Name: ribotag immunoprecipitation in the germ cells of the male mouse
Uploaded: 2020-03-04T14:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door NIH grant NICHD R00HD083521 aan EMS en interne ondersteuning van Rutgers University aan EMS.

Alle praktijken voor dierlijk gebruik en behandeling zijn goedgekeurd door het Comité interne dierenverzorging en -gebruik van de Rutgers University (IACUC).
1. Muizenfokkerij
<ol><li>Ras vrouwelijke muizen homozygous voor een RNA bindende eiwitmutatie die leidt tot mannelijke onvruchtbaarheid (manuscript in voorbereiding, hierin aangeduid als het gen van belang) in trio paringen aan mannen hemizygous voor de Stra8-iCre allel (B6. FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Cre+),als het koppelen van twee vrouwtjes aan elk mannetje verhoogt de fokefficiëntie. OPMERKING: Het mutante gen van belang (M) werd moederlijk gepasseerd, omdat vrouwtjes homozygous voor M een normale vruchtbaarheid hebben. Dit heeft als bijkomend voordeel dat de mannelijke kiemcel Cre (hemizygous) wordt toegelaten, zoals aanbevolen21 en het optimaliseren van het percentage nakomelingen met de gewenste allelic combinatie. Omdat homozygoot Cres kiemceltoxiciteit22vertonen, wordt aanbevolen het allel te onderhouden en door gegeven te worden in een heterozygoot of hemizygoottoestand. Belangrijk is dat cre-expressie niet meemag werken met het Rpl22-HA-allel tot de experimentele populatie. Het niet isoleren van het Rpl22-HA-allel van Cre bij fokdieren zal resulteren in nakomelingen die wereldwijd Rpl22-HA uitdrukken als gevolg van kiemcel Cre-activiteit. Dit probleem is specifiek voor kiemcel. Bovendien is de Stra8-iCre specifiek voor de celpopulatie van de auteurs van belang22, gericht op cellen die in en zeer vroeg in meiose overstappen, waaronder preleptoenen en leptotenen. Een andere Cre driver specifiek voor een ander type van de cel kan in plaats daarvan worden gebruikt. Gangde praktijk dicteert mannelijke kiemcel uitgedrukt Cres worden overgedragen aan de vaderlijke kant. Het is echter mogelijk dat de overdracht van de Stra8-iCre bij mannelijke nakomelingen kan worden weergegeven. Ongeacht het gekozen fokschema, moeten, om nakomelingen met gelijkwaardige Cre-expressie te genereren, alle experimentele monsters worden gegenereerd via Cre-transmissie van dezelfde ouderlijke kant (altijd moederlijk of altijd vaderlijk).</li>
	<li>Genotype resulterende mannelijke pups zoals beschreven in punt 2.4. Selecteer degenen die het M-allel dragen en positief zijn voor Cre (+/M:Cre+) voor downstream veredeling.</li>
	<li>Ras vrouwelijke muizen homozygous voor de M allel in trio paringen aan mannen homozygous voor Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ). OPMERKING: De Rpl22-HA achtergrond is zeer gemengd, dus zorg moet worden uitgeoefend bij de beoordeling van stam-specifieke fenotypes.</li>
	<li>Genotype resulterende vrouwelijke pups om te identificeren die het M-allel en positief voor Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (zie punt 2.3). Selecteer deze vrouwtjes voor downstream fokken.</li>
	<li>Kruis +/M:Cre+ mannetjes met +/M:Rpl22+ vrouwtjes in trioparingen. Genotype de resulterende pups (zie de secties 2.3 en 2.4) om mannetjes te identificeren die zowel Cre+ als Rpl22+ en wildtype of M/M zijn. OPMERKING: Aangezien dit werk zich richt op een mutatie die resulteert in volledige mannelijke onvruchtbaarheid, zijn in het fokschema speciale overwegingen genomen om de gewenste experimentele genotypen zo efficiënt mogelijk te verkrijgen. Dergelijke overwegingen kunnen in andere experimentele modellen overbodig zijn. Zie figuur 2 voor een volledig fokschema en bijbehorende legende voor aanvullende bespreking van fokoverwegingen.</li>
</ol>2. Monsterverzameling
<ol><li>Verzamel proefzaadjes van mannelijke muizen op 21 dagen post-partum (dpp).<ol>
<li>Offer muizen op door CO 2-inademing, gevolgd door cervicale dislocatie. Maak een ventrale incisie (3 cm) op elk dier geflankeerd door twee kortere (2 cm per stuk), verbonden laterale incisies. Trek de huid en parimeer naar achteren om de teelballen te onthullen.</li>
		<li>Met behulp van tangen, trek de epidymale vet pad van de ene kant van de lichaamsholte om de epididymis en testis onthullen. Met tenotomy schaar, accijnzen de testis, zorg voor trim weg epididymis, omliggende vet, en een externe vasculatuur. Plaats intacte teelballen in een schone 1,7 mL buis.</li>
		<li>Herhaal dit met de andere kant en voeg de tweede teelballen toe aan de eerste buis. Sluit deze buis af en dompel deze onmiddellijk onder in vloeibare stikstof om te flash-freezeen. OPMERKING: Monsters kunnen tot gebruik bij -80 °C worden bewaard.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamel voor elk dier (2 mm) extra staarttipmonsters voor bevestiging van genotypering.<ol>
<li>Voeg 100 μL naoh van 50 mm mm toe aan een staartpunt van 2 mm in een buis van 1,7 mL en kook op 95 °C gedurende 30 min. Voeg 100 μL van 50 mM HCl en 20 μL van 1 M Tris-HCl pH 8,0 en centrifugemonsters gedurende 3 min bij 10.000 x g. Behoud supernatant (met genomisch DNA) en bewaar geëxtraheerd DNA bij 4 °C tot gebruik als sjabloon voor de volgende genotyperingsreacties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rpl22-HA genotyping uitvoeren volgens een methode die is aangepast aan Sanz et al.13 met behulp van de volgende primers: 5' GGGAGGCTTGCTGGATATG 3"; reverse: 5' TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3'.<ol>
<li>Bereid een reactiemengsel bestaande uit 2 μL DNA zoals gewonnen in stap 2.2.1, 0,08 μL van 25 mM dNTP's, 0,1 μL van 10 mM voorwaartse primer; 0,1 μL van 10 mM omgekeerde primer, 2 μL van een polymerase kettingreactie (PCR) buffer (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2, en 0,1% Tween), 0,2 μL Taq polymerase, en nuclease-vrije H2O tot een totaal volume van 20 μL.</li>
		<li>Gebruik de volgende thermocycler-omstandigheden: een smeltstap van 30 s primer bij 95 °C, 30 s anneal bij 64 °C en een 30 s verlenging bij 72 °C, 37 keer herhaald met een laatste 5 min verlenging bij 72 °C. OPMERKING: Dit leverde een productgrootte op van 260 bp voor wildtypemonsters en 292 bp voor monsters die Rpl22-HA+ waren.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cre genotyping uitvoeren met behulp van de volgende primers: forward: 5' GTGCGCTGAACAACAGGA 3'; reverse: 5' AGGGACACAGCATTGGAGTC 3'. Bereid de PCR reactie zoals beschreven in stap 2.3.2 gebruik te maken van de Cre primers plaats. Gebruik de volgende thermocycler-omstandigheden: een smeltstap van 30 s primer bij 95 °C, 30 s anneal bij 60 °C en een verlenging van 15 s bij 72 °C, 35 keer herhaald met een laatste 5 min verlenging bij 72 °C.</li>
	<li>Voer gen van belang genotyping uit zoals standaard voor het gen in kwestie is. OPMERKING: Het genotyping protocol van de auteur maakt gebruik van een geconcentreerde aangepaste Taq,en als zodanig, andere gebruikers kunnen hebben om de voorwaarden aan te passen aan hun enzymatische eisen te wijzigen. Om de impact van het verlies van dit rentegen op de vertaling beter te begrijpen, werden mannetjes die wildtype of homozygous waren voor het gemuteerde allel van belang en die ook Cre+ en Rpl22+ waren geselecteerd om de experimentele monsters te zijn. Genotype selectie wordt verder hierboven besproken in sectie 1.</li>
</ol>3. Voorbereiding van oplossingen
OPMERKING: Het voorbereiden van oplossingen en alle volgende stappen moeten onder strikte voorwaarden worden uitgevoerd.
