Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Aguirre Lab stöds av National Heart, Lung och Blood Institute of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer K01HL135464 och av American Heart Association under tilldelningnummer 19IPLOI34660342.

Alla djur som används i de experiment som refererades i detta dokument behandlades med hjälp av riktlinjerna för djurvård från Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tidsbegränsad parning av C57BL6/J möss för embryoproduktion
<ol><li>När möss har uppnått häckningsålder (6-8 veckor), sätta ihop dem i harem avelformat (dvs. två honor per en hane). Ställ upp dem för avel någon gång på eftermiddagen eller kvällen. OBS: Möss häc...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Detta protokoll utforskar de tekniker som ingår i analysen av hjärtutveckling i embryonala hjärtan. Vissa begränsningar av denna metod är den nödvändiga fysiska fingerfärdighet för de förberedande teknikerna, vilket kan kräva övning, och skicklighet med mikroskop avbildning. Om de skivor som erhålls vid kryostaten är rörigt, kommer hematoxylin och eosin färgning inte vara tydlig, eller om bilderna som tas vid mikroskopet har dålig belysning, då den metod som används med ImageJ kommer inte att fungera. ...

ChDs är den vanligaste typen av missbildning hos människor och är den främsta orsaken till missbildningsrelaterade dödsfall1,2,3,4,5,6. Även om cirka 90% av nyfödda barn överlever CHD, är det ofta förknippas med betydande sjuklighet och medicinska ingrepp under åren, vilket innebär en tung börda för patienternas liv och hälso-och sjukvårdssystemet7,8,9,10. Utanför rent genetiska faktorer, orsakerna till CHD är dåligt förstådda4. Oidentifierade orsaker står för ~ 56-66% av alla CHD fall enligt American Heart Association och andra källor2,3,4,11. Välkända faktorer inkluderar genetiska mutationer, CNVs, de novo single nucleotide varianter och aneuploidy. Man misstänker att miljö- och kostfaktorer också är viktiga källor som bidrar till CHD, vilket föreslagits av epidemiologiska studier som kopplar samman moderns livsstil2,12, ekonomisk fattigdom och ras13, och genom forskning om kostfaktorer som folsyra11,14 och bioaktiv lipidretinsyra15,16. Att undersöka mekanismer och orsaker till CHD och andra kardiovaskulära defekter är viktigt att utveckla förebyggande strategier och nya terapeutiska alternativ1,4,17,18,19.
Den utvecklande musen är en hörnstensmodell för att studera CHD hos däggdjur. Men några av de metoder och analyser som används, såsom dissektioner bevara hjärtmorfologi, analys av utvecklingsstadier, och identifiering av CHD-associerade defekter, kan vara skrämmande för forskare som är nya för analys av murine hjärtan. Målet med de metoder som beskrivs i detta protokoll är att erbjuda kvalitativa och kvantitativa riktlinjer för dessa processer. Således, i detta protokoll förklarar vi hur man utför tidsbundna parningar för att producera embryon från önskat graviditetslängd, dissekera gravida kvinnor för intakt hjärtåterhämtning (inklusive tillhörande vävnader såsom utflödeskanalen), hjärtfixering och förberedelse för kryostat snittning, grundläggande histologi metoder, kvantitativa analyser av vanliga hjärtfel, och kvalitativ analys av hjärtmuskelpackning, en gemensam föregångare fenotyp till vissa typer av CHD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Medfödda hjärtfel (CHD) är den vanligaste typen av missbildning hos människor, som påverkar upp till 1% av alla levande födda. De bakomliggande orsakerna till chd är dock fortfarande dåligt förstådda. Den utvecklande musen utgör en värdefull modell för studiet av CHD, eftersom hjärt utvecklingsprogram mellan möss och människor är mycket bevarade. Protokollet beskriver i detalj hur man producerar musembryon av önskat graviditetslängd, metoder för att isolera och bevara hjärtat för nedströmsbearbetning, kvantitativa metoder för att identifiera vanliga typer av CHD genom histologi (t.ex. Ventrikulärt septal defekter, förmaksflimmer septal defekter, patent ductus arteriosus), och kvantitativa histomorphometry metoder för att mäta vanliga muskulös packning fenotyper. Dessa metoder artikulera alla steg som deltar i provberedning, insamling och analys, så att forskarna kan korrekt och reproducerbart mäta CHD.

