Name: ribotag immunoprecipitation in the germ cells of the male mouse
Uploaded: 2020-03-04T14:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse at JoVE.com

Эта работа была профинансирована грантом NIH NICHD R00HD083521 для EMS и внутренней поддержкой от Ратгерского университета до EMS.

<ol>
	<li>Snyder, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+the+efferent+ducts,+epididymis,+and+vas+deferens+during+embryonic+development+of+the+mouse.">Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse.</a> Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).</li><li>Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+estrogen+and+testosterone+in+the+proximal+mouse+reproductive+tract.">Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract.</a> Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).</li><li>Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+meiotic+male+germ+cell+mRNAs+that+are+translationally+up-+and+down-regulated.">Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).</li><li>Busada, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+Kit+translation+during+spermatogonial+differentiation+in+the+mouse.">Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse.</a> Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).</li><li>Kleene, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+translational+regulation+in+the+mammalian+testis.">Patterns of translational regulation in the mammalian testis.</a> Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+expression+of+nucleoprotein+mRNAs+during+rat+and+mouse+spermiogenesis.">Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis.</a> Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).</li><li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites.">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li><li>Michel, A. M., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+a+Hi-Def+monitor+for+protein+synthesis+at+the+genome-wide+scale.">Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).</li><li>Snyder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+Heterozygosity+for+Y+Box+Proteins+Causes+Sterility+Due+to+Loss+of+Translational+Repression.">Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression.</a> PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).</li><li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Profiling+Analysis+of+mRNA+and+Associated+Proteins+Engaged+in+Translation.">Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).</li><li>McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+measurement+of+translation+by+ribosome+profiling.">Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling.</a> Methods. 126, 112-129 (2017).</li><li>Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+measurement+of+ribosomal+occupancy+by+ribosome+profiling.">Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling.</a> Methods. 85, 75-89 (2015).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag:+Ribosomal+Tagging+Strategy+to+Analyze+Cell-Type-Specific+mRNA+Expression+In+Vivo.">RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo.</a> Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag+analysis+of+actively+translated+mRNAs+in+Sertoli+and+Leydig+cells+in+vivo.">RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo.</a> PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Ceolin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-Specific+mRNA+Dysregulation+in+Hippocampal+CA1+Pyramidal+Neurons+of+the+Fragile+X+Syndrome+Mouse+Model.">Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).</li><li>Puighermanal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=drd2-cre:ribotag+mouse+line+unravels+the+possible+diversity+of+dopamine+d2+receptor-expressing+cells+of+the+dorsal+mouse+hippocampus.">drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus.</a> Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboTag+is+a+flexible+tool+for+measuring+the+translational+state+of+targeted+cells+in+heterogeneous+cell+cultures.">RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures.</a> Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).</li><li>The Jackson Laboratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , (2019).</li><li>Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incomplete+cre-mediated+excision+leads+to+phenotypic+differences+between+Stra8-iCre;+Mov10l1(lox/lox)+and+Stra8-iCre;+Mov10l1(lox/Delta)+mice.">Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice.</a> Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Понимание транслатома определенного типа клеток имеет неоценимое значение для более точного понимания физиологии клетки в нормальном или мутантном состоянии. Особая польза наблюдается в системах, в которых перевод разъединяется от транскрипции, например, в нервной ткани, где перевод происходит очень далеко от транскрипции, или в зародышевых клетках, где транскрипция происходит задолго до перевода. По сравнению с другими методами анализа транслатомов, наибольшее преимущество системы RiboTag происходит от использования системы рекомбиназы Cre. Это позволяет свободно ориентироваться на любую популяцию клеток, которая имеет соответствующий драйвер Cre. Во-вторых, IIP RiboTag, как описано в настоящем документе, является эффективным и гораздо менее технически сложным и трудоемким, чем полисомного или рибосомное профилирование. Наконец, RiboTag IP может быть легко выполнена на скамейке.
В этом протоколе есть ряд важных шагов. Главным из них является создание линии мыши RiboTag и создание экспериментальных животных для изучения. Что касается всех генетических моделей, тщательное отслеживание лиц в колонии мыши, а также тщательного генотипирования протоколы должны быть применены. ПЦР генотипирования в соответствии с Sanz et al. должны включать в себя грунтовки ориентации loxP сайт 5' из дикого типа экзон 4 различать wildtype аллелей (260 bp) и мутант (290 bp)13. Для анализа RiboTag в моделях зародышевых клеток следует соблюдать очень специфические требования к разведению. Во-первых, в случае мутантов, которые приводят к бесплодию, продуманные стратегии разведения должны включать методы оптимизации количества потомства с желаемым генотипом в промежуточных и экспериментальных поколениях. Во-вторых, в случае зародышевых клеток конкретных Cres, следует принимать меры в отношении Cre-zygosity учитывая чувствительность зародышевых клеток Cre токсичности. В зародышевой клетке, высокий уровень белка Cre может иметь вредные эффекты22, запрещая использование Cre / Cre животных в схеме размножения. Наконец, при использовании зародышевой клетки Cres, важно, чтобы изолировать аллель RiboTag от Cre до последнего поколения, как Cre выражение в зародышевой клетке промежуточного поколения приведет к потомству, выражая Rpl22-HA во всем мире.