<ol><li>Voeg 2,5 mL van 1 M Tris pH 7,4, 5 mL van 1 M KCl, 600 μL van 1 M MgCl2en 500 μL NP-40 toe aan een 50 mL-buis. Breng aan de volume (50 mL) in diethylpyrocarbonaat (DEPC) H2O en meng tot alle componenten zijn opgenomen. OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zijn als volgt: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2, en 1% NP-40.</li>
	<li>Voeg 2,5 mL van 1 M Tris pH 7,4, 15 mL van 1 M KCl, 600 μL van 1 M G.G.2en 500 μL NP-40 toe aan een 50 mL-buis. Breng in de DEPC H2O (50 mL) aan volume en meng tot alle componenten zijn ingebouwd. OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zullen als volgt zijn: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2, en 1% NP-40Het protocol kan hier worden onderbroken, en oplossingen kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot gebruik.</li>
</ol>4. Bereiding van weefsel
<ol><li>Weeg alle monsterbuizen voor, het registratiegewicht en koel af in vloeibare stikstof.</li>
	<li>Precool steriele mortel, stamper, en het wegen van spatel op droog ijs.</li>
	<li>Maal flash-bevroren weefselmonsters tot een fijn poeder met behulp van een voorgekoelde, steriele mortel en stamper op droogijs.<ol>
<li>Plaats flash bevroren weefsel in voorgekoelde mortel op droogijs. Breek weefsel voorzichtig in grote stukken met behulp van stamper en langzaam malen totdat weefsel is een fijn poeder. OPMERKING: Hoewel vers weefsel ook kan worden gebruikt, volgens het oorspronkelijke protocol13,wordt er geen significant verschil in resultaat waargenomen met het gebruik van flash-bevroren weefsels. Zie representatieve resultaten en discussie voor meer informatie.</li>
		<li>Breng grondmonster voorzichtig over naar voorgekoelde verzamelbuis door poeder uit mortel te schrapen met behulp van voorgekoelde spatel. Zorg ervoor dat alleen weefsel wordt verzameld en geen vocht op de koude mortel wordt afgezet.</li>
		<li>Weeg de buis met weefsel, zorg ervoor om op droogijs te houden waar mogelijk. Bereken de massa van het weefsel door het initiële gewicht van de buis af te trekken van het gewicht van de buis met het monster erin. Noteer deze waarde voor latere berekening van lysisbuffervolumes. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen tot gebruik bij -80 °C worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Homogenisatie van het monster
<ol><li>Bereid lysisbuffer (10 mL HB + supplementen) aan door toevoeging van 10 μL van 1 M dithiothreitol (DTT), 1 proteaseremmertablet, 50 μL RNase-remmer (40.000 eenheden/mL), 200 μL van 5 mg/mL cycloheximide en 100 μL van 100 mg/mL heparine tot 10 mL HB. Meng tot alle componenten zijn opgenomen en houd op ijs tot het gebruik. OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van de supplementen in 10 mL HB zijn als volgt: 1 mM DTT, 200 U/mL RNase-remmer, 100 μg/mL cycloheximide en 1 mg/mL heparine. Deze oplossing moet binnen 24 uur na de toevoeging van de supplementen worden gebruikt en kan tot gebruik bij 4 °C of op ijs worden bewaard.</li>
	<li>Voeg voor elke 100 mg monster 1 mL lysisbuffer toe. Met dezelfde pipet gebruikt om de lysis buffer toe te voegen, zorgvuldig pipetde de resulterende lysate op en neer om cellen te fragmenteren en mengen. Doorgaan met pipetteren totdat het monster niet langer stroperig is, over het algemeen 25−30 slagen. OPMERKING: Omdat de oplossing in eerste instantie erg stroperig is, moet een pipet met een grote diameter worden gebruikt om de oplossing te mengen. Een standaard 1000 μL is normaal gesproken voldoende voor 100 mg weefsel.</li>
	<li>Stel monsters op ijs voor 10 min lyse. Draai vervolgens monsters in een voorgekoelde centrifuge (4 °C) gedurende 10 min bij 10.000 x g. Een grote, losse, troebele pellet moet zich vormen in de bodem van de buis.</li>
	<li>Wees voorzichtig om de pellet niet te verstoren, verzamel het lysaat in een nieuwe buis en neem volume voor elk monster op. Om monsterdegredataie te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de monsters koel blijven gedurende het resterende protocol, waarbij de opslag op ijs of bij 4°C waar mogelijk wordt opgeslagen.</li>
</ol>6. Evenwicht van kralen
<ol><li>Bereken met behulp van het lysaatvolume uit stap 5.2 het vereiste volume magnetische kralen gekoppeld aan het juiste antilichaambindende eiwit (in dit geval eiwit G). Gebruik voor 1 mL lysaat 375 μL eiwit G-kralen (30 mg/mL). OPMERKING: De keuze van geconjugeerde kralen zal variëren met anti-HA antilichaam gebruikt; Bijvoorbeeld, als een konijn gegenereerdanti-HA antilichaam wordt geselecteerd, eiwit A kralen zal de voorkeur hebben.</li>
	<li>Verwijder met behulp van een magnetisch buizenrek het kraaloplosmiddel en voeg een even groot volume van verse lysisbuffer toe aan de kralen. Draai 5 min bij 4 °C om te wassen. Voer alle rotatiestappen uit met behulp van een benchtop buis rotater ingesteld op 20 rpm.</li>
	<li>Plaats de buis op het magnetische buisrek en verwijder de wasbuffer.</li>
	<li>Herhaal stap 6.1−6.3 nog twee keer.</li>
	<li>Voeg lysisbuffer toe aan het oorspronkelijke volume om geequilibreerde kralen toe te voegen. Bewaar bij 4 °C of op ijs tot gebruik.</li>
</ol>7. Preclearing monster
<ol><li>Voeg 50 μL geëquilibreerde kralen voor elke 1 mL lysaat toe aan supernatant van lysed sample (lysaat) en draai bij 4 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Leg de buis op het magneetrek en verzamel lysate in een verse buis. Gooi gebruikte kralen weg.</li>
	<li>Voeg aan het lysaat 25 μL geëquilibreerde kralen toe voor elke 1 mL en draai bij 4 °C gedurende 1 uur. Bewaar resterende geëquilibreerde eiwit G-kralen bij 4 °C 's nachts.</li>
	<li>Plaats de buis op het magneetrek en verzamel lysate in een verse buis. Gooi gebruikte kralen weg. Van het gewiste lysaat behoudt u 50 μL om als monsterinvoerregeling op te treden. Bewaar bij -80 °C. OPMERKING: Het invoermonster fungeert als een controle die de totale RNA-populatie van het monster vertegenwoordigt, inclusief RNA's die zijn gekoppeld aan andere celtypen in het weefsel, die tijdens downstream-analyses moeten worden gebruikt om te corrigeren voor veranderingen in genexpressie als functie van mutatie.</li>
</ol>8. Incubatie van antilichamen
<ol><li>Voeg voor elke 1 mL gerooid lysaat 5 μg anti-HA antilichaam toe. Sluit de buisdop af met laboratoriumfolie om monsterverlies te voorkomen. Draai monsters 16−18 h bij 4 °C. OPMERKING: De incubatietijd en concentratie van antilichamen zijn niet geoptimaliseerd. De auteurs vonden een nachtelijke incubatie met 5 μg voldoende; het is echter mogelijk dat een kortere incubatie of minder antilichaam voldoende zal zijn, of dat een langere incubatie of meer antilichaam de binding zal verbeteren.</li>
</ol>9. Incubatie van kralen
<ol><li>Voeg voor elke 1 mL gerooid lysaat 300 μL eiwit G-kralen toe. Sluit de buisdop opnieuw af met laboratoriumfolie en draai gedurende 2 uur bij 4 °C.</li>
</ol>10. Kralen wassen
