Name: analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Aguirre Lab Ulusal Kalp tarafından desteklenir, Akciğer, ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri ödül numarası K01HL135464 altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından ödül numarası 19IPLOI34660342 altında.

Bu makalede atıfta bulunulan deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hayvan bakım yönergeleri kullanılarak tedavi edildi.
1. Embriyo üretimi için C57BL6/J farelerinin zamanlı kenetlemesi
<ol><li>Fareler üreme yaşına (6-8 hafta) ulaştıktan sonra, onları harem üreme biçiminde (yani bir erkek başına iki dişi) bir araya getirin. Öğleden sonra ya da akşam ıslah ıslahı için ayarlayın. NOT: ...

<ol>
	<li>Kathiresan, S., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+cardiovascular+disease.">Genetics of human cardiovascular disease.</a> Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).</li><li>Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Heart+Disease:+Causes,+Diagnosis,+Symptoms,+and+Treatments.">Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).</li><li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: The glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Pelech, A. N., Broeckel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+etiologies+of+congenital+heart+diseases.">Toward the etiologies of congenital heart diseases.</a> Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).</li><li>Zaidi, S., Brueckner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Genomics+of+Congenital+Heart+Disease.">Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).</li><li>Kenny, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+in+the+single+ventricle+population.">Transplantation in the single ventricle population.</a> Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).</li><li>Navaratnam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Induced+Systemic+Venous+Hypertension+in+the+Fontan+Circulation.">Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation.</a> The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).</li><li>De Leval, M. R., Deanfield, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+Fontan+palliation.">Four decades of Fontan palliation.</a> Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).</li><li>Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+structure-function+relations+in+health+and+disease:+part+II.+Clinical+considerations.">Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).</li><li>Jenkins, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninherited+risk+factors+and+congenital+cardiovascular+defects:+Current+knowledge+-+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association+Council+on+Cardiovascular+Disease+in+the+Young.">Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young.</a> Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).</li><li>Botto, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+rate+of+selected+congenital+heart+defects+with+better+maternal+diet+quality+:+a+population-based+study.">Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study.</a> Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).</li><li>Knowles, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+and+socioeconomic+variation+in+incidence+of+congenital+heart+defects.">Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects.</a> Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Folic+Acid+Supplementation+and+the+Risk+of+Congenital+Heart+Defects+in+Offspring+:+A+Meta-Analysis+of+Epidemiological+Observational+Studies.">Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies.</a> Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+retinoic+acid+levels+and+the+development+of+metabolic+syndrome.">Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).</li><li>Kurian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+long+noncoding+RNAs+underlying+vertebrate+cardiovascular+development.">Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development.</a> Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).</li><li>Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+toward+heart+regeneration:+Stem+cells+and+beyond.">Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+or+breaking+the+heart:+from+lineage+determination+to+morphogenesis.">Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis.</a> Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>. Stage Definition Available from: <a target="_blank" href="https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html">https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html</a> (1998)</li><li>Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: <a target="_blank" href="https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html">https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html</a> (2017)</li><li>. Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf</a> (2007)</li><li>MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+ejection+fraction+is+determined+by+both+global+myocardial+strain+and+wall+thickness.">Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness.</a> IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).</li><li>Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+Ventricular+Noncompaction+Cardiomyopathy.">Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy.</a> Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).</li><li>Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+left+ventricular+trabeculae+using+cardiovascular+magnetic+resonance+for+the+diagnosis+of+left+ventricular+non-compaction:+evaluation+of+trabecular+volume+and+refined+semi-quantitative+criteria.">Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria.</a> Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).</li></ol>

Bu protokol, embriyonik kalplerde kardiyak gelişimanalizinde yer alan teknikleri inceler. Bu yöntemin bazı sınırlamaları, pratik gerektirebilir hazırlık teknikleri için gerekli fiziksel el becerisi ve mikroskop görüntüleme ile beceri vardır. Kriyostatta elde edilen dilimler dağınıksa, hematoksilin ve eozin boyama net olmayacaktır veya mikroskopta çekilen görüntülerde kötü Aydınlatma varsa, ImageJ ile kullanılan yöntem çalışmaz. ImageJ yazılımının eşik özelliğinin bir sınırlaması, pi...