Независимо от клеточной системы, ряд рекомендуемых элементов управления можно проверить надежность как Cre выражения и специфичности. Правильное выражение вашего Cre и ожидаемое иссечение Rpl22-HA можно определить несколькими методами. В первом, ткани, изолированные от экспериментальных животных могут быть окрашены для HA с помощью либо иммуногистохимии или иммунофлуоресценции15. Этот метод является оптимальным в том, что он не требует априорных знаний переведенных мРНК в типах целевых клеток. Второй метод, пример которого показан на рисунке 6,требует некоторых знаний о переводчески регулируемых сообщениях в типах целевых ячеек. В этом методе обогащение для известной переводно регулируемой мРНК может быть подтверждено выбранным Драйвером Cre,используя количественные ПЦР IPed по сравнению с входиной РНК. Аналогичным образом, надежное выражение Rpl22-HA может быть подтверждено сравнением образцов Cre/Rpl22 (положительный контроль) с cre-/Rpl22 или Cre/Rpl22- образцами, которые действуют как эффективные отрицательные элементы управления (см. рисунок 3). Эти сравнения могут быть сделаны либо по общей IPed РНК или обогащения для известных переводически регулируемых мРНК оценивается qRT-PCR или какой-либо другой количественный метод.
Общие проблемы при исполнении протокола, как правило, становятся очевидными только тогда, когда доходность РНК неожиданно низка яснее или высока. Наиболее распространенной причиной этих сбоев являются неправильные генотипирования лиц. Мы рекомендуем сохранить дополнительную ткань из собранного образца для подтверждения генотипов всех образцов в случае непредвиденных урожаев РНК. После подтверждения следует рассмотреть другие возможности, включая возможность загрязнения RNase или деградации образцов. Тщательное хранение образцов и обработка и обслуживание свободных зон RNase в лаборатории может значительно уменьшить или устранить эти проблемы. Хотя вопросы изоляции РНК являются еще одной потенциальной проблемой в этом протоколе, использование коммерческих комплектов значительно снижает эту проблему, хотя следует позаботиться о том, чтобы они были сохранены как RNase бесплатно и не содержат решений с истекшим сроком годности. Наконец, как и во всех антителах на основе процедур, изменения в партии, условия хранения, концентрации, или даже судоходства имеют потенциал, чтобы негативно повлиять на качество антитела и последующий успех вырубки. В результате, после тщательного и повторного тестирования, мы выбрали наиболее последовательные и эффективные антитела доступны.
Этот протокол содержит два основных изменения по сравнению с другими опубликованными протоколами RiboTag, которые значительно повышают вероятность успеха. Одним из них является возможность использования флэш замороженных тканей, тем самым смягчая любые проблемы, связанные с много, техник, или технические вариации запуска. Образцы могут быть собраны и сохранены, что позволяет изоляцию HA-рибосом ы от всех образцов одновременно, снижая то, что может быть основным источником вариации. Во-вторых, добавление преклирного шага существенно снижает фон, о который сообщают другие пользователи системы RiboTag. Недавно, протокол доклада Sanz et al. указывает на наличие высокого фона из-за обилия рибосомы связанных стенограмм изне-Cre-управляемыхклеток14. Наш протокол устраняет эту проблему, включая предочистный шаг, эффективно устраняя присутствие РНК в образцах ИС.
Как и все системы, следует иметь в виду присущие системе RiboTag ограничения. При использовании нехарактерных драйверов Cre, анализ экспрессии должен быть выполнен до экспериментального производства образца. С точки зрения перевода следует отметить несколько нюансов этого метода. Во-первых, RiboTag не допускает дифференциации между мРНК, готовых к переводу, и теми, кто активно переводит. Таким образом, современные методы, основанные на RiboTag, не позволяют количественно определить эффективность перевода как функцию отдельных мРНК. Если эффективность перевода представляет интерес, она может быть измерена на основе клеточной основе, если метод RiboTag сочетается с другими инструментами анализа транслатомов, такими как полисомное профилирование. Во-вторых, принципиально важно учитывать общие изменения изобилия РНК, вытекающие из индивидуальной или генотипной зависимости дисперсии. Именно по этой причине тщательная изоляция входной РНК сопровождает иммунопрециционные пробы, а образцы, полученные из каждого из них, остаются в паре на протяжении всех анализов вниз по течению. Наконец, и что касается анализа на основе RiboTag, следует помнить, что связь с рибосомой не обязательно доказывает перевод. Следует проводить вторичные методы анализа для подтверждения трансляционного регулирования целевых показателей, представляющих интерес.
