Name: ribotag immunoprecipitation in the germ cells of the male mouse
Uploaded: 2020-03-04T14:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse at JoVE.com

העבודה הזאת ממומנת על ידי NIH המענק R00HD083521 ל-EMS ותמיכה פנימית מאוניברסיטת רטגרס ל-EMS.

<ol>
	<li>Snyder, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+the+efferent+ducts,+epididymis,+and+vas+deferens+during+embryonic+development+of+the+mouse.">Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse.</a> Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).</li><li>Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+estrogen+and+testosterone+in+the+proximal+mouse+reproductive+tract.">Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract.</a> Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).</li><li>Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+meiotic+male+germ+cell+mRNAs+that+are+translationally+up-+and+down-regulated.">Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).</li><li>Busada, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+Kit+translation+during+spermatogonial+differentiation+in+the+mouse.">Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse.</a> Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).</li><li>Kleene, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+translational+regulation+in+the+mammalian+testis.">Patterns of translational regulation in the mammalian testis.</a> Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+expression+of+nucleoprotein+mRNAs+during+rat+and+mouse+spermiogenesis.">Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis.</a> Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).</li><li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites.">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li><li>Michel, A. M., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+a+Hi-Def+monitor+for+protein+synthesis+at+the+genome-wide+scale.">Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).</li><li>Snyder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+Heterozygosity+for+Y+Box+Proteins+Causes+Sterility+Due+to+Loss+of+Translational+Repression.">Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression.</a> PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Profiling+Analysis+of+mRNA+and+Associated+Proteins+Engaged+in+Translation.">Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+measurement+of+translation+by+ribosome+profiling.">Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling.</a> Methods. 126, 112-129 (2017).</li><li>Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+measurement+of+ribosomal+occupancy+by+ribosome+profiling.">Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling.</a> Methods. 85, 75-89 (2015).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag:+Ribosomal+Tagging+Strategy+to+Analyze+Cell-Type-Specific+mRNA+Expression+In+Vivo.">RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo.</a> Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag+analysis+of+actively+translated+mRNAs+in+Sertoli+and+Leydig+cells+in+vivo.">RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo.</a> PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Ceolin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-Specific+mRNA+Dysregulation+in+Hippocampal+CA1+Pyramidal+Neurons+of+the+Fragile+X+Syndrome+Mouse+Model.">Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).</li><li>Puighermanal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=drd2-cre:ribotag+mouse+line+unravels+the+possible+diversity+of+dopamine+d2+receptor-expressing+cells+of+the+dorsal+mouse+hippocampus.">drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus.</a> Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag+is+a+flexible+tool+for+measuring+the+translational+state+of+targeted+cells+in+heterogeneous+cell+cultures.">RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures.</a> Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).</li><li>The Jackson Laboratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , (2019).</li><li>Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incomplete+cre-mediated+excision+leads+to+phenotypic+differences+between+Stra8-iCre;+Mov10l1(lox/lox)+and+Stra8-iCre;+Mov10l1(lox/Delta)+mice.">Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice.</a> Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

הבנת התרגום של סוג תא מסוים היא לא יסולא בפז להבנת הפיזיולוגיה של התא במצב רגיל או מוטציה. יתרון מיוחד ניתן לראות במערכות שבהן התרגום אינו משולב מתמלול, כגון רקמה עצבית שבה התרגום מתרחש רחוק מאוד מתמלול, או בתאי נבט שבהם התמלול מתרחשת זמן רב לפני התרגום. ביחס לשיטות אחרות של ניתוח translatome, היתרון הגדול ביותר של מערכת ריבותג נובע מהשימוש במערכת recombinase של היצורים . זה מאפשר את החופש למקד כל האוכלוסייה תאים שיש לו מנהל התקן של היצור. שנית, ה-ריבותג IP כפי שמתואר בזאת הוא יעיל והרבה פחות מאתגרת טכנית וגוזלת זמן מאשר או polysome או הריבוכמה פרופילים. לבסוף, הריבותג IP ניתן לבצע בקלות על שחקן הספסל.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הצ ביניהם הוא הקמת קו העכבר הריבותג ויצירת בעלי חיים ניסיוניים ללמידה. באשר לכל הדגמים הגנטיים, מעקב קפדני של אנשים בתוך מושבת העכבר, כמו גם פרוטוקולים מזהירים הקלדה צריך להיות מיושם. ה-PCR הקלדה בהתאם לצאנז ואח ' צריך לכלול מיקוד התחל באתר loxp 5 ' של מסוג wildtype 4 כדי להבחין בין אללים מסוג wildtype (260 bp) ו המוטציות (290 bp)13. עבור המקרה של ניתוח ריבוטג במודלים תא הנבט, דרישות רבייה ספציפיים מאוד צריך להיות דבקה. ראשית, במקרה של מוטציות שגורמות פוריות, אסטרטגיות הרבייה מתחשב צריך לכלול שיטות כדי לייעל את מספר הצאצאים עם גנוטיפ הרצוי בדורות ביניים וניסיוני. שנית, במקרה של תא נבט מסוים Cres, הטיפול צריך להילקח על היצור -הזיבטיות בהתחשב רגישות של תאי הנבט כדי רעילות . בתא הנבט, רמות גבוהות של היצור חלבון יכול להיות השפעות מזיקות22, האוסר על שימוש בבעלי חיים של היצור /היצורים במזימת הרבייה. לבסוף, כאשר משתמשים בתאי הנבט שלהחיידק, חשוב לבודד את אלל הריבותג מן היצור עד הדור הסופי כמו ביטוי היצור בתא הנבט של דור ביניים יגרום צאצאים המבטא Rpl22-HA ברחבי העולם.