KDE'ler insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve doğum kusuruna bağlı ölümlerin önde gelennedenidir 1,2,3,4,5,6. Yenidoğan çocukların yaklaşık% 90 ChD hayatta olmasına rağmen, sık sık hastalarınyaşamları ve sağlık sistemi7,8,9,10ağır bir yük empoze, yıllar içinde önemli morbidite ve tıbbi müdahaleler ile ilişkilidir. Tamamen genetik faktörlerin dışında, KCHD nedenleri kötü anlaşılmaktadır4. Tanımlanamayan nedenler Amerikan Kalp Derneği ve diğer kaynaklara göre tüm CHD olgularının ~ 56-66% için hesap2,3,4,11. Bilinen faktörler genetik mutasyonlar, CNVs, de novo tek nükleotid varyantları ve aneuploidi içerir. Bu çevresel ve diyet faktörleri de CHD katkıda önemli kaynaklar olduğundan şüphelenilmektedir, anne yaşam tarzı bağlayan epidemiyolojik çalışmalar tarafından önerilen2,12, ekonomik yoksunluk, ve ırk13, ve folik asit gibi diyet faktörleri içine araştırma tarafından11,14 ve biyoaktif lipid retinoik asit15,16. KCHD ve diğer kardiyovasküler defektlerin mekanizmaları ve nedenlerini araştırmak önleyici stratejiler ve yeni tedavi seçenekleri1,4,17,18,19geliştirmek için önemlidir.
Gelişmekte olan fare memelilerde CHD eğitimi için bir mihenk taşıdır modelidir. Ancak, kalp morfolojisini koruyan diseksiyonlar, gelişimevrelerinin analizi ve ChD ile ilişkili kusurların belirlenmesi gibi bazı yöntem ve analizler, murine kalpanalizinde yeni olan bilim adamları için yıldırıcı olabilir. Bu protokolde açıklanan yöntemlerin amacı, bu süreçler için nitel ve nicel yönergeler sunmaktır. Böylece, bu protokolde istenilen gebelik evresinde embriyo üretmek için zamanlanmış mikatların nasıl yapılacağını, sağlam kalp iyileşmesi için gebe leri nasıl inceleyeceğimizi (çıkış yolu gibi ilişkili dokular dahil), kalp fiksasyonu ve kriyostat kesit, temel histoloji yöntemleri, ortak kalp defektlerinin nicel analizleri ve kalp kası sıkıştırmasının nitel analizi, bazı KH türlerinin ortak öncüfenoti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>C57BL/6J - stock 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Staining Jars (x6)</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25457-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24X50MM #1.5</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat - Leica CM3050S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dish(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 50930381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 03989-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># 410225-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8 Software</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># MHS16-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tip(s) - p200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02707448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel Software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CkX53 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brushes (at least 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 0215014601</td>
			<td>Make into 4% solution (dissolved in PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette(s)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td># 70011044</td>
			<td>Dilute from 10x to 1x before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS1602TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td># MS105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 10161-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 21909-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mold</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 100500-224</td>
			<td>For OCT molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td># S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td># 14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td># 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Scale</td>
			<td>Acculab</td>
			<td>VIC 5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>214736-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of congenital heart defects in mouse embryos using qualitative and quantitative histological methods

Konjenital kalp defektleri (KDE) insanlarda en sık görülen doğum kusuru türüdür ve tüm canlı doğumların %1'ini etkilemez. Ancak, CHD için altta yatan nedenler hala kötü anlaşılmaktadır. Gelişmekte olan fare CHD çalışması için değerli bir model oluşturmaktadır, fareler ve insanlar arasında kardiyak gelişim programları son derece korunur çünkü. Protokol, istenilen gebelik evresinde fare embriyolarının nasıl üretilebildiğini, kalbi aşağı işleme için izole etme ve koruma yöntemlerini, histoloji ile yaygın chd türlerini belirlemek için nicel yöntemlerin (örn. ventriküler septal) nasıl üretilmelerini ayrıntılı olarak açıklar. defektleri, atriyal septal defektler, patent ductus arteriosus) ve ortak kas sıkıştırma fenotiplerini ölçmek için kantitatif histomorfometri yöntemleri. Bu yöntemler, bilim adamlarının CHD'yi doğru ve tekrarlı bir şekilde ölçmelerine olanak tanıyan numune hazırlama, toplama ve analiz ile ilgili tüm adımları ifade edeyim.