Этот протокол описывает изоляцию рибосомных РНК от зародышевых клеток мышей мужского пола с использованием модели RiboTag. Не учитывая разведение мышей и сбор проб, протокол занимает два дня, с трех часов в первый день, лучше всего сделать во второй половине дня, ночная инкубация, а затем пять часов работы последующее утро. Настоятельно рекомендуется заранее готовить биржевые растворы (HB и HSWB), а также шлифовку тканей. Общий успех протокола зависит от правильного генотипирования и строго без RNase условий. Способность исследовать транслатом конкретных типов клеток позволит будущим исследованиям лучше понять взаимосвязь между транскрипцией, переводом и протеомом в бесчисленных типах клеток и мутантных фонах.

Анализ рнкона клетки или ткани, как и с помощью микроаррей или РНК-секвенирования, оказался мощным инструментом для понимания молекулярных драйверов фенотипов мутантов. Тем не менее, эти относительно неполные инструменты анализа не могут информировать о физиологии или протеоме клетки, особенно в системах, где многие мРНК хранятся до перевода, такие как нервные и зародышевые клетки. В этих системах определение популяции мРНК, активно переводимых в белок, или транслатом клетки, может быть лучшим показателем фактического физиологического состояния клетки1,2. Например, зародышевые клетки на различных стадиях разработки транскрибируют РНК, которые хранятся для последующего перевода, движимые либо развитием3, либо сигналами4. Этот процесс является примером мРНК кодирования протаминов, в котором транскрипт мРНК обнаруживается дней до белка производится1,2,5,6. Аналогичным образом, нервные клетки транскрибируют РНК в ядре и транспортируют ее вниз по аксону, как в случае с Q-actin7. В дополнение к этим специализированным клеточным системам, транскриптомы устойчивого состояния вряд ли будут информативными в моделях, где происходит хранение РНК, рибосомный биогенез или перевод мРНК. Несколько других факторов могут также повлиять на устойчивый состояние РНК пула клетки включают распад мРНК и активность РНК связывающих белков. В этих случаях надежные инструменты для анализа связанных с рибосомами РНК или мРНК при активном переводе с большей вероятностью дают биологически значимые результаты.
С этой целью было разработано несколько методов для выявления связанных с рибосомами или активно переведенных сообщений. Полисом профилирование, которое обеспечивает снимок рибосомы связанных стенограмм, был использован в течение многих десятилетий, чтобы изолировать нетронутыми РНК, связанных с либо рибосомных подразделений или моно-, ди-, и поли-рибосомы комплексов3. Кратко, собранные lysates клетки прикладываются к линейному градиенту сахарозы и центрифугированы как высокая скорость, приводящ к в разделении ингосомных subunits, неповрежденных ribosomes, и polysomes размером. Традиционно, этот метод был применен для изучения одного или нескольких мРНК, но в последнее время этот метод был объединен с РНК-сек исследований для выяснения функции потенциальных регуляторов переводов8,9 В то время как мощный способ различать активно преобразующих и не-преобразующих мРНК10, полисомное профилирование требует трудоемких методов (градиентов фракционное и ультрацентричная сделка) населения, сложное.
Альтернативным подходом к изучению транслатома является рибосомное профилирование, которое определяет части стенограмм, непосредственно связанных с рибосомой. Короче говоря, рибосомы связанные фрагменты РНК генерируются с помощью анализа защиты RNase, отдельные рибосомные комплексы, разделенные через градиент сахарозы, и связанные фрагменты РНК изолированы и преобразованы в РНК-сек теги поддаются глубокому секвенированию11. Одним из ключевых преимуществ рибосомного профилирования является возможность определить конкретные места рибосом во время изоляции, что позволяет идентифицировать места начала перевода, расчет рибосомной занятости и распределения, а также идентификацию рибосомных киосков12. Тем не менее, этот метод имеет несколько присущих недостатков, в том числе потребности в оборудовании (градиентный фракционный и ультрацентрифуг), относительно сложный протокол, который требует обширного устранения неполадок, и вычислительные проблемы не легко обрабатываются неопытным пользователем11. Важно отметить, что рибосомное профилирование в первую очередь применяется к изолированным клеткам в культуре и требует существенного материала, что делает его применение к смешанным тканям клеточного типа или отсортированным клеткам из in vivo ограниченным.