ללא קשר למערכת התאים, מספר פקדים מומלצים יכולים לאמת את החוסן של הביטוי והספציפיות של שני הצדדים. ביטוי נאות ליצור שלך וכריתה צפויה של Rpl22-HA ניתן לקבוע באמצעות שיטות מרובות. בתחילה, רקמות מבודדות מבעלי חיים ניסיוניים יכול להיות מוכתם עבור HA באמצעות אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence סנס15. שיטה זו היא אופטימלית בכך שהוא אינו דורש ידע מראש של mrnas מתורגם בסוגי תאי היעד. השיטה השניה, דוגמה המווכחת באיור 6, דורשת מידע מסוים אודות הודעות מווסתות באופן משני בסוגי תאי היעד. בשיטה זו, העשרה עבור mRNA מוסדר מבחינה מבצעית ניתן לאישור מן הנבחרמנהל התקן באמצעות PCR כמותי של iped לעומת RNA קלט. כמו כן, חזקה Rpl22-HA ביטוי יכול להיות מאושר על ידי השוואה של היצור +/rpl22 + דגימות (בקרות חיוביות) עם שני היצורים-/rpl22 + או היצור +/rpl22- דגימות הפועלות כפקדים יעילים שליליים (ראה איור 3). השוואות אלה ניתן על ידי בוצע על סך כולל RNA או העשרה עבור mRNA מוסדר מבחינה מבצעית המוערך על ידי רביעיית ה-PCR או כמה שיטה כמותית אחרת.
בעיות נפוצות בביצוע הפרוטוקול נוטות רק להיות ברור כאשר התשואה RNA הוא נמוך באופן בלתי צפוי או גבוה. הסיבה השכיחה ביותר לכשלים אלה נובעת מהקלדה שגויה של אנשים. אנו ממליצים על שמירה על רקמות נוספות ממדגם שנאסף כדי לאשר גנוטיפים של כל הדגימות במקרה של תשואות בלתי צפויות RNA. פעם אישר, אפשרויות אחרות צריך להיחשב כולל האפשרות של זיהום RNase או השפלה לדוגמה. אחסון זהיר לדוגמה וטיפול ותחזוקה של אזורים חינם RNase בתוך המעבדה יכול להפחית במידה ניכרת או לחסל בעיות אלה. למרות בעיות בידוד RNA הם עוד בעיה פוטנציאלית בפרוטוקול זה, השימוש ערכות מסחריות מפחיתה מאוד את הבעיה הזאת, למרות שצריך לנקוט כדי להבטיח שהם מתוחזקים כמו RNase חינם ולא מכילים פתרונות שפג תוקפם. לבסוף, כמו עם כל הליכים מבוססי נוגדן, וריאציות הרבה, תנאי אחסון, ריכוז, או אפילו משלוח יש את הפוטנציאל להשפיע לרעה את האיכות של הנוגדן ואת ההצלחה הבאה של הנפתח. כתוצאה מכך, בעקבות בדיקות זהירות וחוזרות, בחרנו את הנוגדן העקבי והיעיל ביותר הזמין.
פרוטוקול זה מכיל שני שינויים עיקריים ביחס לפרוטוקולי ריבותג אחרים שפורסמו, המשפרים באופן משמעותי את הסבירות להצלחה. אחד הוא היכולת להשתמש ברקמה הקפואה פלאש, ובכך לממש את כל הנושאים הכרוכים הרבה, טכנאי, או וריאציות הפעלה טכנית. דגימות ניתן לאסוף ולאחסן לאפשר בידוד של הריבוזומים מכל הדגימות בבת אחת, הפחתת מה יכול להיות מקורות עיקריים של וריאציה. שנית, תוספת של צעד מראש מפחית באופן משמעותי את סוג הרקע שדווחו על ידי משתמשים אחרים של מערכת ריבוtag. לאחרונה, דו ח פרוטוקול מאת צאנז ואח ' מציין את הנוכחות של רקע גבוה עקב שפע של התעתיקים הקשורים הריבוחלק מתאים מונעיםמיצורים שאינם מבוססי-יצור14. הפרוטוקול שלנו התרופות בעיה זו על ידי כלילת צעד מראש, ביעילות לחסל את הנוכחות של RNA ביצור דגימות IP שליליות.