Kas sıkıştırma indeksi iki farklı ortam, bir kontrol ve deneysel bir grup altında gelişen kalpler arasında karşılaştırıldı. Bu protokoller, istatistiksel analize izin veren kas dokusunun sıkıştırmasını kantitatif olarak analiz etmek için kullanılmıştır. Kas sıkıştırma deneysel olmayan koşullarda geliştirilen embriyolara göre deneysel kalplerde önemli ölçüde azalmış olduğu gösterilmiştir.
...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods at JoVE.com

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Bu protokolde, konjenital kalp defektleri ile ilişkili farelerde gelişimsel fenotipleri nitel ve nicel olarak analiz etme prosedürlerini açıklıyoruz.

Nitel ve Nicel Histolojik Yöntemlerle Fare Embriyolarında Konjenital Kalp Defektlerinin Analizi

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Bu protokol, konjenital kalp defektlerini de inceleyen diğer gruplar tarafından daha yaygın olarak kullanılabilmesi için yeni doku analizi tekniklerini standartlaştırarak, yeni doku analizi tekniklerini standartlaştırarak, yeni doku analiz tekniklerini standartlaştırabilir. Hem nitel hem de nicel analiz tekniklerinin artıları ve eksileri olduğundan, bu metodoloji hem en geniş deneysel soru yelpazesini ele almak için hem de kullanır. Bu teknikler kardiyoloji tanı yöntemleri üzerinde olumlu bir etkiye sahip olabilir.Örneğin, patologlar biyopsi örneklerinden insan kalp hastalığı tanısı doğru mikroskobik kardiyak doku analizi teknikleri uygulayabilirsiniz. Bu protokol gelişimsel kardiyoloji veya genel kardiyoloji araştırmaları için kullanılabilir. Ancak, bu yöntemler de herhangi bir doku analizi doğru uygulanabilir çeşitli yararlı teknikler sağlar.Embriyonik gün 15 ila 15,5 kalpleri toplamak için, hamile bir baraj ın uzuvları güvenli ve göğüs kadar üretra etrafında başlayan, dikkatle gövde boyunca bir I şeklinde kesi yapmak. Bir kepçe hareket forseps kullanarak, yavaşça karın boşluğundan rahim dışarı kaldırma karın boşluğundan çıkarma yardımcı olmak için ince forseps ile gerekli olarak rahim yüzeysel dokuları kavrayarak. Karın rahim serbest bırakmak için makas kullanın.Buz gibi PBS rahim ıslatma sonra, bir diseksiyon çanak içine organ pin. Makas kullanarak, ayrı bir embriyo içeren ayrı bölümler halinde rahim kesti. İnce forceps iki çift kullanarak, yavaşça rahim dokusundan embriyolar soyma ve dört derece Santigrat PBS-EDTA içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.Kalpleri toplamak için, bir diseksiyon mikroskobu altında çanak yerleştirin ve supine konumuna embriyo konumlandırmak için ince forceps iki çift kullanın. Göğüs erişimini stabilize ettikten sonra, göbek köprücük kemiği arasında uzanan embriyo nun göğüs kemiği boyunca bir kesi yapmak için ikinci bir çift ince çillerin keskin noktasını kullanın. Yavaş yavaş göğüs boşluğunun içine doğru çalışırken çok ince ve yüzeysel kesiler yapma, embriyonun karın açın.Kalp sadece görünür hale geldiğinde, kaburga ları soymak için göğüs kafesi biraz şımartılmış gövde sıkmak için forceps bir çift kullanın. Bir çift forceps'un kenarlarını kullanarak, dokuyu ayırmadan pulmoner kan damarlarını hafifçe tutun ve kalbi boşluktan çekin. 45-60 dakika boyunca 4% Paraformaldehit doku sabitleme önce taze PBS-EDTA 1-2 dakika için kalp temizleyin.Daha sonra, glisin ile desteklenen PBS yıkama başına 5 ila 10 dakika için kalbi üç kez yıkayın. Kalpleri PBS'de dört santigrat derecede saklamadan önce. Kalbi kriyoditasyona hazırlamak için, örnekleri 24 ila 40 saat boyunca 4 derece santigrat derecede %30 sakaroz ve PBS tüpüne yerleştirin.Kalpler tüpün dibine battığında, her kalbi bir parça tüysüz mendille dikkatlice aktarmak için değiştirilmiş uçlu bir Pasteur Pipet kullanın. Kısa bir hava kurutulma dan sonra, her numuneyi ayrı ayrı optimum kesme sıcaklığı