Метод млекопитающих RiboTag, разработанный Sanz et al. в 2009 году13,устраняет ряд проблем, присущих как полисомного, так и рибосомному профилированию. В этом методе, рибосомы связанных РНК могут быть изолированы от конкретных типов клеток, позволяющих для исследования клеточного типа конкретных транслатомов в сложных тканях без дополнительных методов изоляции и специализированного оборудования, как это необходимо в других методах13,14. Основой метода RiboTag является трансгенная модель мыши (RiboTag), несущая модифицированный локус для 60S рибосомного субъемаального белка гена Rpl22. Этот локус(Rpl22-HA) включает в себя флоксс терминал азон с последующим дополнительной копией терминала экзон с поправками, чтобы включить C-терминал гемагглютинин (HA) тег в области кодирования. При пересечении с мышью, выражающей клеточную cre Recombinase, флоксированный экзон удаляется, позволяя выражение HA-тегами RPL22 в клеточном порядке(рисунок 1). Тег HA может быть использован для иммунопреципитата (IP) рибосом и связанных с ними РНК из выбранного типа клеток.
В дополнение к первоначальной публикации, которая разработала метод, несколько других лабораторий использовали модель RiboTag. Разнообразные ткани, такие как мыши Sertoli и Leydig клетки15, микроглии16, нейроны17,18, ооциты19, и культивированные клетки20 были профилированы и изучены. Хотя этот протокол, безусловно, в состоянии успешно изолировать рибосомы и связанные с ними РНК через различные типы тканей Есть еще области, нуждающиеся в улучшении, особенно при применении к мутантным системам. В частности, общая зависимость от свежей ткани приводит к увеличению технических изменений, которые могут значительно уменьшить мощность анализа. Во-вторых, уверенная идентификация дифференциально переведенных целей становится более сложной, когда высокий фон иммунопреципиции происходит отне-Cre рекомбинированных типов клеток, как сообщалось ранее13. В то время как Sanz et al. спроектировали основную предпосылку метода, в этой рукописи лаборатория Снайдера представляет оптимизацию протокола, чтобы уменьшить эти проблемы, делая метод более практичным и эффективным.
Цель этой статьи состоит в том, чтобы объяснить шаги для разведения мышей, выражающих клеток конкретных HA-тегами рибосомы, иммуноподготовки этих рибосом от флэш-замороженных образцов, и очистка их связанных РНК для дальнейшего анализа вниз по течению. По мере того как mammalian мыжская клетка зародыша и изученная мутация неплодородности обеспечивают уникально возможности, усилия были сделаны для того чтобы осветить дороги этот метод можно приспособить к другим системам клетки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithio-DL-threitol (8%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL or 2mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pippettes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18181</td>
			<td>Antibody 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA tag antibody</td>
			<td>Antibodies.com</td>
			<td>A85278</td>
			<td>Antibody 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>17490</td>
			<td>Or mice carrying Cre driver of choice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>184-1100</td>
			<td>Or equivalent thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000537</td>
			<td>Or equivalent refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7698-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet rack</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Total RNA Kit 1</td>
			<td>OMEGA</td>
			<td>6834-01</td>
			<td>Kit 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiRNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Kit 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-2.5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>M0314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI vortex-genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Or equivalent benchtop vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 1 mL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 10 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 20 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for 200 uL mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver / Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td>Or equivalent rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Powerpette Plus pipet controller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75856-450</td>
			<td>Or equivalent pipette controller</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ribotag immunoprecipitation in the germ cells of the male mouse

Количественная разница в изобилии мРНК является классическим подходом к пониманию влияния данной генной мутации на физиологию клеток. Однако, характеризующие различия в транслатоме (целом переведенных мРНК) обеспечивает дополнительный слой информации, особенно полезной при попытке понять функцию РНК регулирующих или связывающих белков. Для достижения этой цели был разработан ряд методов, включая рибосомное профилирование и полисомный анализ. Однако оба метода несут значительные технические проблемы и не могут быть применены к определенным популяциям клеток в ткани, если в сочетании с дополнительными методами сортировки. В отличие от этого, метод RiboTag является генетическим, эффективным и технически простой альтернативой, которая позволяет идентифицировать рибосомы связанных РНК из конкретных популяций клеток без дополнительных шагов сортировки, при условии, что применимый драйвер Cre для клеток имеется. Этот метод состоит из размножения для генерации генетических моделей, сбора образцов, иммунопрециционности и анализа РНК. Здесь мы излагаем этот процесс во взрослых мужских клетках зародышевых клеток мутант для РНК связывающий белок, необходимый для мужской плодовитости. Особое внимание уделяется вопросам селекции с акцентом на эффективное управление колониями и генерацию правильного генетического происхождения и иммунопреципции в целях снижения фона и оптимизации производства. Обсуждение вариантов устранения неполадок, дополнительных подтверждающих экспериментов и потенциальных приложений вниз по течению также включено. Представленные генетические инструменты и молекулярные протоколы представляют собой мощный способ описания рибосомных РНК конкретных клеточных популяций в сложных тканях или в системах с аномальным хранением мРНК и переводом с целью информирования о молекулярных драйверах фенотипов мутантов.