כמו כל המערכות, יש לזכור את המגבלות הטמונות במערכת ה-ריבותג. בעת שימוש במנהלי התקנים שאינם מאופיינים, יש לבצע ניתוח של ביטוי לפני הפקת דגימה ניסיונית. מנקודת המבט של התרגום, יש לציין כמה ניואנסים של שיטה זו. ראשית, ריבוtag אינו מאפשר הבדלה בין mRNAs הצפוי לתרגם את אלה באופן פעיל תרגום. ככאלה, שיטות נוכחיות המבוססות על ריבוtag אינן מאפשרות לכמת את יעילות התרגום כפונקציה של mRNAs בודדים. אם יעילות התרגום היא עניין, ניתן למדוד אותה על בסיס ספציפי לתאים אם שיטת הריבותג משולבת עם כלי ניתוח אחרים, כגון יצירת פרופיל פוליזום. שנית, זה בסיסי לקחת בחשבון סה כ שינויים בשפע RNA הנובעים משונות תלויה בודדים או גנוטיפ. מסיבה זו, כי בידוד זהיר של הקלט RNA ללוות immunoprecipitation ודגימות נגזר כל להישאר מזווג בכל ניתוח במורד הזרם. לבסוף, ולגבי ניתוח מבוסס ריבוטג, יש לזכור כי הקשר עם ריבוכמה לא בהכרח להוכיח תרגום מתרחשת. יש לבצע שיטות ניתוח משניות כדי לאשר את הרגולציה הטרנסלבותית ביעדי העניין.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של RNAs המשויכים ל-ריבוחלק מתאי הנבט של עכברים זכרים באמצעות המודל ריבוtag. לא ראיית חשבון לגידול בעכבר ואוסף דגימות, הפרוטוקול לוקח יומיים, עם שלוש שעות ביום הראשון, הטוב ביותר בשעות אחר הצהריים, הדגירה לילה, ואחריו חמש שעות עבודה בשעות הבוקר שלאחר מכן. מומלץ מאוד כי הכנת פתרונות מניות (HB ו HSWB) כמו גם רקמות הגריסה להתבצע מראש. ההצלחה הכוללת של הפרוטוקול תלויה בתנאים הנכונים של ה-גנוטיפים ומסך RNase-free. היכולת לבחון את התרגום של סוגי תאים ספציפיים תאפשר למחקרים עתידיים להבין טוב יותר את הקשר בין שעתוק, תרגום, והפרוטדום בסוגי תאים רבים ורקע מוטציה.

ניתוח של שגשוג של תא או של רקמה, כפי שנבדק על ידי microarray או RNA-רצפי, הוכיחה כלי רב עוצמה כדי להבין את הנהגים המולקולריים של פנוטיפים מוטנטים. עם זאת, כלי ניתוח לא שלם יחסית לא יכול להודיע על הפיזיולוגיה או הפרוטאום של התא, במיוחד במערכות בהן mRNAs רבים מאוחסנים לפני התרגום כגון תאים עצביים ונבט. במערכות אלה, הגדרת האוכלוסייה של mrnas להיות מתורגם באופן פעיל לחלבונים, או הטרנסלציה של התא, יכול להיות אינדיקטור טוב יותר של המצב הפיזיולוגי הממשי של התא1,2. לדוגמה, תאי הנבט בשלבים שונים של התפתחות מתעתור RNAs כי הם מאוחסנים לתרגום מאוחר יותר, מונע על ידי התפתחות3 או איתות רמזים4. תהליך זה הוא לידי ביטוי על ידי mrnas קידוד protamines, שבו התמליל mrnas הוא לגילוי ימים לפני החלבון הוא עשה1,2,5,6. כמו כן, תאים עצביים מתעתיק RNA בגרעין ולהעביר אותו למטה axon, כמו במקרה עם β-actin7. בנוסף מערכות אלה תאים מיוחדים, מדינה יציבה הטרנססקריפט הם לא סביר להיות אינפורמטיבי במודלים שבו אחסון RNA, הריבוספר biogenesis, או תרגום mRNA מושפעים. גורמים אחרים מרובים עשויים גם להשפיע על המצב היציב של התא בריכת RNA כוללים את הריקבון mRNA ואת הפעילות של החלבונים איגוד RNA. במקרים אלה, כלים חזקים לניתוח RNAs או mRNAs המשויכים לחומרים תחת תרגום פעיל נוטים יותר להניב תוצאות רלוונטיות ביולוגית.
לשם כך, פותחו מספר שיטות לזיהוי הודעות הריבוחלק או הקשורות לתרגום פעיל. Polysome פרופיל, אשר מספק תמונה של הריבוכמה התעתיקים המשויכים, נעשה שימוש במשך עשורים רבים כדי לבודד RNAs שלמים הקשורים עם או הריבוזומלית או מונו-, di-, ו פולי-ריבוכמה מתחמי3. בקצרה, שנאספו lysates התא מוחלים על מעבר הדרגתי ומcentrifuged כמו מהירות גבוהה, וכתוצאה מכך הפרדת הריבוכמה יחידות המשנה, ריבוזומים שלמים, ו פוליזומים לפי גודל. באופן מסורתי, טכניקה זו הוחלה על מנת ללמוד מספר רב של mrnas, אבל לאחרונה שיטה זו שולבו עם המחקרים RNA-seq כדי להבהיר את הפונקציה של הרגולטורים הפוטנציאל translational8,9 בעוד דרך רבת עוצמה כדי להבדיל בין התרגום הפעיל לתרגם מרחוק mrnas10, polysome פרופילים דורש שיטות גוזלת זמן (שבירה הדרגתי ו ultracentrifuge) והוא יכול לדרוש הרבה מדגם ביצוע אוכלוסיות מאתגרות.