Muskelkompakteringsindexet jämfördes mellan hjärtan som utvecklades under två olika miljöer, en kontroll och en experimentell grupp. Dessa protokoll användes för att analysera packning av muskelvävnad kvantitativt, vilket möjliggjorde statistisk analys. Muskelpackning visade sig vara signifikant reducerad i de experimentella hjärtana i förhållande till de embryon som utvecklats under icke-experimentella förhållanden.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

I detta protokoll beskriver vi procedurer för att kvalitativt och kvantitativt analysera utvecklingsfenotyper hos möss som är associerade med medfödda hjärtfel.

Analys av medfödda hjärtfel i musembryon med hjälp av kvalitativa och kvantitativa histologiska metoder

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Detta protokoll standardiserar nya vävnadsanalystekniker så att de kan användas i större utsträckning av andra grupper som också studerar medfödda hjärtfel. Eftersom både kvalitativa och kvantitativa analystekniker har sina för- och nackdelar, använder denna metodik både för att ta itu med det bredaste utbudet av experimentella frågor. Dessa tekniker kan ha en positiv inverkan på kardiologi diagnostiska metoder.Patologer skulle till exempel kunna tillämpa våra mikroskopiska metoder för analys av hjärtvävnad för att diagnostisera sjukdomar hos människor från biopsiprover. Detta protokoll kan användas för utvecklings- kardiologi eller allmän kardiologiforskning. Dessa metoder ger dock också olika användbara tekniker som kan tillämpas mot någon vävnadsanalys.För att samla embryonala dag 15 till 15,5 hjärtan, säkra lemmarna i en gravid damm och börjar runt urinröret upp till bröstbenet, gör försiktigt ett I-format snitt längs bålen. Använda tång i en ösa rörelse, försiktigt lyfta livmodern ur bukhålan gripa de ytliga vävnaderna i livmodern som behövs med fina tång för att hjälpa i extraktionen. Använd sax för att frigöra livmodern från buken.Efter blötläggning av livmodern i iskall PBS, stift organet i en dissektion skålen. Med hjälp av sax, skär livmodern i enskilda sektioner som var och en innehåller ett separat embryo. Med hjälp av två par fina tärnor, försiktigt skala embryon ur livmodervävnaden och placera dem i en ny Petriskål som innehåller fyra grader Celsius PBS-EDTA.För att samla hjärtan, placera skålen under en dissekera mikroskop och använda två par fina tlykningar för att placera embryot i ryggläge. Efter stabiliserande tillgång till bröstet, använd den skarpa punkten av ett andra par fina tång för att göra ett snitt längs bröstbenet av embryot sträcker sig mellan nyckelbenen till naveln. Göra mycket fina och ytliga snitt samtidigt som gradvis arbetar mot insidan av brösthålan, öppna embryots buk.När hjärtat bara blir synlig, använd ett par tslag för att pressa bålen något coddled till bröstkorgen för att skala revbenen öppna. Använd sidorna av ett par tärna, ta försiktigt tag i lungblodkärlen utan att separera vävnaden och dra ut hjärtat ur hålrummet. Rengör hjärtat i färsk PBS-EDTA i en till två minuter innan du fixerar vävnaden i 4%Paraformaldehyd i 45 till 60 minuter.Sedan, tvätta hjärtat tre gånger i 5 till 10 minuter per tvätt i PBS kompletteras med glycin. Innan du lagrar hjärtan i PBS vid fyra grader Celsius. För att förbereda hjärtat för kryosektion, placera proverna i ett rör av 30%sackaros och PBS vid fyra grader Celsius i 24 till 40 timmar.När hjärtan har sjunkit till botten av röret, använd en Pasteur Pipette med en modifierad spets för att försiktigt överföra varje hjärta till en bit ludd gratis torka. Efter en kort lufttorkning, placera varje prov i enskilda optimala skärtemperaturformar i de önskade orienteringarna för snittning. Submerge vävnaderna i optimalt skärtemperaturmedium utan bubblor.Sedan, lagra formar på 20 grader Celsius i upp till ett par dagar innan frysning av vävnaderna på 80 grader Celsius i minst 24 timmar före kryosektion. För att erhålla kryostatpartier av proverna, använd färskt optimalt temperaturskär medium för att fästa vävnadsblocket av