Предыдущие доклады предложили неспецифических иммунопреципиции из клеток, не хватает Cre14. Для того, чтобы определить, если это было так в нашем измененном протоколе, эффективность ИС была определена в образцах, полученных от животных, перевозящих как Cre и Rpl22-HA и животных, перевозящих только один, но не другой в надежде, что без как Cre-драйвери Rpl22-HA, иммунопрогифицированной РНК должна быть минимальной. Как показано на рисунке 3, очень мало РНК изолирована от образцов, не хватает либо Cre или Rpl22-HA, демонстрирующих эффективность этого протокола для уменьшения ФОНа ИС и изолировать подлинные HA-тегами рибосомных РНК. Кроме того, как Cre-только и Rpl22-HA-толькообразцы представляют подходящий отрицательный контроль.
Учитывая потенциал для источника реагентов, чтобы существенно повлиять на эффективность ИС, ряд антител и протоколов изоляции РНК были протестированы(рисунок 4) в Cre и Rpl22-HA положительных образцов. Эти результаты показывают, что выбор реагентов может оказать значительное влияние на эффективность ИС, поэтому любые изменения в выборе реагентов должны быть сделаны с осторожностью.
Для того, чтобы проверить этот протокол в контексте РНК связывающего белка мутант, дикий тип-Cre'Rpl22-HA (дикий тип) и ген интереса-/--Cre'Rpl22-HA » (Ген интерес-/-) тестбыли для эффективности системы RiboTag, чтобы изолировать рибосому связанных РНК (Рисунок 5). Когда концентрация РНК ввода дикого типа и ИС сравнивалась с геном интереса-/- ввод и ИС, между генотипами не наблюдалось существенной разницы. Для обоих генотипов, однако, концентрация входных данных была значительно выше, чем концентрация ИС, что свидетельствует о том, что в входная проба была больше РНК(рисунок 5В). Этот результат ожидается, так как не все мРНК, присутствующие в клетке, связаны с рибосомой в любой момент времени, особенно в случае зародышевых клеток, где РНК могут быть транскрибированы задолго до их перевода.
Для подтверждения качества образцов РНК, отправленных для секвенирования, пробы запускались на биоанализаторе. Номера целостности РНК (RINs), обычно рассчитанные как соотношение пиков 28S и 18S rRNA, были сопоставлены в разных образцах. В общем объеме РНК-пулов значения RIN, как ожидается, будут близки к 10 с более высоким RIN, что коррелирует с более высокой достоверностью и качеством взятых на себя образцов. Хотя образцы ИС имели более низкий RIN, чем входные данные, RINs все еще находились в пределах приемлемого диапазона и не зависели от генотипа образцов(рисунок 5C). Снижение значений RIN для образцов IPed, вероятно, является результатом деградации РНК, хотя и очень незначительным, учитывая относительно небольшое снижение средней длины нуклеотидов анализируемых РНК. С учетом продолжительности протокола и температуры, необходимых для иммунопротебова, ожидается некоторое ухудшение. Возможно также, что уменьшенная длина РИН и РНК является функцией обогащения для видов, не относящихкся к РНК, таких как мРНК.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig1a.jpg"> Рисунок 1: Метод RiboTag. Предпосылка метода биологически проста. Новый Exon 4 вставляется в последовательность для локуса Rpl22 вниз по течению от оригинального Exon 4. В присутствии драйвера Cre, loxP сайтов по обе стороны от первоначального Exon 4 вырезать, иссечение флоксированный экзон. HA-tagged Exon 4 теперь включен в Rpl22 mRNA, генерируя HA помеченный RPL22 в клетках, выражающих CRE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig1alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig2a.jpg"> Рисунок 2: Схема размножения образцов для мышей RiboTag. Показана схема размножения, используемая для создания экспериментальных животных. Была использована двухсторонная схема. В поколении 1 были созданы два параллельных набора селекционеров трио. Одна сторона совмещала аллель интереса (снесенная матерински по мере того как эта специфическая перегласовка приводит к в мыжом неплодородности) с hemizygous Cre и с другой совмещая аллель интереса, снова снесено матерински, с Rpl22-HA. Затем, в поколении 2, мужчины из первого спаривания, которые несут аллель интереса и Cre перечеркивают на женское потомство второго спаривания, которые несут аллель интереса и Rpl22-HA. Определены генотипы полученного потомства и выбраны экспериментально соответствующие животные (в данном случае либо дикий тип, либо гомозигоусный мутант, несущий как аллели Cre, так и Rpl22-HA). Важно отметить, для зародышевых клеток, выражающих Cre-драйверов, Cre и Rpl22-HA аллели не должны размножаться вместе до экспериментального поколения. Воздействие аллеля Rpl22-HA на зародышевые клетки выраженные Cre в разведении поколений будет управлять