גישה חלופית כדי לבחון את הטרנסלטורה היא יצירת פרופיל ריבוזום, אשר מזהה את החלקים של התעתיקים הקשורים ישירות הריבוזום. בקצרה, ריבוכמה שברי הקשורים RNA מופקים באמצעות הגנה RNase, הריבוכמה מתחמי מופרדים באמצעות מעבר סוכות, ושברי הקשורים RNA מבודדים ומומרים לתגי RNA-seq מוכן לרצף עמוק11. אחד היתרונות המרכזיים ביצירת פרופיל ריבוכמה הוא היכולת לקבוע את המיקומים הספציפיים של הריבוזומים בזמן הבידוד המאפשר זיהוי של אתרי התחלה של תרגום, חישוב של תפוסת הריבוזומתית והפצה, וזיהוי של הריבוכמה דוכנים12. עם זאת, שיטה זו כוללת מספר חסרונות הטבועים ביניהם, כולל צרכי ציוד (שבירה וultracentrifuge), פרוטוקול מורכב יחסית הדורש פתרון בעיות נרחב, וסוגיות חישוביות שאינן מטופלות בקלות על ידי משתמש לא מנוסה11. חשוב לעשות זאת, באמצעות פרופיל ריבוחלק מוחל בעיקר על תאים מבודדים בתרבות ודורש חומר משמעותי, מה שהופך את היישום שלה לרקמות מעורבות מסוג תא או תאים ממוינים מתוך vivo מוגבל.
שיטת הריבוטג של היונקים, שפותחה על ידי צאנז ואח ' ב-200913, מבטלת מספר בעיות הטמונות הן polysome והן הריבוכמה פרופילים. בשיטה זו, rnas הקשורים בריבוחלק יכול להיות מבודד מתוך סוגי תאים ספציפיים המאפשרים חקירה של מסוג תאים מסוימים translatomes ברקמות מורכבות ללא טכניקות בידוד נוסף ציוד מיוחדות, כפי שנדרש בשיטות אחרות13,14. הבסיס של שיטת ריבותג הוא מודל העכבר הטרנסגניים (ריבותג) נושא מקום שונה עבור הגן החלבון הריבוRpl22של שנות ה-60. מקום זה (Rpl22-HA) כולל מסוף מוסף אקסון ואחריו עותק נוסף של אקסון מסוף שתוקן כדי לכלול C-terminal hemagגלוטין (HA) תג בתוך אזור הקידוד. כאשר חצה את העכבר המבטא Recombinase הספציפיים התא, אקסון מסומן מוסר המאפשר את הביטוי של HA-tagged RPL22 באופן ספציפי לתא (איור 1). לאחר מכן ניתן להשתמש בתג HA לimmunoprecipitate (IP) ולסוגי RNAs המשויכים להם מסוג התא שנבחר.
בנוסף לפרסום הראשוני שפיתח את הטכניקה, מספר מעבדות אחרות השתמשו במודל הריבוטג. רקמות מגוונות כגון עכבר sertoli ו ליידיג תאים15, מיקרוגלייה16, נוירונים בגיל17,18, oocytes19, ותאים מתורבת20 כבר פרופיל ולמד. למרות שפרוטוקול זה מסוגל באופן ברור לבודד את הריבוזומים ואת ה-RNAs המשויכים לאורך סוגי רקמות מגוונים, יש עדיין אזורים הזקוקים לשיפור, במיוחד כאשר הם מוחלים על מערכות מוטאנטים. בפרט, הסתמכות משותפת על תוצאות הרקמה הטרייה וריאציה טכנית מוגברת, אשר יכולה להפחית במידה ניכרת את כוחה של הניתוח. שנית, זיהוי בטוח של מטרות מתורגמות מבחינה דיפרנציאלי מאתגרת יותר כאשר הרקע הimmunoprecipitation גבוה מתרחש מסוגים שונים של תאים משולביםמחדש כפי שדווח בעבר13. בעוד שצאנז ואח ' מהונדסים את ההנחה הבסיסית של הטכניקה, בכתב יד זה המעבדה סניידר מציג אופטימיזציה של הפרוטוקול כדי להפחית את החששות הללו, עיבוד השיטה מעשית יותר ויעיל.
הכוונה של מאמר זה היא להסביר את השלבים עבור עכברים רבייה המבטא הריבוזומים הספציפיים לתא, immunoprecipitating הריבוזומים אלה מדגימות פלאש קפוא, וטיהור RNAs המשויכים שלהם עבור ניתוחי במורד הזרם. כמו תא הנבט זכר היונקים ומוטציה פוריות לחקור לספק אתגרים ייחודיים, נעשו מאמצים להאיר דרכים טכניקה זו ניתן להתאים למערכות תאים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithio-DL-threitol (8%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL or 2mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pippettes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18181</td>
			<td>Antibody 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA tag antibody</td>
			<td>Antibodies.com</td>
			<td>A85278</td>
			<td>Antibody 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>17490</td>
			<td>Or mice carrying Cre driver of choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>184-1100</td>
			<td>Or equivalent thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td>Or equivalent refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet rack</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Total RNA Kit 1</td>
			<td>OMEGA</td>
			<td>6834-01</td>