<ol><li>Plaats de monsterbuis op het magneetrek zodat kralen zich kunnen losmaken van iPed lysate. Pipetteer de flow-through lysate en gooi, met behoud van de kralen.</li>
	<li>Breng 800 μL HSWB aan op kralen en laat 10 min bij 4 °C draaien. Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat kralen scheiden van was. De was verwijderen en weggooien.</li>
	<li>Breng nog eens 800 μL HSWB aan op kralen. Sluit het monster en laat 5 min bij 4 °C draaien. Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat kralen scheiden van was. De was verwijderen en weggooien.</li>
	<li>Herhaal stap 10.3 nogmaals.</li>
</ol>11. RNA-extractie
<ol><li>Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat kralen scheiden van was. Pipetteer weg en gooi wassen, het behoud van kralen voor RNA extractie. Voeg 3,5 μL van 14,2 M bèta-mercaptoethanol (bME) toe aan kralen en meng door vortexing gedurende 15 s.</li>
	<li>Extract RNA met behulp van een commerciële RNA zuiveringskit, volgens de instructies van de fabrikant. Uitlaten monster in 30 μL RNase gratis H2O. OPMERKING: Hoewel de 10 μL/sample DNase behandeling optioneel is voor de meeste kits, wordt deze sterk aangemoedigd. Deze optionele opruimstap vermindert de achtergrond aanzienlijk, waardoor een nauwkeurigere eindconcentratie mogelijk is. Het is sterk recommened om een kit die bèta-mercaptoethanol (bME) bevat in de lysis buffer te gebruiken. bME fungeert als een extra RNase-remmer om de afbraak van monsters tijdens RNA-isolatie te voorkomen.</li>
	<li>Bewaar monster bij -80 °C of analyseer onmiddellijk.</li>
</ol>12. Kwantificering en steekproefanalyse
<ol><li>Met behulp van een UV-Vis spectrofotometer, kwantificeren RNA concentratie en voorlopige kwaliteit.</li>
	<li>Analyseer de kwaliteit van RNA uit monsters via een bioanalyzer. OPMERKING: Het resulterende RNA kan vervolgens worden gebruikt voor RNA-sequencing of andere downstream-analyses zoals northing blotting of kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (qRT-PCR).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Snyder, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+the+efferent+ducts,+epididymis,+and+vas+deferens+during+embryonic+development+of+the+mouse.">Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse.</a> Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).</li><li>Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+estrogen+and+testosterone+in+the+proximal+mouse+reproductive+tract.">Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract.</a> Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).</li><li>Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+meiotic+male+germ+cell+mRNAs+that+are+translationally+up-+and+down-regulated.">Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).</li><li>Busada, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+Kit+translation+during+spermatogonial+differentiation+in+the+mouse.">Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse.</a> Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).</li><li>Kleene, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+translational+regulation+in+the+mammalian+testis.">Patterns of translational regulation in the mammalian testis.</a> Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+expression+of+nucleoprotein+mRNAs+during+rat+and+mouse+spermiogenesis.">Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis.</a> Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).</li><li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites.">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li><li>Michel, A. M., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+a+Hi-Def+monitor+for+protein+synthesis+at+the+genome-wide+scale.">Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).</li><li>Snyder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+Heterozygosity+for+Y+Box+Proteins+Causes+Sterility+Due+to+Loss+of+Translational+Repression.">Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression.</a> PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Profiling+Analysis+of+mRNA+and+Associated+Proteins+Engaged+in+Translation.">Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+measurement+of+translation+by+ribosome+profiling.">Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling.</a> Methods. 126, 112-129 (2017).</li><li>Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+measurement+of+ribosomal+occupancy+by+ribosome+profiling.">Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling.</a> Methods. 85, 75-89 (2015).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag:+Ribosomal+Tagging+Strategy+to+Analyze+Cell-Type-Specific+mRNA+Expression+In+Vivo.">RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo.</a> Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag+analysis+of+actively+translated+mRNAs+in+Sertoli+and+Leydig+cells+in+vivo.">RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo.</a> PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Ceolin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-Specific+mRNA+Dysregulation+in+Hippocampal+CA1+Pyramidal+Neurons+of+the+Fragile+X+Syndrome+Mouse+Model.">Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).</li><li>Puighermanal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=drd2-cre:ribotag+mouse+line+unravels+the+possible+diversity+of+dopamine+d2+receptor-expressing+cells+of+the+dorsal+mouse+hippocampus.">drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus.</a> Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag+is+a+flexible+tool+for+measuring+the+translational+state+of+targeted+cells+in+heterogeneous+cell+cultures.">RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures.</a> Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).</li><li>The Jackson Laboratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , (2019).</li><li>Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incomplete+cre-mediated+excision+leads+to+phenotypic+differences+between+Stra8-iCre;+Mov10l1(lox/lox)+and+Stra8-iCre;+Mov10l1(lox/Delta)+mice.">Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice.</a> Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Inzicht in het vertalen van een bepaald celtype is van onschatbare waarde voor een nauwkeuriger inzicht in de fysiologie van een cel in de normale of gemuteerde toestand. Speciaal voordeel wordt gezien in systemen waarin de vertaling is losgekoppeld van transcriptie, zoals in zenuwweefsel waar de vertaling zeer ver van transcriptie voorkomt, of in kiemcellen waar transcriptie lang vóór vertaling plaatsvindt. Ten opzichte van andere vertaalmethoden, het grootste voordeel van de RiboTag systeem komt uit het gebruik van de Cre recombinase systeem. Dit maakt het mogelijk de vrijheid om elke celbevolking die een relevante Cre-driver heeft richten. Ten tweede is de RiboTag IP zoals hierbeschreven effectief en veel minder technisch uitdagend en tijdrovend dan polysoom- of riosome profilering. Ten slotte kan RiboTag IP eenvoudig worden uitgevoerd op de banktop.