зародышевой клетки Rpl22-HA иссечение. Любое полученное потомство будет глобально выражать Rpl22-HA, таким образом предотвращая клеточную изоляцию рибосом. В описанной в настоящем проекте системе n q 4 на генотип обеспечиваетдостаточную статистическую мощность для анализа ниже по течению. Биологическое число репликации должно быть определено для каждой экспериментальной системы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig2alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig3a.jpg"> Рисунок 3: Подтверждение отрицательного контроля. Образцы, которые Cre и Rpl22-HA' показывают более высокий вытягивание РНК, чем образцы, которые Cre или Rpl22-HA ' в одиночку. Существует никакой существенной разницы между Cre и Rpl22-HA' образец РНК вытягивания эффективности, что свидетельствует о том, что образцы не хватает либо Cre или Rpl22-HA являются подходящими отрицательными элементами управления. В "Я" указывается, что в этих образцах присутствовал соответствующий аллель или трансген, и "-" означает его отсутствие. IP/input представляет собой соотношение РНК иммунопреципицитированных (IP) над общей (вводной) РНК. Значение, рассчитанное по концентрации в нанограммах. - означает p zlt; 0025. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig4.jpg"> Рисунок 4: Реагенты влияют на успех протокола. (A) Flash замороженных тканей приводит к иммунопреципции эффективности похож на свежие ткани. (B) эффективность IP для 2 коммерчески антител были определены, обозначены как Антитела 1 и Антитела 2(Таблица материалов). При тестировании, Антитела 1 был более эффективным при потянув вниз РНК, чем антитела 2, которые, как представляется, не в состоянии различать отрицательные (не выражая ни Cre или Rpl22-HA) и положительные элементы управления (выражение как Cre и Rpl22-HA )). Точки, свидетельствуют о соотношении IPed и входно-РНК для отдельных биологических репликаций. (C) Когда комплекты извлечения РНК (Таблица материалов) были сравнены, Комплект 2 значительно превзошел Kit 1. Хотя оба комплекта IPed аналогичное количество РНК от отрицательного контроля, Kit 2 привело к значительно более высокой доходности РНК из положительных образцов. - указывает на p qlt; 0,05,. р.; 0,025, п.л.; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig4alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig5a.jpg"> Рисунок 5: Применение метода к модели мутантов. (A) Образец генотипа подтверждения интереса через западное blotting используя изготовление таможни в-домашнее антитело против гена протеина интереса демонстрирует ген интереса-/- (M/M) мужчины не сумеют произвести associated протеин. GAPDH показан как контроль нагрузки. (B) Графический биоанализатор выход из парных входных и IPed образцов для диких типов и мутантов. (C) Сравнение rnA-группцелостности (RIN) по типу образца и генотипу. (D) Средняя нуклеотидная длина видов РНК, анализируемых биоанализатором по типу образца и генотипу. - указывает на p qlt; 0,05, qs p lt; 0,025, р-р; 0,01, N.S. не значительный. N - 4 за генотип. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60927/60927fig6a.jpg"> Рисунок 6: Пример подтверждения драйвера Cre. Количественная оценка гена, переведенного на ранних стадиях развития зародышевых клеток(Stra8) и двух генов, переведенных в конце в развитии зародышевых клеток(Tnp1 и Prm1), проанализированная qRT-PCR из РНК иммунопреципитивом от RPL22-HA, движимой двумя различными зародышевыми клетками Cres, Stra8-iCre (выражена в начале развития зародышевых клеток) и Hspa2-Cre (выраженная позже в процессе развития). Здесь, HA-IP Stra8 достигается с раннего водителя зародышевой клетки Cre, но не с более поздним драйвером зародышевой клетки Cre, демонстрирующей клеточную специфичность иммунопреципиции. В отличие от этого, HA-IP стенограммы переведены в конце зародышевых клеток достигается как Stra8-iCre и Hspa2-Cre. Это, как ожидается, как клетки, которые выражают Stra8-iCre будет генерировать HA-тегами RPL22 на протяжении всей их развития в то время как те, выражающие Hspa2-Cre будет делать это только в течение более поздних частей их развития. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60927/60927fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse at JoVE.com

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Здесь мы описываем иммунопрецициции рибосом и связанных с ними РНК из отдельных популяций взрослых мужских клеток зародышевой мыши с помощью системы RiboTag. Стратегическое размножение и тщательное иммунопрецициционное обеспечение приводят к чистым, воспроизводимым результатам, которые информируют о транслатоме зародышевых клеток и дают представление о механизмах фенотипов мутантов.