			<td>Kit 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Kit 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-2.5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI vortex-genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Or equivalent benchtop vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 1 mL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 10 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 20 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 200 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver / Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Or equivalent rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Powerpette Plus pipet controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75856-450</td>
			<td>Or equivalent pipette controller</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribotag immunoprecipitation in the germ cells of the male mouse

כימות ההבדלים mRNA שפע היא גישה קלאסית להבין את ההשפעה של מוטציה גן נתון על פיזיולוגיה התא. עם זאת, אפיון ההבדלים ב translatome (כל התרגום mRNAs) מספק שכבה נוספת של מידע שימושי במיוחד כאשר מנסים להבין את הפונקציה של RNA ויסות או מחייב חלבונים. מספר שיטות לביצוע זה פותחו, כולל הריבוכמה פרופיל וניתוח polysome. עם זאת, שתי השיטות נושאות אתגרים טכניים משמעותיים ואין אפשרות להחילם על אוכלוסיות תאים ספציפיות בתוך רקמה, אלא בשילוב עם שיטות מיון נוספות. לעומת זאת, השיטה של ריבוtag היא חלופה מבוססת גנטית, יעילה ומבחינה טכנית, המאפשרת זיהוי של מספר הריבוסים המשויכים של RNAs מאוכלוסיות תאים מסוימות מבלי להוסיף שלבי מיון שנוספו, בתנאי שמנהל התקן של יצור ספציפי לתא זמין. שיטה זו מורכבת הרבייה כדי ליצור את המודלים הגנטיים, אוסף לדוגמה, immunoprecipitation, ו-RNA ניתוח במורד הזרם. כאן, אנו מתווה את התהליך הזה בוגרים הזכר העכבר הנבט תאים המוטציה עבור חלבון איגוד RNA הנדרש פוריות הזכר. תשומת לב מיוחדת משולמת לשיקולים להתרבות עם דגש על ניהול מושבה יעיל והדור של רקע גנטי נכון וimmunoprecipitation על מנת להפחית את הרקע ולמטב את התפוקה. דיון על אפשרויות פתרון בעיות, ניסויים confirmatory נוספים, ויישומים פוטנציאליים במורד הזרם כלולים גם. הכלים הגנטיים המוצגים הפרוטוקולים המולקולריים מייצגים דרך רבת עוצמה כדי לתאר את הריבוכמה הקשורים RNAs של אוכלוסיות תאים ספציפיות ברקמות מורכבות או במערכות עם אחסון mRNA ותרגום עם המטרה של הסברה על נהגים מולקולריים של פנוטיפים מוטנטים.

הדיווחים הקודמים הציעו immunoprecipitation לא ספציפיים מתאים החסרים בתאי14. על מנת לקבוע אם זה היה במקרה בפרוטוקול שונה שלנו, יעילות IP נקבע בדגימות נגזר בעלי חיים שנשאו שני היצורים וגם Rpl22-HA ובעלי חיים שנשאו רק אחד, אבל לא השני עם הציפייה כי ללא שני הנהג, Rpl22-HA, immunoprecipitated RNA צריך להיות מינימלי. כפי שמוצג באיור 3, מעט מאוד RNA הוא מבודד מדגימות חסר או יצורים או Rpl22-HA להפגין את האפקטיביות של פרוטוקול זה כדי להפחית את רקע ה-IP בידוד הריבומקורית של מתויג HA-rnas. יתר על כן, הן רק הדגימות שלהיצור בלבד והן של Rpl22-HA-בלבד מייצגות פקדים שליליים מתאימים.
לאור הפוטנציאל למקור מגיב כדי להשפיע באופן משמעותי את היעילות של ה-IP, סדרה של נוגדנים ופרוטוקולים בידוד RNA נבדקו (איור 4) ביצור Rpl22-HA דגימות חיוביות. תוצאות אלה להפגין בחירה מגיב יכול להיות השפעה משמעותית על יעילות IP ולכן כל שינוי הבחירה מגיב צריך להיעשות כל כך בזהירות.
כדי לבדוק את הפרוטוקול הזה בהקשר של מוטציה של חלבון ה-RNA, מסוג wildtype+ Rpl22-ha + (ווילטיפ) ו- גן של עניין-/--היצור + Rpl22-ha + (גן העניין-/-) בדיקות נבדקו לאפקטיביות של מערכת ריבוtag לבודד הריבוכמה RNA הקשורים (איור 5). כאשר הריכוז RNA של קלט wildtype ו-ip הושווה גנים של עניין-/- קלט ו-ip, אין הבדל משמעותי נראה בין גנוסוגים. עם זאת, עבור הגנוטיפים, ריכוז הקלט היה גבוה באופן משמעותי מריכוז ה-IP, והצביע על כך שהיה יותר רנ א במדגם הקלט (איור 5ב). תוצאה זו צפויה, כמו לא כל הנוכחים mRNAs בתא משויכים הריבוכמה בכל זמן נתון, במיוחד במקרה של תאי הנבט שבו RNAs יכול להיות משועתק הרבה לפני שהם מתורגמים.