Er zijn een aantal kritieke stappen in dit protocol. Chief onder hen is de oprichting van de RiboTag muislijn en de generatie van proefdieren voor studie. Zoals voor alle genetische modellen, zorgvuldige tracking van individuen binnen de muiskolonie evenals zorgvuldige genotyperingsprotocollen moeten worden toegepast. PCR-genotypering per Sanz et al. moet primers bevatten die gericht zijn op de loxP-site 5' van de wilde typeexon 4 om onderscheid te maken tussen wildtype allelen (260 bp) en mutant (290 bp)13. Voor het geval van RiboTag-analyse in kiemcelmodellen moet rekening worden gehouden met zeer specifieke fokvereisten. Ten eerste, in het geval van mutanten die resulteren in onvruchtbaarheid, moeten doordachte fokstrategieën methoden omvatten om het aantal nakomelingen te optimaliseren met het gewenste genotype in intermediaire en experimentele generaties. Ten tweede, in het geval van kiemcelspecifieke Cres,moet er aandacht worden besteed aan cre-zygosity, gezien de gevoeligheid van kiemcellen voor cre-toxiciteit. In de kiemcel kunnen hoge niveaus van Cre-eiwit schadelijke effecten hebben22,waardoor het gebruik van Cre/Cre-dieren in het fokschema wordt verboden. Ten slotte, bij het gebruik van kiemcel Cres, is het belangrijk om het RiboTag-allel te isoleren van de Cre tot de uiteindelijke generatie, omdat Cre-expressie in de kiemcel van een tussengeneratie zal resulteren in nakomelingen die Rpl22-HA wereldwijd uitdrukken.
Ongeacht het celsysteem zijn een aantal aanbevolen besturingselementen mogelijk om de robuustheid van zowel cre-expressie als specificiteit te verifiëren. De juiste expressie van uw Cre en verwachte excisie van Rpl22-HA kan worden bepaald met behulp van meerdere methoden. In het eerste kan weefsel dat isoleerde van proefdieren voor HA worden gekleurd met behulp van immunohistochemie of immunofluorescentie15. Deze methode is optimaal in die zin dat het vereist geen a priori kennis van vertaalde mRNAs in de doelceltypes. De tweede methode, waarvan een voorbeeld wordt aangetoond in figuur 6,vereist enige kennis van translationeel gereguleerde berichten in de doelceltypen. In deze methode kan verrijking voor een bekende translationeel gereguleerde mRNA worden bevestigd door de geselecteerde Cre-drivermet behulp van kwantitatieve PCR van IPed versus input RNA. Evenzo kan robuuste Rpl22-HA-expressie worden bevestigd door vergelijking van Cre+/Rpl22+ monsters (positieve controles) met cre-/rpl22+ of Cre+/Rpl22-monsters die fungeren als effectieve negatieve controles (zie figuur 3). Deze vergelijkingen kunnen ofwel door gedaan op de totale IPed RNA of verrijking voor een bekende translationeel gereguleerde mRNA beoordeeld door qRT-PCR of een andere kwantitatieve methode.
Veelvoorkomende problemen bij de uitvoering van het protocol worden meestal pas duidelijk wanneer de RNA-opbrengst onverwacht laag of hoog is. De meest voorkomende oorzaak voor deze fouten zijn het gevolg van onjuiste genotypering van individuen. We raden u aan extra weefsel uit verzameld monster te behouden om genotypen van alle monsters te bevestigen in het geval van onverwachte RNA-opbrengsten. Zodra dit is bevestigd, moeten andere mogelijkheden worden overwogen, waaronder de mogelijkheid van rnase-besmetting of afbraak van monsters. Zorgvuldige monsteropslag en -behandeling en -onderhoud van RNase vrije zones binnen het laboratorium kunnen deze problemen sterk verminderen of elimineren. Hoewel RNA isolatie problemen zijn een ander potentieel probleem in dit protocol, het gebruik van commerciële kits sterk vermindert dit probleem al zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat ze worden gehandhaafd als RNase gratis en bevatten geen verlopen oplossingen. Ten slotte, zoals met alle antilichaam-gebaseerde procedures, variaties in partij, opslag voorwaarden, concentratie, of zelfs de scheepvaart hebben het potentieel om een negatieve invloed op de kwaliteit van het antilichaam en het daaropvolgende succes van de pulldown. Als gevolg hiervan hebben we na zorgvuldige en herhaalde tests gekozen voor het meest consistente en efficiënte antilichaam dat beschikbaar is.
Dit protocol bevat twee belangrijke wijzigingen ten opzichte van andere gepubliceerde RiboTag protocollen die de kans op succes aanzienlijk vergroten. Een daarvan is de mogelijkheid om flash bevroren weefsel te gebruiken, waardoor het verzachten van eventuele problemen waarbij partij, technicus, of technische run variaties. Monsters kunnen worden verzameld en opgeslagen waardoor isolatie van HA-riosoomen van alle monsters tegelijk, het verlagen van wat kan worden belangrijke bronnen van variatie. Ten tweede vermindert de toevoeging van de preclear-stap het soort achtergrond dat door andere gebruikers van het RiboTag-systeem wordt gerapporteerd aanzienlijk. Onlangs, een protocol rapport van Sanz et al. geeft de aanwezigheid van een hoge achtergrond als gevolg van overvloed aan riosome-geassocieerde transcripties vanniet-Cre-gedrevencellen14. Ons protocol verhelpt dit probleem door een preclearing stap op te nemen, waardoor de aanwezigheid van RNA in Cre negatieve IP-monsters effectief wordt geëlimineerd.
Zoals alle systemen moet rekening worden gehouden met de inherente beperkingen van het RiboTag-systeem. Bij het gebruik van niet-gekarakteriseerde Cre-stuurprogramma's moet de analyse van expressie worden uitgevoerd voordat de experimentele monsterproductie wordt uitgevoerd. Vanuit het perspectief van de vertaling moeten verschillende nuances van deze methode worden opgemerkt. Ten eerste staat RiboTag geen differentiatie tussen mRNAs toe die klaar zijn om te vertalen en die actief te vertalen. Als zodanig staan de huidige op RiboTag gebaseerde methoden de kwantificering van de vertaalefficiëntie niet toe als functie van individuele mRNAs. Als de efficiëntie van de vertaling van belang is, kan deze op celspecifieke basis worden gemeten als de RiboTag-methode wordt gecombineerd met andere vertaalanalysetools zoals polysouze profilering. Ten tweede is het van fundamenteel belang om rekening te houden met totale RNA-overvloedveranderingen als gevolg van individuele of genotype afhankelijke variantie. Het is om deze reden dat een zorgvuldige isolatie van input RNA immunoneerslag vergezellen en monsters die daaruit voortvloeien, blijven in alle downstream-analyses in elkaar gesaneerd. Ten slotte, en met betrekking tot ribotag-gebaseerde analyse, moet eraan worden herinnerd dat associatie met een riosoom niet noodzakelijkerwijs bewijzen vertaling plaatsvindt. Er moeten secundaire analysemethoden worden uitgevoerd om de translationele regelgeving in de doelstellingen van belang te bevestigen.
