muscular. Estos métodos articulan todos los pasos involucrados en la preparación, recolección y análisis de muestras, permitiendo a los científicos medir correctamente y reproduciblemente la CHD.

El índice de compactación muscular se comparó entre corazones que se desarrollaron bajo dos ambientes diferentes, un control y un grupo experimental. Estos protocolos se utilizaron para analizar cuantitativamente la compactación del tejido muscular, lo que permitió el análisis estadístico. Se demostró que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.

Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Este protocolo estandariza las nuevas técnicas de análisis de tejidos para que puedan ser más utilizadas por otros grupos que también estudian defectos cardíacos congénitos. Como las técnicas de análisis cualitativo y cuantitativo tienen sus pros y sus contras, esta metodología utiliza ambas para abordar la más amplia gama de preguntas experimentales. Estas técnicas pueden tener un impacto positivo en los métodos de diagnóstico de cardiología.Por ejemplo, los patólogos podrían aplicar nuestras técnicas microscópicas de análisis de tejido cardíaco para diagnosticar enfermedades cardíacas humanas a partir de muestras de biopsia. Este protocolo se puede utilizar para la cardiología del desarrollo o la investigación general de cardiología. Sin embargo, estos métodos también proporcionan varias técnicas útiles que se pueden aplicar hacia cualquier análisis de tejido.Para recoger el día embrionario de 15 a 15,5 corazones, asegurar las extremidades de una presa embarazada y comenzando alrededor de la uretra hasta el esternón, cuidadosamente hacer una incisión en forma de I a lo largo del torso. Usando fórceps en un movimiento de scooping, levante suavemente el útero fuera de la cavidad abdominal agarrando los tejidos superficiales del útero según sea necesario con fórceps finos para ayudar en la extracción. Use tijeras para liberar el útero del abdomen.Después de remojar el útero en PBS helado, coloca el órgano en una bandeja de disección. Usando tijeras, corte el útero en secciones individuales cada una que contenga un embrión separado. Usando dos pares de fórceps finos, pela suavemente los embriones del tejido uterino y colóquelos en un nuevo plato de Petri que contenga cuatro grados Celsius PBS-EDTA.Para recoger los corazones, coloque el plato bajo un microscopio diseccionado y utilice dos pares de fórceps finos para colocar el embrión en la posición supina. Después de estabilizar el acceso al tórax, utilice el punto afilado de un segundo par de fórceps finos para hacer una incisión a lo largo del esternón del embrión que se extiende entre las clavículas hasta el ombligo. Haciendo incisiones muy finas y superficiales mientras se trabaja gradualmente hacia el interior de la cavidad torácica, abra el abdomen del embrión.Cuando el corazón se haga visible, usa un par de fórceps para apretar el torso ligeramente acodado a la caja torácica para pelar las costillas abiertas. Usando los lados de un par de fórceps, agarra suavemente los vasos sanguíneos pulmonares sin separar el tejido y saca el corazón de la cavidad. Limpie el corazón en PBS-EDTA fresco durante uno o dos minutos antes de fijar el tejido en 4%Paraformaldehído durante 45 a 60 minutos.Luego, lave el corazón tres veces durante 5 a 10 minutos por lavado en PBS complementado con glicina. Antes de almacenar los corazones en PBS a cuatro grados centígrados. Para preparar el corazón para la criocisión, coloque las muestras en un tubo de 30% sacarosa y PBS a cuatro grados centígrados durante 24 a 40 horas.Cuando los corazones se hayan hundido en la parte inferior del tubo, utilice una pipeta Pasteur con una punta modificada para transferir cuidadosamente cada corazón a un pedazo de pelusa libre de pelusas. Después de un breve secado al aire, coloque cada muestra en moldes de temperatura de corte óptimos individuales en las orientaciones deseadas para el corte. Sumerja los tejidos en un medio de temperatura de corte óptimo sin burbujas.Luego, almacene los moldes a 20 grados Celsius hasta unos días antes de congelar los tejidos a 80 grados Celsius durante al menos 24 horas antes de la criocciones. Para obtener secciones de criostato de las muestras, utilice un medio de corte de temperatura óptimo fresco para unir el bloque tisular de interés al mandril del criostato y permitir que el medio se congele hasta que sea blanco opaco. Inserte una nueva cuchilla y ajuste la distancia entre el bloque de tejido y la hoja para permitir la obtención de secciones.Recorte el bloque en rodajas de 10 micrómetros hasta que se alcance el punto de interés. Cuando se pueda observar el tejido, utilice un pequeño pincel plano para tirar suavemente de la rebanada contra el soporte en un movimiento de corte continuo. Una vez que el tejido se ha cortado por completo, utilice el cepillo de detalle para acariciar la rebanada hacia abajo contra el escenario.Mantenga la sección en su lugar durante aproximadamente 20 a 30 segundos antes de retirar el cepillo detallado y terminar el corte. Utilice ambos pinceles para aplanar suavemente la rebanada contra el escenario evitando cualquier balanceo y sostenga la sección del tejido contra la etapa. Después de 20 a 30 segundos, voltea la sección y aplana la parte contra el escenario de nuevo antes de colocar una diapositiva cargada electrostáticamente lo suficientemente cerca como para que la rebanada sea atraída y se adhiera a la diapositiva sin tener que tocar la diapositiva al escenario.Para evaluar las secciones del tejido cardíaco para detectar la presencia de defectos cardíacos comunes, utilizando un microscopio equipado con una cámara, obtenga imágenes de aumentos de 5 a 10X y 40X. Para el análisis de compactación muscular cardíaca, abra un tejido de interés en un programa de software de análisis de imágenes adecuado y establezca la imagen en 8 bits. Para establecer el umbral de la imagen, haga clic en Imagen, Ajustar y Umbral y mueva la barra superior para ajustar el umbral hasta que solo se seleccionen los píxeles del fondo.A continuación, utilice la herramienta selecciones de polígonos para dibujar una región de interés alrededor del tejido y, a continuación, haga clic en Analizar, Establecer medidas, área y Límite hasta umbral. Haga clic en Analizar y medir para medir el área de los píxeles resaltados para obtener el valor del área del espacio negativo. Para medir el área de toda la región de interés, haga clic en Analizar, Establecer medidas y anule la selección de Limitar al umbral.A continuación, seleccione Analizar y medir para medir toda el área de la región de interés seleccionada. Para calcular el área del tejido muscular, reste el área de espacio negativo del área de la región de interés. A continuación, dividir el área del tejido muscular por el área de la región de interés para calcular la compactación muscular y X.La tinción de las rebanadas de tejido de los corazones embrionarios cosechados, proporciona suficiente contraste para hacer los bordes del tejido, pero no es tan oscuro como para hacer que las características celulares indistinguibles.En este análisis representativo, se observó que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales. Estas muestras son valiosas y requieren mucho tiempo para crear. Durante las necropsias y la sección del criostato específicamente, asegúrate de ser intencional sobre cada acción que realices.La preservación de los tejidos en Paraformaldehído mantiene la actividad del antígeno permitiendo que las muestras se utilicen para pruebas como la tinción de aminofluoresceína que ayudan a identificar las causas patológicas encontradas durante la evaluación de la morfología. En nuestro laboratorio, obtuvimos representación cuantitativa de tratamientos experimentales que nos pueden ayudar a identificar el grado en que diferentes tratamientos afectan a nuestras muestras. El paraformaldehído puede fijar cualquier tejido que toque.Tenga cuidado de usar siempre guantes para minimizar la piel expuesta y trabajar en una capucha de película cada vez que trabaje con este producto químico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...