כדי לאשר את האיכות של דגימות ה-RNA שנשלחו לרצף, הדגימות הופעל על ביומנתח. מספרי שלמות RNA (RINs), מחושבים בדרך כלל כיחס של 28S ו-18S פסגות rRNA, השוו בין דגימות. בבריכות RNA בסך הכל, ערכי RIN צפויים להיות בקרבת 10 עם מתאם RIN גבוה יותר לשלמות דגימה גבוהה יותר ואיכות. בעוד דגימות ה-IP היה התחתון רין מאשר התשומות, RINs היו עדיין בתוך טווח מקובל ולא היו תלויים גנוטיפ לדוגמה (איור 5ג). ערכי RIN מופחתת עבור דגימות IPed סביר להניח תוצאה של השפלה RNA למרות מאוד קטין בהינתן ירידה קטנה יחסית באורך נוקלאוטיד הממוצע של RNAs מנותח. בהינתן אורך הפרוטוקול והטמפרטורות הנדרשות עבור הimmunoprecipitation חלק מההשפלה צפויה. ייתכן גם שהאורך הקטן של RIN ו-RNA הוא פונקציה של העשרה עבור מינים שאינם rRNA, כגון mRNAs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig1a.jpg"> איור 1: פעולת השירות ריבוtag. ההנחה של השיטה היא פשוטה ביולוגית. Exon חדש 4 מוכנס לתוך הרצף של Rpl22 לוקוס במורד במורד exon המקורי 4. בנוכחות של מנהל התקן של היצור , אתרים loxp משני צדי האקסון המקורי 4 הם חותכים, מקצץ את האקסון מופד. הHA-מתויג Exon 4 משולבים כעת Rpl22 mrna, יצירת HA מתויג Rpl22 בתאים המבטא את היצור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig2a.jpg"> איור 2: סכימת הרבייה לדוגמה עבור עכברים ריבוtag. מערכת הרבייה המשמשת להפקת. חיות נסיוניות מוצגת . שימוש בשני ראשים היה מנוצל בדור 1 הוקמו שתי סדרות מקבילות של שלישיות מגדלת. צד אחד בשילוב את אלל של עניין (נשא maternally כמו זה מוטציה התוצאות הספציפיות פוריות הזכר) עם הhemizygous ונים ועל השני שילוב אלל של עניין, שוב נשא maternally, עם Rpl22-HA. ואז, בדור 2, זכרים מן הזיווג הראשון שנושאים את אלל של העניין ואת היצור הם חצה צאצאים נקבה של הזיווג השני הנושא את אלל של עניין Rpl22-HA. ה-גנואים של הצאצאים המתקבלים נקבעים, ובעלי חיים רלוונטיים שנבחרו (במקרה זה או מhomozygous או מוטציה הנושאת הן את היצור ואת Rpl22-HA אלס). חשוב לציין כי תא נבט מביעמנהלי התקנים, היצורים Rpl22-HA אללים לא צריך להתרבות יחד עד הדור ניסיוני. חשיפת Rpl22-HA אלל כדי הנבט התא הביע היצורים בדורות הרבייה יהיה לנהוג בתאי הנבט Rpl22-HA כריתה. כל הצאצאים כתוצאה מכך יהיה כללי לבטא Rpl22-HA ובכך למנוע הריבומין ספציפי בידוד. במערכת שתוארה לעיל, n = 4 לכל סוג גנוטיפ סיפק כוח סטטיסטי מספיק עבור ניתוח במורד הזרם. יש לקבוע מספר שכפול ביולוגי עבור כל מערכת ניסויית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig3a.jpg"> איור 3: אישור של פקדים שליליים. דגימות כי הם היצורים והRpl22-HA + להראות RNA גבוה יותר מאשר דגימות כי הם היצור + או Rpl22-HA + לבד. אין הבדל משמעותי בין היצור + ו -Rpl22-HA + מדגם RNA הנפתח יעילות, המציין כי דגימות חסר או את היצור או Rpl22-HA הם שולט שלילי מתאים. "+" מעיד על כך שהאלייל או הטרנסגנים המקבילים קיימים בדוגמאות אלה ו-"-" מציין את היעדרותו. IP/קלט מייצג את היחס של RNA immunoprecipitated (IP) על סך (קלט) RNA. הערך שחושב מריכוז בננו-גרם. * * מציין p < 0025. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig4.jpg"> איור 4: ריאגנטים להשפיע על הפרוטוקול הצלחה. (A) הבזקמוקפארקמות תוצאות יעילות immunoprecipitation דומה לזה של רקמה טרייה. (ב) יעילות IP עבור שני נוגדנים מסחריים נקבעו, המיועד נוגדן 1 ו נוגדן 2 (טבלת חומרים). כאשר נבדק, הנוגדן 1 היה יעיל יותר במשיכת RNA מאשר הנוגדן 2 אשר הופיע להיות מסוגל להבדיל בין שלילי (לא לבטא את היצורים או Rpl22-ha +) ופקדים חיוביים (ביטוי הן היצורים וגם Rpl22-ha +). נקודות מעידה על היחס של הזנה לעומת RNA הקלט עבור משכפל ביולוגי בודד. (ג) כש-RNA מיצוי ערכות (טבלה של חומרים) הושוו, kit 2 משמעותית ביצעה קיט 1. למרות ששני הקיטים הללו כמות דומה של RNA מפקדים שליליים, ערכה 2 הביאה לתשואה של RNA גבוה באופן משמעותי מדגימות חיוביות. * מציין p < 0.05, * * p < 0.025, * * * p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig4alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig5a.jpg"> איור 5: יישום השיטה למודל מוטציה. (א) לדוגמה גן של גנוטיפ הריבית באמצעות הכתמים המערביים באמצעות נוגדן בבית מותאם אישית נגד הגן של חלבון הריבית מדגים גנים של עניין-/- (m/m) זכרים לא מצליחים לייצר את החלבון המשויך. המוצגת כבקרת טעינה. (ב) הפלט הביומנתח הגרפי מדגימות קלט ו-iped מדגמים משויכים