Dit protocol beschrijft de isolatie van ribosome-geassocieerde RNA's van de kiemcellen van mannelijke muizen met behulp van de RiboTag model. Het protocol is niet goed voor het fokken van muizen en het verzamelen van monsters en duurt twee dagen, met drie uur de eerste dag, het beste gedaan in de middag, een nachtelijke incubatie, gevolgd door vijf uur werk de volgende ochtend. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de voorbereiding van voorraadoplossingen (HB en HSWB) en weefselslijpen van tevoren te doen. Het algehele succes van het protocol is afhankelijk van de juiste genotyping en streng RNase-vrije voorwaarden. De mogelijkheid om het vertaalmiddel van specifieke celtypen te onderzoeken, zal toekomstige studies in staat stellen om de relatie tussen transcriptie, vertaling en het proteome in talloze celtypen en gemuteerde achtergronden beter te begrijpen.

Analyse van de RNA-overvloed van een cel of weefsel, zoals onderzocht door microarray of RNA-sequencing, heeft bewezen een krachtig instrument om de moleculaire drivers van mutante fenotypes te begrijpen. Deze relatief onvolledige analysetools kunnen echter niet informeren over de fysiologie of het proteome van de cel, vooral in systemen waar veel mRNAs worden opgeslagen voorafgaand aan de vertaling, zoals neurale en kiemcellen. In deze systemen kan het definiëren van de populatie van mRNAs die actief worden vertaald in eiwitten, of het translatoom van de cel, een betere indicator zijn van de werkelijke fysiologische toestand van de cel1,2. Bijvoorbeeld, kiemcellen in verschillende stadia van ontwikkeling transcriberen RNAs die worden opgeslagen voor latere vertaling, gedreven door ontwikkelingskracht3 of signalering signalen4. Dit proces wordt geïllustreerd door de mRNAs codering protamines, waarin de mRNA transcript is detecteerbaar dagen voordat het eiwit wordt gemaakt1,2,5,6. Evenzo transcriberen neurale cellen RNA in de kern en transporteren het door de axon, zoals het geval is met β-actine7. Naast deze gespecialiseerde celsystemen, steady-state transcriptomen zijn waarschijnlijk niet informatief in modellen waar RNA opslag, riosome biogenese, of mRNA vertaling worden beïnvloed. Meerdere andere factoren kunnen ook invloed hebben op de steady-state RNA-pool van een cel, waaronder mRNA-verval en de activiteit van RNA-bindende eiwitten. In deze gevallen zullen robuuste tools voor het analyseren van ribosome-geassocieerde RNA's of mRNAs onder actieve vertaling eerder biologisch relevante resultaten opleveren.
Daartoe zijn verschillende methoden ontwikkeld voor het identificeren van ribosome-geassocieerde of actief vertaalde berichten. Polysoom profilering, die een momentopname van riosome geassocieerde transcripties biedt, is gebruikt voor vele decennia te isoleren intacte RNAs in verband met ofwel ribosomal subunits of mono-, di-, en poly-ribosome complexen3. Kortom, verzamelde cellysaten worden toegepast op een lineaire sacharosegradiënt en gecentrifugeerd als hoge snelheid, wat resulteert in scheiding van de riosome subeenheden, intacte riosomen, en polysomen op grootte. Traditioneel is deze techniek toegepast om een of enkele mRNAs te bestuderen, maar onlangs is deze methode gecombineerd met RNA-seq studies om de functie van potentiële translationele regulatoren op te helderen8,9 Hoewel een krachtige manier om onderscheid te maken tussen actief vertalen en niet-vertalen mRNAs10,polysome profiling vereist tijdrovende methoden (gradiënt fractionatie en ultracentrifuge) en kan een goede deal van monster maken van de analyse van zeldzame cel bevolkingsgroepen uitdagend.
Een alternatieve benadering van het onderzoeken van het vertaaloom is riosome profilering, die de gedeelten van transcripties identificeert die direct aan ribosome worden verbonden. In het kort, riosome geassocieerde RNA fragmenten worden gegenereerd via RNase bescherming test, individuele riosome complexen gescheiden via sacharose gradiënt, en bijbehorende RNA fragmenten geïsoleerd en omgezet in RNA-seq tags vatbaar voor diepe sequencing11. Een van de belangrijkste voordelen van riosome profilering is de mogelijkheid om de specifieke locaties van de riosomen te bepalen op het moment van isolatie die identificatie van vertaling startsites, berekening van ribosomal bezetting en distributie, en identificatie van riosome kraampjes12mogelijk maakt. Deze methode heeft echter verschillende inherente nadelen, waaronder apparatuurbehoeften (gradiëntfractionator en ultracentrifuge), een relatief complex protocol dat uitgebreide probleemoplossing vereist en computerproblemen die niet gemakkelijk kunnen worden afgehandeld door de onervaren gebruiker11. Belangrijk is dat ribosome profilering voornamelijk wordt toegepast op geïsoleerde cellen in de cultuur en vereist aanzienlijk materiaal, waardoor de toepassing ervan op gemengde cel-type weefsels of gesorteerde cellen uit in vivo beperkt.
De zoogdierriboTag-methode, ontwikkeld door Sanz et al. in 200913, elimineert een aantal kwesties die inherent zijn aan zowel polysoom- als riosome profilering. Bij deze methode kunnen ribosome-geassocieerde RNA's worden geïsoleerd van specifieke celtypen die het mogelijk maken om celspecifieke translationomen in complexe weefsels te onderzoeken zonder aanvullende isolatietechnieken en gespecialiseerde apparatuur, zoals nodig is in andere methoden13,14. De basis van de RiboTag methode is een transgene muis model (RiboTag) die een gewijzigde locus voor de 60S ribosomal subunit eiwit gen Rpl22. Deze locus (Rpl22-HA) bevat een floxed terminal exon, gevolgd door een extra kopie van de terminal exon gewijzigd om een C-terminal hemagglutinin (HA) tag in het coderingsgebied op te nemen. Wanneer gekruist op een muis die een celspecifieke Cre Recombinase uitdrukt, wordt de gelige exon verwijderd waardoor de expressie van HA-gelabelde RPL22 op een celspecifieke manier(figuur 1) wordt verwijderd. De HA-tag kan vervolgens worden gebruikt om immunopreciatie (IP) ribosomen en de bijbehorende RNA's uit het geselecteerde celtype te immunopreciëren.
Naast de eerste publicatie die de techniek ontwikkelde, hebben verschillende andere laboratoria gebruik gemaakt van het RiboTag-model. Diverse weefsels zoals muis Sertoli en Leydig cellen15, microglia16, neuronen17,18, eicellen19, en gekweekte cellen20 zijn geprofileerd en bestudeerd. Hoewel dit protocol duidelijk in staat is om met succes te isoleren ribosomen en de bijbehorende RNAs over een diverse weefselsoorten zijn er nog steeds gebieden die verbetering nodig, vooral wanneer toegepast op mutant systemen. Met name een gemeenschappelijke afhankelijkheid van vers weefsel leidt tot een grotere technische variatie, wat de kracht van de analyse aanzienlijk kan verminderen. Ten tweede wordt de zelfverzekerde identificatie van differentieel vertaalde doelen uitdagender gemaakt wanneer een hoge immunoneerslagachtergrond optreedt van niet-Cre opnieuw gecombineerde celtypen zoals eerder gemeld13. Terwijl Sanz et al. het uitgangspunt van de techniek hebben ontworpen, presenteert het Snyder-laboratorium in dit manuscript optimalisatie van het protocol om deze zorgen te verminderen, waardoor de methode praktischer en efficiënter wordt.