kalıplarına, kesit için istenilen oryantasyonlarda yerleştirin. Kabarcıklar olmadan optimum kesme sıcaklığında dokuları batırın.Daha sonra, kriyokesit ten önce en az 24 saat boyunca 80 santigrat derecede dokuları dondurma önce birkaç gün için 20 derece santigrat kadar kalıpları saklayın. Örneklerin kriyostat bölümlerini elde etmek için, kriyostat'ın fırlatıcısına ilgi doku bloğunu takmak için taze optimum sıcaklık kesme ortamını kullanın ve ortamın opak beyaz olana kadar donmasını bekleyin. Yeni bir bıçak takın ve bölümlerin elde edilmesine izin verecek şekilde doku bloğu ile bıçak arasındaki mesafeyi ayarlayın.İlgi noktasına ulaşılına kadar bloğu 10 mikrometre dilimhalinde kırpın. Doku gözlemlenebildiği zaman, sürekli kesme hareketiyle dilimi standa doğru hafifçe çekmek için küçük düz bir fırça kullanın. Doku tamamen kesildikten sonra, parçayı sahneye doğru düz bir şekilde okşamak için detay fırçasını kullanın.Ayrıntılı fırçayı çıkarıp dilimi bitirmeden önce bölümü yaklaşık 20 ila 30 saniye yerinde tutun. Herhangi bir yuvarlanmayı önleyen ve doku bölümünü sahneye karşı tutan dilimi kademeye karşı hafifçe düzleştirmek için her iki fırçayı da kullanın. 20 ila 30 saniye sonra, bölümü çevirin ve dilimin çekilebilecek kadar yakına elektrostatik yüklü bir slayt yerleştirmeden önce tekrar sahneye doğru düzleştirmek ve slayta dokunmak zorunda kalmadan slayta yapışın.Ortak kalp kusurları varlığı için kalp dokusu bölümlerini değerlendirmek için, bir kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanarak, 5 ila 10X ve 40X büyütme görüntüleri elde. Kardiyak kas sıkıştırma analizi için, uygun bir görüntü analizi yazılım programında ilgi bir doku açın ve 8-bit görüntü ayarlayın. Görüntünün eşiğini ayarlamak için Görüntü, Ayarla ve Eşik'i tıklatın ve yalnızca arka plan pikselleri seçilene kadar eşiği ayarlamak için üst çubuğu nu taşıyın.Ardından, dokunun etrafına ilgi alanı çizmek için çokgen seçim aracını kullanın ve ardından Analiz Et, Ölçümleri, Alanı ve Eşiğe Sınırı'nı tıklatın. Negatif alanın alanını elde etmek için vurgulanan piksellerin alanını ölçmek için Çözümle ve Ölçü'ye tıklayın. Tüm ilgi alanının alanını ölçmek için Çözümle, Ölçümleri Ayarla'yı tıklatın ve eşiğe Sınır'ı seçin.Ardından, seçilen ilgi alanının tüm alanını ölçmek için Analiz et ve Ölçü'ü seçin. Kas dokusu alanını hesaplamak için, Negatif Alan Alanını İlgi Bölgesi'nden çıkarın. Daha sonra kas sıkıştırma ve X.The hasat embriyonik kalplerden doku dilimleri boyama hesaplamak için İlgi Bölgesi tarafından kas dokusu alanı bölmek, doku kenarları yapmak için yeterli kontrast sağlar, ama hücre özellikleri ayırt edilemez hale getirmek için çok karanlık değildir.Bu temsili analizde, deneysel olmayan koşullar altında gelişen embriyolara göre deneysel kalplerde kas sıkıştırmasının önemli ölçüde azaldığı gözlenmiştir. Bu örnekler değerlidir ve oluşturmak için uzun bir zaman gerektirir. Nekropsiler ve özellikle kriyostat kesitleri sırasında, yaptığınız her eylem hakkında kasıtlı olduğundan emin olun.Paraformaldehit dokuların korunması, morfoloji değerlendirmesi sırasında bulunan patolojik nedenleri belirlemeye yardımcı aminofloresesin boyama gibi testler için kullanılmak üzere örnekler izin antijen aktivitesi korur. Laboratuarımızda, farklı tedavilerin numunelerimizi ne derece etkilediğini belirlememize yardımcı olabilecek deneysel tedavilerin nicel temsilini elde ettik. Paraformaldehit dokunduğu her dokuyu düzeltebilir.Açıkta kalan cildi en aza indirmek için her zaman eldiven giymeye ve bu kimyasalla çalışırken film kaputunda çalışmaya özen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fetal fare bir yüksek frekans ultrason (30/45 MHZ) sistemi kullanarak Imaging kardiyovasküler

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...