לדוגמאות מסוג ומוטציות. (ג) השוואת מספרי שלמות RNA (RIN) לפי סוג דגימה וגנוטיפ. (ד) ממוצע הנוקלאוטיד באורך של מינים RNA שנותחו על ידי סוג מדגם ו-גנוטיפ. * מציין p < 0.05, * * p < 0.025, * * * p < 0.01, נ לא משמעותי. N = 4 לכל סוג של גנוטיפ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig6a.jpg"> איור 6: דוגמה לאישור מנהל התקן של יצור. קוונפיקציה של גן מתורגם מוקדם בפיתוח תא הנבט (Stra8) ושני גנים שתורגמו מאוחר בפיתוח תא הנבט (Tnp1 ו Prm1) שנותחו על ידי רביעיית-PCR של הIMMUNOPRECIPITATED RNA מ RPL22-HA מונע על ידי שני תאי נבטשונים של החיידק, Stra8-icre (ביטא מוקדם בפיתוח תא הנבט) ו Hspa2-היצורים (הביע בהמשך פיתוח תא הנבט, במיוחד לאחר Stra8 תרגום). כאן, HA-IP של Stra8 מושגת עם מוקדם תא נבט הנהג מנהל התקן אבל לא עם מאוחר יותר תא הנבט מנהל ההתקן להפגין תאים ספציפיות של immunoprecipitation. לעומת זאת, HA-IP של התעתיקים המתורגם בתאי הנבט מאוחר מושגת על ידי שניהם Stra8-iCre ו Hspa2-היצורים. זה צפוי כמו תאים המבטאים Stra8-iCre יפיק הRPL22 המתויג לאורך כל כולו של התפתחותם בעוד אלה המבטא Hspa2-היצורים יעשה זאת במהלך החלקים המאוחרים של התפתחותם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse at JoVE.com

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

שיפרנו את שיטת RiboTag שפורסמה בעבר כדי להפחית באופן משמעותי את הרקע. זה הופך את היישום למודלים מורכבים כמו מערכת מוטנטים לפשוט יותר מנקודת מבט של ניתוח והרבה פחות יקר. מלבד ייצור בעלי חיים ניסיוניים, שיטת RiboTag היא הרבה יותר קלה וישירה מאשר שיטות אחרות לנתח mRNAs הקשורים ריבוזום.כמו כל ניסויי RNA, תנאים חופשיים מחמירים RNase הם היסוד להצלחה. אם יש לך ניסיון מוגבל עם RNA, לבדוק את התנאים שלך על ידי ביצוע תחילה מיצוי RNA בסיסי ואז להמשיך הלאה. הפגנת ההליך תהיה לורן צ'וקראללה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להכין חיץ הומוגניזציה, להוסיף 2.5 מיליליטר של טריס טוחן אחד ב pH 7.4, חמישה מיליליטר של אשלגן כלורי אחד טוחן, 600 microliters של אחד מגנזיום כלוריד טוחן, ו 500 microliters של MP40 לצינור 50 מיליליטר. מוסיפים מים שטופלו בפירוקרבונט לצינור כדי להביא את הנפח ל-50 מיליליטר ומערבבים עד שכל הרכיבים משולבים. להכנת חיץ שטיפת מלח גבוה, הוסיפו 2.5 מיליליטר של טריס טוחן אחד ב-pH 7.4, 15 מיליליטר של אשלגן כלורי טוחן אחד, 600 מיקרוליטר של מגנזיום כלוריד אחד, ו-500 מיקרוליטר של MP40 לצינור 50 מיליליטר.מביאים אותו לנפח של 50 מיליליטר במים שטופלו דיטיל פירוקרבונט ומערבבים עד שכל הרכיבים משולבים. לפני לשקול את כל צינורות מדגם, להקליט את המשקל, מראש מגניב חנקן נוזלי. מרגמה סטרילית טרום קרירה, עלה, ומשקל מרית על קרח יבש.לאחר מכן על קרח יבש, להשתמש מרגמה סטרילית מקורר מראש ועלי לשבור דגימות רקמה קפואה פלאש לחתיכות גדולות לטחון אותו לאט לתוך אבקה דקה. באמצעות מרית מקורר מראש, לגרד את האבקה מן המרגמה לתוך צינור איסוף מקורר מראש דואג לשמור על קרח יבש במידת האפשר. לשקול את הצינור עם אבקת הרקמה.לחשב את המסה של רקמה על ידי חיסור המשקל הראשוני של הצינור מן המשקל של הצינור עם המדגם בו. רשום ערך זה עבור חישוב מאוחר יותר של אמצעי אחסון של מאגר תיזה. הכן חיץ תמוגה על ידי הוספת לתוך 10 מיליליטר של דיתיותריטול מאגר הומוגניזציה, מעכבי RNase, Cycloheximide, הפרין, וטבליה מעכבת פרוטאז אחת.מערבבים עד שכל הרכיבים משולבים ולשמור על קרח עד השימוש. עבור כל 100 מיליגרם של מדגם, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר תיזה. עם אותה פיפטה המשמשת להוספת מאגר התיזה, בזהירות pipette lysate וכתוצאה מכך למעלה ולמטה כדי לפצל את התאים ולערבב.המשך צינורות עבור בדרך כלל 25 עד 30 משיכות עד המדגם כבר לא צמיג. מניחים את הדגימות על קרח במשך 10 דקות כדי lyse. ואז לסובב את הדגימות בצנטריפוגה מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים גרם.גלולה גדולה ומעוננת רופפת נוצרת בתחתית הצינור. נזהר לא להפריע גלולה, לאסוף את lysate לתוך צינור חדש ולהקליט את עוצמת הקול עבור כל מדגם. כדי למנוע השפלה מדגם, להבטיח כי הדגימות להישאר קריר לאורך כל הפרוטוקול הנותר אחסון על קרח או בארבע מעלות צלזיוס בכל הזדמנות אפשרית.עכשיו, לחשב את הנפח הנדרש של חרוזים מגנטיים יחד עם חלבון מחייב נוגדנים המתאים, חלבון G.For מיליליטר אחד של ליסאט, להשתמש 375 microliters של גם G חלבון כדי להגיע 30 מיליגרם למיליליטר. מניחים את פתרון חרוז בצינור 1.7 מיליליטר על מתלה צינור מגנטי. הסר את ממס חרוזים ולהוסיף נפח שווה של מאגר תיזה טרי לחרוזים.