De bedoeling van dit artikel is om de stappen voor het fokken van muizen uitdrukken cel-specifieke HA-gelabelde riosomen, immunoprecipitating deze riosomen uit flash-bevroren monsters, en het zuiveren van hun bijbehorende RNAs voor verdere downstream analyses. Aangezien de zoogdiermannelijke kiemcel en de bestudeerde onvruchtbaarheidmutatie unieke uitdagingen bieden, zijn inspanningen geleverd om manieren te verlichten waarop deze techniek kan worden aangepast aan andere celsystemen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithio-DL-threitol (8%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL or 2mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pippettes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18181</td>
			<td>Antibody 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA tag antibody</td>
			<td>Antibodies.com</td>
			<td>A85278</td>
			<td>Antibody 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>17490</td>
			<td>Or mice carrying Cre driver of choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>184-1100</td>
			<td>Or equivalent thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td>Or equivalent refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet rack</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Total RNA Kit 1</td>
			<td>OMEGA</td>
			<td>6834-01</td>
			<td>Kit 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Kit 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-2.5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI vortex-genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Or equivalent benchtop vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 1 mL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 10 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 20 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 200 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver / Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Or equivalent rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Powerpette Plus pipet controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75856-450</td>
			<td>Or equivalent pipette controller</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribotag immunoprecipitation in the germ cells of the male mouse

Het kwantificeren van verschillen in mRNA-overvloed is een klassieke benadering om de impact van een bepaalde genmutatie op de celfysiologie te begrijpen. Echter, het karakteriseren van verschillen in het vertaaloom (het geheel van vertaalde mRNAs) biedt een extra laag van informatie bijzonder nuttig bij het proberen om de functie van RNA reguleren of bindende eiwitten te begrijpen. Hiervoor zijn een aantal methoden ontwikkeld, waaronder riosome profilering en polysome analyse. Beide methoden brengen echter aanzienlijke technische uitdagingen met zich mee en kunnen niet worden toegepast op specifieke celpopulaties binnen een weefsel, tenzij deze worden gecombineerd met aanvullende sorteermethoden. In tegenstelling, de RiboTag methode is een genetisch gebaseerde, efficiënte en technisch eenvoudig alternatief dat de identificatie van riosome geassocieerde RNAs van specifieke celpopulaties zonder toegevoegde sorteerstappen mogelijk maakt, op voorwaarde dat een toepasselijke cel-specifieke Cre driver beschikbaar is. Deze methode bestaat uit het fokken om de genetische modellen, monsterverzameling, immunoneerslag en downstream RNA-analyses te genereren. Hier schetsen we dit proces in volwassen mannelijke muis kiemcellen mutant voor een RNA bindend eiwit dat nodig is voor mannelijke vruchtbaarheid. Speciale aandacht wordt besteed aan overwegingen voor de fokkerij met een focus op efficiënt koloniebeheer en het genereren van correcte genetische achtergronden en immunoneerslag om de achtergrond te verminderen en de output te optimaliseren. Discussie over probleemoplossingsopties, aanvullende bevestigingsexperimenten en potentiële downstreamtoepassingen is ook inbegrepen. De gepresenteerde genetische instrumenten en moleculaire protocollen vertegenwoordigen een krachtige manier om de ribosome-geassocieerde RNAs van specifieke celpopulaties in complexe weefsels of in systemen met afwijkende mRNA opslag en vertaling te beschrijven met als doel het informeren over de moleculaire drivers van mutantfenotypes.

Eerdere rapporten hebben gesuggereerd niet-specifieke immunoneerslag van cellen ontbreekt Cre14. Om te bepalen of dit het geval was in ons gewijzigde protocol, werd ip-efficiëntie bepaald in monsters afkomstig van dieren die zowel Cre als Rpl22-HA en dieren die slechts één, maar niet de andere, vervoeren, met de verwachting dat zonder zowel een Cre-driverals Rpl22-HA,immunoprecipitated RNA minimaal zou moeten zijn. Zoals blijkt uit figuur 3,wordt zeer weinig RNA geïsoleerd van monsters die cre of Rpl22-HA missen en de effectiviteit van dit protocol aantonen om de IP-achtergrond te verminderen en echte HA-gelabelde rioso's te isoleren. Verder vertegenwoordigen zowel Cre-alleen als Rpl22-HA-alleenmonsters geschikte negatieve controles.
Gezien het potentieel voor reagensbron om de efficiëntie van IP aanzienlijk te beïnvloeden, werden een reeks antilichamen en RNA-isolatieprotocollen getest (figuur 4) in positieve monsters van Cre en Rpl22-HA. Deze resultaten tonen aan dat de selectie van reagenten een aanzienlijke impact kan hebben op de IP-efficiëntie, zodat eventuele wijzigingen in de selectie van reagenten dit met zorg moeten worden gedaan.
Om dit protocol te testen in het kader van een RNA binding eiwit mutant, wildtype-Cre +Rpl22-HA + (wildtype) en gen van belang-/--Cre+Rpl22-HA+ (Gen van belang-/-) testis werden onderzocht op de effectiviteit van het RiboTag-systeem om ribosome geassocieerdRNA te isoleren ( Figuur5). Toen rna-concentratie van wildtype-input en IP werd vergeleken met Gene of interest-/- input en IP, werd er geen significant verschil waargenomen tussen genotypen. Voor beide genotypen was de inputconcentratie echter aanzienlijk hoger dan de IP-concentratie, wat aangeeft dat er meer RNA in het inputmonster zat (figuur 5B). Dit resultaat wordt verwacht, omdat niet alle mRNAs aanwezig in de cel worden geassocieerd met het riosoom op een bepaald moment, vooral in het geval van kiemcellen waar RNAs kunnen worden getranscribeerd lang voordat ze worden vertaald.