RiboTag Иммунопресации в зародышевых клеток мужской мыши

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Мы улучшили ранее опубликованный метод RiboTag, чтобы значительно уменьшить фон. Это упрощает применение сложных моделей, таких как система мутантов, с точки зрения анализа и гораздо менее дорогостоящим. Помимо экспериментального поколения животных, метод RiboTag значительно проще и проще, чем другие методы для анализа рибосомы связанных mRNAs.Как и все эксперименты РНК, строгие условия RNase свободных имеют основополагающее значение для успеха. Если у вас ограниченный опыт работы с РНК, проверьте свои условия, сначала выполняя основные извлечения РНК затем двигаться дальше. Демонстрацией процедуры будет Лорен Чукралла, аспирантка из моей лаборатории.Для подготовки буфера гомогенизации добавьте 2,5 миллилитров одного молярного три при рН 7,4, пять миллилитров одного хлорида толярного калия, 600 микролитров одного хлорида молира магния и 500 микролитров MP40 до 50 миллилитров трубки. Добавить дитил пирокарбонат-обработанной воды в трубку, чтобы довести объем до 50 миллилитров и перемешать, пока все компоненты включены. Для подготовки буфера для мытья с высоким содержанием соли добавьте 2,5 миллилитров одного моларного три при рН 7,4, 15 миллилитров одного моларного хлорида калия, 600 микролитров одного хлорида молира магния и 500 микролитров MP40 до 50 миллилитров трубки.Довнесите его до объема 50 миллилитров в дитил пирокарбонатной воде и перемешайте до тех пор, пока все компоненты не будут включены. Предварительно взвесить все пробные трубки, зафиксировать вес и предварительно охладить в жидком азоте. Предварительно прохладный стерильный раствор, пестик и взвешивание шпателя на сухом льду.Затем на сухом льду используйте предварительно охлажденный стерильный раствор и пестик, чтобы разбить флэш-образцы замороженных тканей на большие кусочки и медленно измельчить его в мелкий порошок. Используя предварительно охлажденный шпатель, соскребать порошок из раствора в предварительно охлажденой трубки сбора заботясь, чтобы держать на сухом льду, когда это возможно. Взвесь трубку с порошком ткани.Рассчитайте массу ткани, вычитая начальный вес трубки из веса трубки с образцом в ней. Заметь это значение для более поздних расчетов объемов буфера лиза. Подготовь буфер лиза, добавив в 10 миллилитров буфера гомогенизации дитиотрейтол, ингибитор RNase, циклохексимид, гепарин и одну таблетку ингибитора протеазы.Смешайте до тех пор, пока все компоненты включены и держать на льду до использования. На каждые 100 миллиграммов образца добавьте один миллилитр буфера лиза. С той же пипетки используется для добавления буфера лиза, тщательно пипетки в результате лизать вверх и вниз, чтобы фрагментировать клетки и перемешать.Продолжайте пипетки, как правило, от 25 до 30 ударов, пока образец больше не вязкий. Установите образцы на льду в течение 10 минут, чтобы подставить. Затем вращаем образцы в предварительно охлажденой центрифуге при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут при 10 000 г.В нижней части трубки образуется большая рыхлая мутная гранула. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы, собирать лисат в новую трубку и записывать объем для каждого образца. Чтобы предотвратить деградацию образцов, убедитесь, что образцы остаются прохладными на протяжении всего оставшегося протокола хранения на льду или при четырех градусах Цельсия, когда это возможно.Теперь вычислите необходимый объем магнитных бусин в сочетании с соответствующим связывающим антителом белком, белком G.Для одного миллилитра лизата используйте 375 микролитров белковых шариков G, чтобы достичь 30 миллиграммов на миллилитр. Поместите шариковой раствор в 1,7 миллилитровую трубку на стойку магнитной трубки. Удалите растворитель шарика и добавьте равный объем буфера свежего лиза к бисеру.На скамейке трубки ротатор установлен до 20 об /мин при четырех градусах по Цельсию, поверните трубку пять минут, чтобы вымыть. Поместите трубку на стойку магнитной трубки и удалите буфер стирки. После повторения мыть еще два раза, добавить буфер лиза на исходный объем, чтобы уравночные бусы.