על מסובב צינור ספסל להגדיר 20 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס, לסובב את הצינור חמש דקות לשטוף. מניחים את הצינור על מתלה הצינור המגנטי ומסירים את חיץ הכביסה. לאחר חזרה על לשטוף פעמיים נוספות, להוסיף מאגר תזה בנפח המקורי כדי לצייד את חרוזים.יש לאחסן בארבע מעלות צלזיוס או על קרח עד לשימוש. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חרוזים שיווי משקל עבור כל מיליליטר של ליט ולסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז למקם את הצינור על מתלה מגנט ולאסוף את lysate לתוך צינור טרי.השלך את חרוזים משומשים. לליזט, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של חרוזים שקוויבלים לכל מיליליטר ומסתובבים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. יש לאחסן את שאר גם חטיף החלבון G ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.בבוקר, מניחים את הצינור על מתלה המגנט ולאסוף את lysate לתוך צינור טרי. השלך את חרוזים משומשים. מן lysate פינה, לשמור 50 microliters כבקרת קלט מדגם.יש לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לכל מיליליטר של ליאזט פינה, להוסיף חמישה מיקרוגרם של נוגדן נגד HA. כדי למנוע אובדן מדגם, לאטום את כובע הצינור עם סרט מעבדה ולסובב את הדגימות 16 עד 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לכל מיליליטר של ליאזט פינה, להוסיף 300 microliters של חטוזי חלבון G. סותמים מחדש את מכסה הצינור עם סרט מעבדה ומסתובבים במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את צינור הדגימה על מתלה המגנט כדי לאפשר לחרוזים להיפרד מהליזת IPed.פיפטה את זרימה דרך ליאזט ולהשליך, שמירה על חרוזים. מוסיפים 800 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת מלח גבוה ללח. מניחים את הצינור על מסובב במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מניחים את צינור המדגם על מתלה המגנט ומאפשרים לחרוזים להיפרד מהכביסה. הסר והשליך את הכביסה. מוסיפים עוד 800 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת מלח גבוה ללח.סגור את הצינור ולאפשר לו להסתובב במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את צינור המדגם על מתלה המגנט ומאפשרים לחרוזים להיפרד מהכביסה. הסר והשליך את הכביסה.חזור על השטיפה פעם נוספת. לאחר הכביסה, מוסיפים 3.5 מיקרוליטר של 14.2 בטא-mercaptoethanol טוחן לחרוזים ומערבבים על ידי מערבולת במשך 15 שניות. יש לחלץ RNA באמצעות ערכת טיהור RNA מסחרית בהתאם להוראות היצרן.אלוט המדגם ב 30 microliters של מים חינם RNase. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. במחקר זה, מעט מאוד RNA היה מבודד מן הדגימות חסרות גם Cre או Rpl22HA המדגים את האפקטיביות של פרוטוקול זה כדי להפחית את רקע ה-IP ולבודד אמיתי HA מתויג RNAs ריבוזומלי.סדרה של נוגדנים בפרוטוקולי בידוד RNA נבדקו בדגימות חיוביות Cre ו- Rpl22HA. תוצאות אלה מראות שלבחירת סוגים של ריג'נטים יכולה להיות השפעה משמעותית על יעילות ה-IP. נבדקה האפקטיביות של מערכת RiboTag לבידוד RNA הקשור לריבוזום.הן עבור קלט סוג פראי והן עבור גנוטיפים של IP, ריכוז הקלט היה גבוה משמעותית מריכוז ה- IP המציין כי היה יותר RNA בדגימה הקלט. בסך הכל מאגרי RNA, ערכי מספר שלמות RNA היו צפויים להיות קרובים 10 עם RIN גבוה יותר בקורלציה גבוהה יותר להסיק שלמות מדגם ואיכות גבוהה יותר. בעוד שלדגימות ה- IP היה RIN נמוך יותר מהקלטות, ה- RINs היו עדיין בטווח קביל ולא היו תלויים ב- genotype לדוגמה.מלבד הרבייה ושמירה על תנאים חופשיים RNase, החוקרים צריכים לוודא שהם אוספים ולשמור כל מדגם הציע. RNA הקלט במיוחד הוא המפתח עבור סוגים מרובים של ניתוחים במורד הזרם. עבור המעבדה שלנו, אנו מבצעים בדרך כלל ריצוף RNA לאחר immunoprecipitation.זה מאפשר לנו לתבוע את כל כיפת התמליל עבור אסוציאציה ריבוזום. חלופות יכללו ניתוח microarray או RT-PCR כמותי. עבורנו, מערכת זו מאפשרת לנו לזהות שינויים ב- RNAs הקשורים לריבוזום עם מוטציה של חלבונים מחייבים RNA ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

דור של תאים אנושיים כמו תא הנבט הקדמונים על פני השטח של גופים Embryoid מן pluripotency בשלה המושרה בתאי גזע Pluripotent

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...