Om de kwaliteit van de RNA monsters verzonden voor sequencing te bevestigen, werden monsters uitgevoerd op een bioanalyzer. RNA-integriteitsnummers (RIN's), normaal berekend als de verhouding van 28S- en 18S rRNA-pieken, werden vergeleken tussen monsters. In totaal RNA-pools zullen RIN-waarden naar verwachting in de buurt van 10 zijn met een hogere RIN die gecorreleerd is aan de hogere afgeleide steekproefintegriteit en -kwaliteit. Hoewel de IP-monsters een lager RIN hadden dan de inputs, waren de RIN's nog steeds binnen een aanvaardbaar bereik en waren ze niet afhankelijk van het genotype van het monster (figuur 5C). De verminderde RIN-waarden voor IPed-monsters zijn waarschijnlijk een gevolg van RNA-afbraak hoewel zeer gering gezien de relatief kleine daling van de gemiddelde nucleotidelengte van geanalyseerde RNAs. Gezien de lengte van het protocol en de temperaturen die nodig zijn voor de immunoneerslag wordt enige afbraak verwacht. Het is ook mogelijk dat de verminderde RIN- en RNA-lengte een verrijkingsfunctie is voor niet-rRNA-soorten, zoals mRNAs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig1a.jpg"> Figuur 1: De RiboTag-methode. Het uitgangspunt van de methode is biologisch eenvoudig. Een nieuwe Exon 4 wordt ingevoegd in de volgorde voor de Rpl22 locus stroomafwaarts van de originele Exon 4. In aanwezigheid van een Cre-driver worden loxP-sites aan weerszijden van de originele Exon 4 gesneden, waardoor de gefloxte exon wordt geëxcist. De HA-tagged Exon 4 is nu opgenomen in Rpl22 mRNA, het genereren van een HA gelabeld EPL22 in cellen uitdrukken CRE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig2a.jpg"> Figuur 2: Monsterfokschema voor RiboTag muizen. Het fokschema dat wordt gebruikt om proefdieren te genereren, wordt getoond. Er werd gebruik gemaakt van een tweeledig eis. In generatie 1 werden twee parallelle sets van fokkerstrio's opgericht. De ene kant combineerde het allel van belang (gedragen moederlijk als deze specifieke mutatie resulteert in mannelijke onvruchtbaarheid) met de hemizygous Cre en aan de andere kant het combineren van het allel van belang, opnieuw gedragen moederlijk, met Rpl22-HA. Dan, in generatie 2, mannetjes uit de eerste koppeling die het allel van belang dragen en de Cre worden gekruist naar vrouwelijke nakomelingen van de tweede koppeling die het allel van belang en Rpl22-HA dragen. De genotypen van de resulterende nakomelingen worden bepaald en experimenteel relevante dieren geselecteerd (in dit geval wildtype of homozygous mutant die zowel de Cre als de Rpl22-HA allelen draagt). Het is belangrijk op te merken voor kiemcel uitdrukken Cre-drivers,de Cre en Rpl22-HA allelen mogen niet samen worden gefokt tot de experimentele generatie. Blootstelling van het Rpl22-HA-allel aan kiemcel-uitgedruktcre in broedgeneraties zal kiemcel Rpl22-HA excisie stimuleren. Alle resulterende nakomelingen zullen wereldwijd Rpl22-HA uitdrukken en zo celspecifieke ribosome isolatie voorkomen. In het hierbeschreven systeem leverde een n = 4 per genotype voldoende statistisch vermogen voor downstream-analyses. Voor elk experimenteel systeem moet het biologische replicerende getal worden bepaald. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig2alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig3a.jpg"> Figuur 3: Bevestiging van negatieve controles. Monsters die Cre+ en Rpl22-HA+ zijn, tonen een hogere RNA pulldown dan monsters die alleen Cre+ of Rpl22-HA+ zijn. Er is geen significant verschil tussen Cre + en Rpl22-HA + monster RNA pulldown werkzaamheid, wat aangeeft dat monsters die niet de Cre of de Rpl22-HA zijn geschikt negatieve controles. Een "+" geeft aan dat het overeenkomstige allel of transgene in deze monsters aanwezig was en een "-" geeft de afwezigheid ervan aan. IP/input vertegenwoordigt de verhouding van RNA immunoprecipitated (IP) over totaal (input) RNA. Waarde berekend op basis van concentratie in nanogrammen. ** geeft p < 0025 aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig4.jpg"> Figuur 4: Reagentia impact protocol succes. (A) Flash bevroren weefsel resulteert in immunoneerslag efficiëntie vergelijkbaar met die van vers weefsel. B) Ip-efficiëntie voor twee commerciële antilichamen werd vastgesteld, aangeduid als Antibody 1 en Antibody 2 (Tabel met materialen). Bij het testen was Antibody 1 efficiënter in het naar beneden halen van RNA dan Antibody 2, dat geen onderscheid leek te kunnen maken tussen negatief (noch Cre of Rpl22-HA+) en positieve controles (zowel Cre als Rpl22-HA+uitdrukken). Stippen die wijzen op de verhouding van IPed versus input RNA voor individuele biologische repliceert. (C) Toen RNA-extractiekits(Table of Materials)werden vergeleken, presteerde Kit 2 aanzienlijk beter dan Kit 1. Hoewel beide kits een vergelijkbare hoeveelheid RNA uit negatieve controles hebben veroorzaakt, resulteerde Kit 2 in een aanzienlijk hogere RNA-opbrengst van positieve monsters. * geeft p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01 aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig4alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig5a.jpg"> Figuur 5: Toepassing van de methode op een mutant model. (A) Voorbeeld Gen van belang genotype bevestiging via westerse blotting met behulp van een aangepaste in-house antilichaam tegen het gen van belang eiwit toont Gen van belang-/- (M / M) mannetjes niet aan de bijbehorende eiwit te produceren. GAPDH weergegeven als een beladingscontrole. (B) Grafische bioanalyzer output van gekoppelde input en IPed monsters voor wildtype en mutant monsters. (C) Vergelijking RNA-integriteitsnummers (RIN) per monstertype en genotype. (D) Gemiddelde nucleotidelengte van RNA-soorten geanalyseerd door bioanalyzer op monstertype en genotype. * geeft p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01, NS niet significant aan. N = 4 per genotype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig6a.jpg"> Figuur 6: Voorbeeld van Cre driver bevestiging. Kwantificering van een gen dat vroeg in de ontwikkeling van kiemcellen(Stra8)en twee genen werd vertaald die laat in kiemcelontwikkeling(Tnp1 en Prm1)worden vertaald die door qRT-PCR van IMMUNOprecipitated van RPL22-HA worden geanalyseerd die door twee verschillende kiemcelCres wordt vertaald , Stra8-iCre (die vroeg in kiemcelontwikkeling wordt uitgedrukt) en Hspa2-Cre (die later in kiemcelontwikkeling wordt uitgedrukt, specifiek na vertaling Stra8). Hier wordt HA-IP van Stra8 bereikt met de vroege kiemcel Cre-bestuurder, maar niet met de latere kiemcel Cre-bestuurder die celspecifiekheid van de immunoneerslag aantoont. Ha-IP van transcripties die in late kiemcellen worden vertaald, wordt daarentegen bereikt door zowel Stra8-iCre als Hspa2-Cre. Dit wordt verwacht als cellen die uitdrukken Stra8-iCre zal genereren HA-tagged RPL22 gedurende het geheel van hun ontwikkeling, terwijl die uitdrukken Hspa2-Cre zal alleen doen tijdens de latere delen van hun ontwikkeling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse at JoVE.com

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