Хранить при четырех градусах по Цельсию или на льду до использования. Добавьте 50 микролитров равномерных бусин на каждый миллилитр лизата и поверните при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем поместите трубку на магнитную стойку и соберите лисат в свежую трубку.Откажитесь от использованных бусин. К лизате добавьте 25 микролитров равномерных бусин на каждый миллилитр и поверните при четырех градусах цельсия в течение одного часа. Храните оставшийся равновесный белок G шарики при четырех градусах по Цельсию на ночь.Утром поместите трубку на магнитную стойку и соберите лисат в свежую трубку. Откажитесь от использованных бусин. Из очищенного лизата сохраните 50 микролитров в качестве элементов управления вводом выборки.Хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. На каждый миллилитр очищенного лизата добавьте пять микрограммов антител против HA. Чтобы предотвратить потерю образца, запечатать крышку трубки лабораторной пленкой и повернуть образцы от 16 до 18 часов при четырех градусах цельсия.На каждый миллилитр очищенного лизата добавьте 300 микролитров белка G шариков. Запечатать крышку трубки лабораторной пленкой и повернуть в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию. Поместите образец трубки на магнит стойку, чтобы бисер отделиться от IPed лисировать.Pipette от потока через лизировать и отказаться, сохраняя бисер. Добавьте в бисер 800 микролитров буфера для мытья высокой соли. Поместите трубку на ротатор в течение 10 минут при четырех градусах цельсия.Поместите образец трубки на магнит стойку и позволить бисеру отделиться от мытья. Удалите и отбросьте стирку. Добавьте еще 800 микролитров буфера для мытья высокой соли в бисер.Закройте трубку и дайте ей вращаться в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Поместите образец трубки на магнит стойку и позволить бисеру отделиться от мытья. Удалите и отбросьте стирку.Повторите мыть еще раз. После мытья добавьте в бисер 3,5 микролитров 14,2 молярного бета-меркаптоэтанола и перемешайте вихрем в течение 15 секунд. Извлекайте РНК с помощью коммерческого комплекта для очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя.Elute образец в 30 микролитров RNase бесплатной воды. Храните образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В этом исследовании, очень мало РНК была изолирована от образцов, не имеющих либо Cre или Rpl22HA демонстрируя эффективность этого протокола для уменьшения фона ИС и изолировать подлинные HA помечены рибосомные РНК.Ряд антител в протоколах изоляции РНК были протестированы в положительных образцах Cre и Rpl22HA. Эти результаты показывают, что выбор реагентов может оказать значительное влияние на эффективность ИС. Была изучена эффективность системы RiboTag для изоляции рибосомно-ассоциированной РНК.Как для ввода дикого типа, так и для генотипов ИС концентрация вводимых ресурсов была значительно выше концентрации ИС, что свидетельствует о том, что в выборке ввода было больше РНК. В общем объеме пулов РНК значения числа целостности РНК, как ожидается, будут около 10 с более высоким RIN коррелирует с более высокой выведенной целостности и качества выборки. Хотя образцы ИС имели более низкий РИН, чем входные данные, РИН по-прежнему находились в приемлемом диапазоне и не зависели от генотипа выборки.Помимо разведения и поддержания условий, свободных RNase, исследователи должны убедиться, что они собирают и держат каждый предложенный образец. Входная РНК особенно имеет ключевое значение для нескольких типов анализов ниже по течению. Для нашей лаборатории мы обычно выполняем секвенирование РНК после иммунопреципиентации.Это позволяет нам запросить весь купол стенограммы для рибосомы ассоциации. Альтернативы будут включать анализ микроаррей или количественный RT-PCR. Для нас эта система позволяет нам выявлять изменения в рибосомно-ассоциированных РНК с мутацией специфических связывающих РНК белков.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Живая визуализация мышей

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Поколения клеток человека первичных зародышевых клеток как на поверхности Embryoid органов от загрунтовать плюрипотентности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Определение плотности bile Duct в мышечной печени

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...