intresse till kryostatens chuck och låt mediet frysa tills det är ogenomskinligt vitt. Sätt in ett nytt blad och justera avståndet mellan vävnadsblocket och bladet för att tillåta att sektioner erhålls.Trimma blocket i 10 mikrometerskivor tills den punkt av intresse nås. När vävnaden kan observeras, använd en liten platt pensel för att försiktigt dra skivan mot stativet i en kontinuerlig skärrörelse. När vävnaden har skurits igenom helt, använd detaljborsten för att klappa ner skivan platt mot scenen.Håll sektionen på plats i cirka 20 till 30 sekunder innan du tar bort den detaljerade borsten och avslutar skivan. Använd båda penslar för att försiktigt platta skivan mot scenen förhindrar rullande och hålla vävnaden avsnitt mot scenen. Efter 20 till 30 sekunder, vänd avsnittet och platta till den mot scenen igen innan du placerar en elektrostatiskt laddad bild tillräckligt nära för att skivan ska lockas och följ bilden utan att behöva röra bilden till scenen.För att utvärdera hjärtvävnadssektionerna för förekomst av vanliga hjärtfel, med hjälp av ett mikroskop utrustat med en kamera, erhålla bilder på 5 till 10X och 40X förstoringar. För hjärt muskelkompak tionsanalys, öppna en vävnad av intresse i en lämplig bild analys program och ställa in bilden till 8-bitars. Om du vill ange tröskeln för bilden klickar du på Bild, Justera och Tröskelvärde och flyttar överstapeln för att justera tröskelvärdet tills endast pixlarna för bakgrunden har markerats.Därefter använder polygonval verktyget för att rita en region av intresse runt vävnaden klicka sedan på Analysera, Ange mått, Område och Begränsa till tröskelvärde. Klicka på Analysera och mät om du vill mäta området för de markerade pixlarna för att få värdet för området i det negativa utrymmet. Om du vill mäta området för hela området av intresse klickar du på Analysera, Ange mått och avmarkerar Gräns till tröskelvärde.Välj sedan Analysera och mäta för att mäta hela området i den valda regionen av intresse. Om du vill beräkna området för muskelvävnad subtrahera området negativt utrymme från området i regionen av intresse. Sedan dela området muskelvävnad av området i regionen intresse för att beräkna muskelkompakton och X.The färgning av vävnad skivor från skördade embryonala hjärtan, ger tillräckligt med kontrast för att urspa ut vävnadskanterna, men är inte så mörkt att göra cellen funktioner omöjlig att skilja.I denna representativa analys observerades muskelkompaktionen för att minskas avsevärt i de experimentella hjärtana i förhållande till embryona som utvecklades under icke-experimentella förhållanden. Dessa prover är värdefulla och kräver en lång tid för att skapa. Under obduktioner och kryostat snittning specifikt, se till att vara avsiktlig om varje åtgärd du utför.Bevara vävnaderna i Paraformaldehyde upprätthåller antigen aktivitet tillåter proverna som skall användas för tester som Aminofluorescein färgning som hjälper till att identifiera patologiska orsaker som finns under morfologi bedömning. I vårt labb fick vi kvantitativ representation av experimentella behandlingar som kan hjälpa oss att identifiera i vilken grad olika behandlingar påverkar våra prover. Paraformaldehyd kan fixa någon vävnad som den rör vid.Var noga med att alltid bära handskar för att minimera exponerad hud och att arbeta i en film huva närhelst arbetar med denna kemikalie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl i kycklingembryon med chickGFP neuralrör ympning och karbalybocyanin färgämne dii injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Contrast Imaging i musembryon Använda Högfrekvent Ultraljud

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder för Exakt Lokaliserad Överföring av celler eller DNA i tidig postimplantationsförlust musembryon

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analys av kranskärlen i clearade embryonala hjärtan

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fostrets mus hjärt Imaging använder ett högfrekvent ultraljud (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...