We hebben de eerder gepubliceerde RiboTag-methode verbeterd om de achtergrond aanzienlijk te verminderen. Dit maakt toepassing op complexe modellen zoals een mutant systeem eenvoudiger vanuit een analyse perspectief en veel minder duur. Afgezien van experimentele dierlijke generatie, de RiboTag methode is aanzienlijk eenvoudiger en eenvoudiger dan andere methoden om ribosoom geassocieerde mRNAs te analyseren.Net als alle RNA experimenten, strenge RNase vrije voorwaarden zijn fundamenteel voor succes. Als u beperkte ervaring met RNA hebt, controleer dan uw voorwaarden door eerst een basisRNA-extractie uit te voeren en vervolgens verder te gaan. Het aantonen van de procedure zal Lauren Chukrallah zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Om homogenisatiebuffer voor te bereiden, voegt u 2,5 milliliter van één molaire tris toe bij pH 7,4, vijf milliliter van één molaire kaliumchloride, 600 microliter van één molair magnesiumchloride en 500 microliter MP40 aan een buis van 50 milliliter. Voeg diethyl pyrocarbonaat behandeld water aan de buis om het volume te brengen tot 50 milliliter en meng totdat alle componenten zijn opgenomen. Om een zoutwasbuffer voor te bereiden, voegt u 2,5 milliliter van één molaire tris toe bij pH 7,4, 15 milliliter van één molair kaliumchloride, 600 microliter van één molair magnesiumchloride en 500 microliter MP40 tot een buis van 50 milliliter.Breng het naar het volume van 50 milliliter in diethyl pyrocarbonaat behandeld water en meng totdat alle componenten zijn opgenomen. Weeg alle monsterbuizen voor, neem het gewicht en koel af in vloeibare stikstof. Pre-cool steriele mortel, stamper, en weegspatel op droog ijs.Gebruik vervolgens op droogijs de voorgekoelde steriele mortel en stamper om bevroren weefselmonsters in grote stukken te breken en langzaam te malen tot een fijn poeder. Schraap met de voorgekoelde spatel het poeder uit de mortel in een voorgekoelde opvangbuis, waarbij het waar mogelijk op droogijs blijft. Weeg de buis met het weefselpoeder.Bereken de massa van het weefsel door het initiële gewicht van de buis af te trekken van het gewicht van de buis met het monster erin. Nota van deze waarde voor latere berekening van lysis buffer volumes. Bereid lyse buffer door toe te voegen in 10 milliliter van homogenisatie buffer dithiothreitol, RNase remmer, Cycloheximide, heparine, en een protease remmer tablet.Meng tot alle componenten zijn opgenomen en houd op ijs tot gebruik. Voor elke 100 milligram monster, voeg een milliliter lysis buffer. Met dezelfde pipet gebruikt om de lyse buffer toe te voegen, voorzichtig pipette de resulterende lysate op en neer om de cellen te fragmenteren en mix.Doorgaan met pipetten voor over het algemeen 25 tot 30 slagen totdat het monster niet langer stroperig is. Zet de monsters 10 minuten op ijs. Draai vervolgens de monsters in een voorgekoelde centrifuge bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten op 10.000 keer g.Aan de onderkant van de buis vormt zich een grote losse troebele pellet. Wees voorzichtig niet te storen de pellet, het verzamelen van de lysate in een nieuwe buis en het volume voor elk monster. Om monsterdegradatie te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de monsters koel blijven gedurende het resterende protocol dat waar mogelijk op ijs of op vier graden Celsius wordt opgeslagen.Bereken nu het vereiste volume magnetische kralen gekoppeld aan het juiste antilichaambindbare eiwit, eiwit G.Voor een milliliter lysaat, gebruik 375 microliter eiwit G kralen te bereiken 30 milligram per milliliter. Plaats de kraaloplossing in een buis van 1,7 milliliter op een magneetbuisrek. Verwijder het kraaloplosmiddel en voeg een gelijk volume van verse lyse buffer aan de kralen.Op een benchtop buis rotator ingesteld op 20 RPM op vier graden Celsius, draai de buis vijf minuten te wassen. Plaats de buis op het magneetbuisrek en verwijder de wasbuffer. Na het herhalen van de was nog twee keer, voeg lysis buffer op het oorspronkelijke volume om de kralen te equilibrate.Bewaar op vier graden Celsius of op ijs tot gebruik. Voeg 50 microliter van de geëquilibreerde kralen toe voor elke milliliter lysaat en draai een uur lang op vier graden Celsius. Plaats vervolgens de buis op het magneetrek en verzamel het lysaat in een verse buis.Gooi de gebruikte kralen weg. Voeg voor elke milliliter 25 microliter van de geëquilibreerde kralen toe en draai een uur lang op vier graden Celsius. Bewaar de resterende geëquilibreerde eiwit G kralen op vier graden Celsius 's nachts.Plaats 's ochtends de buis op het magneetrek en verzamel het lysaat in een verse buis. Gooi de gebruikte kralen weg. Bewaar van het gewiste lysaat 50 microliters als de controle van de monsterinvoer.Bewaar op min 80 graden Celsius. Voeg voor elke milliliter van het gerooide lysaat vijf microgram anti-HA-antilichaam toe. Om monsterverlies te voorkomen, sluit u de buisdop af met laboratoriumfolie en draait u de monsters 16 tot 18 uur bij vier graden Celsius.Voor elke milliliter van het gerooide lysaat, voeg 300 microliter eiwit G kralen. Sluit de buisdop opnieuw met laboratoriumfolie en draai twee uur bij vier graden Celsius. Plaats de monsterbuis op het magneetrek zodat de kralen zich kunnen scheiden van de IPed lysate.Pipette uit flow-through lysate en gooi, het behoud van de kralen. Voeg 800 microliter met zoutwasbuffer aan de kralen toe. Plaats de buis 10 minuten op een rotator bij vier graden Celsius.Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat de kralen scheiden van de was. Verwijder en gooi de was weg. Voeg nog eens 800 microliter hoge zout wasbuffers toe aan de kralen.Sluit de buis en laat het vijf minuten draaien bij vier graden Celsius. Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat de kralen scheiden van de was. Verwijder en gooi de was weg.Herhaal de was nogmaals. Voeg na de was 3,5 microliter van 14,2 molaire bèta-mercaptoethanol toe aan de kralen en meng door 15 seconden te vortexen. Extraher RNA met behulp van een commerciële RNA zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.Elute het monster in 30 microliter van RNase vrij water. Bewaar het monster op min 80 graden Celsius. In deze studie werd zeer weinig RNA geïsoleerd van de monsters die cre- of Rpl22HA's misten en de effectiviteit van dit protocol aantoonden om de IP-achtergrond te verminderen en echte HA-gelabelde ribosomale RNAs te isoleren.Een reeks antilichamen in RNA isolatieprotocollen werden getest in Cre en Rpl22HA positieve monsters. Deze resultaten tonen aan dat reagensselectie een aanzienlijke impact kan hebben op de IP-efficiëntie. De effectiviteit van het RiboTag-systeem om ribosoom-geassocieerd RNA te isoleren werd onderzocht.Voor zowel wilde invoer als IP-genotypen was de invoerconcentratie aanzienlijk hoger dan de IP-concentratie, wat erop duidt dat er meer RNA in het invoermonster zat. In totaal RNA-pools zouden de RNA-integriteitsnummerwaarden in de buurt van 10 zijn met een hogere RIN die gecorreleerd was aan een hogere afgeleide steekproefintegriteit en -kwaliteit. Hoewel de IP-monsters een lagere RIN hadden dan de inputs, waren de RIN's nog steeds binnen een aanvaardbaar bereik en waren ze niet afhankelijk van monstergenoment.Naast het fokken en onderhouden van RNase vrije omstandigheden, onderzoekers moeten ervoor zorgen dat ze verzamelen en houden elk voorgesteld monster. De input RNA is vooral de sleutel voor meerdere soorten downstream-analyses. Voor ons laboratorium voeren we over het algemeen RNA-sequencing uit na immunoprecipitatie.Dit stelt ons in staat om de hele transcript koepel query voor ribosoom associatie. Alternatieven zouden microarray-analyse of kwantitatieve RT-PCR omvatten. Voor ons stelt dit systeem ons in staat om veranderingen in ribosoom-geassocieerde RNAs te identificeren met mutatie van specifieke RNA-bindende eiwitten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Groei van de Preantral follikels muis onder gesimuleerde microzwaartekracht

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...