Name: laser-induced brain injury in the motor cortex of rats
Uploaded: 2020-09-26T12:30:00
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我们要感谢索罗卡大学医学中心麻醉学系和内盖夫本-古里安大学的实验室工作人员在进行这一实验时提供的帮助。

下列程序是按照欧洲共同体实验动物使用准则进行的。这些实验还得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。
1. 动物选择和准备
<ol><li>选择65只重达300至350克的雄性Sprague-Dawley大鼠，此程序没有男性病理学。较小的尺寸对 MCAO 程序造成技术困难。</li>
	<li>每个笼子分配3只老鼠，让它们适应至少3天。</li>
</ol>2. MCAO 程序
<ol><li>选择25只大鼠为MCAO，允...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+health+estimates:+deaths+by+cause,+age,+sex+and+country,+2000-2012.">Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012.</a> World Health Organization. 9, (2014).</li><li>Meadows, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+focal+and+multifocal+cerebral+ischemia:+a+review.">Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review.</a> Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).</li><li>Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+ischemic+stroke:+a+useful+tool+for+stroke+drug+development.">Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development.</a> Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Li, F., Omae, T., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hyperthermia+and+its+mechanism+in+the+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion+model+of+rats.">Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats.</a> Stroke. 30, 2464-2470 (1999).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+focal+ischemia+using+an+internal+carotid+artery+approach.">An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).</li><li>Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+complicates+middle+cerebral+artery+occlusion+induced+by+an+intraluminal+filament.">Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament.</a> Brain Research. 649, 253-259 (1994).</li><li>Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia:+procedural+pitfalls+and+translational+problems.">Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems.</a> Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).</li><li>Choi, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobehavioural+deficits+correlate+with+the+cerebral+infarction+volume+of+stroke+animals:+a+comparative+study+on+ischaemia-reperfusion+and+photothrombosis+models.">Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alternative+Model+of+Laser-Induced+Stroke+in+the+Motor+Cortex+of+Rats.">An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats.</a> Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).</li><li>Bleilevens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+anesthesia+and+cerebral+blood+flow+on+neuronal+injury+in+a+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+(MCAO)+model.">Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model.</a> Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).</li><li>Kuts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Middle+Cerebral+Artery+Occlusion+Technique+for+Inducing+Post-stroke+Depression+in+Rats.">A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+neuro-behavioral+parallels+in+the+rat+model+of+stroke.">Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke.</a> Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).</li></ol>

鉴于激光组没有死亡或SAH，可以公平地假设激光技术是微创的。死亡和SAH的主要死因是血管损伤，导致颅内压力升高（ICP），如最初的MCAO技术10所示。激光组没有死亡和SAH可能是由于激光的特定影响：它们对血管没有直接影响，在泄漏时可诱发凝固。低梗塞体积和脑水肿也有助于尽量减少死亡风险。鉴于最初的用于触发中风（瞬态和永久性）的 MCAO 技术已证明可导致死亡和 SAH<su...

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Erratum: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

从全球程度上，中风是第二大死因，也是第三大残疾原因。中风还会导致严重的残疾，往往需要医务人员和亲属的额外护理。因此，需要了解与疾病相关的并发症，并提高取得更积极结果的潜力。
使用动物模型是了解疾病的第一步。为了确保最佳的研究成果，典型的模型将包括简单的技术、可负担性、高可重复性和最小的可变性。缺血性中风模型中的决定因素包括脑水肿体积、梗塞大小、血脑屏障（BBB）分解程度以及通常通过神经严重性评分2评估的功能损伤。
啮齿动物模型中应用最广泛的中风诱导技术暂时或永久地遮挡了中脑动脉（MCA）。3这种技术产生一个类似于人类的中风模型：它有一个五角体围绕中风区域，是高度可重复的，并调节缺血持续时间和再灌注4。然而，MCAO方法有一些并发症。该技术容易颅内出血和损伤的ipilater视网膜与视觉皮层功能障碍和常见的体温过高，往往导致额外的结果5，6，7。,6,7其他限制包括诱发性中风的高变异性（由于缺血可能扩展至意外区域（如外部胡萝卜动脉区域）、MCA 的闭塞不足以及过早再灌注。此外，不同菌株和大小的大鼠表现出不同的梗塞卷8。除了上述所有缺点外，MCAO模型不能诱发脑深区域的小孤立中风，因为它在技术上限制了其对导管最小体积的要求。这使得对替代模型的需要变得更加关键。另一种方法，光膜形成，提供了一个可能的替代MCAO程序，但没有提高效率9。此技术以光描边为目标，并针对以前的模型提供了一些改进。然而，光膜形成需要与继发性复合9相关的侵入性颅骨切除术。
鉴于概述的缺点，这里介绍的协议提供了一种能够替代激光技术，诱导啮齿动物的脑损伤。激光技术的作用机制基于激光对活组织产生光热效应，导致人体组织吸收光束并转化为热量。使用激光技术的优点是它的安全性和操作方便性。激光产生热量以阻止出血的能力使它在医学上非常重要，而它在给定的满足点上放大不同光束的能力确保激光避免破坏影响目标点10的健康组织。该协议中使用的激光束可以通过低液体介质（如骨骼），而不会释放其能量和/或造成任何破坏。一旦它达到高液体介质，如脑组织，它消耗其能量来摧毁目标组织。因此，这项技术只能在大脑的适当区域诱发脑损伤。
这里介绍的技术显示了巨大的能力来调节其辐照水平，产生从一开始所选择的脑损伤变异。与影响皮层和线状体的原始 MCAO 不同，激光技术能够调节脑损伤的影响，仅对预期的运动皮层造成伤害。本文提供了激光诱发脑损伤方案，并总结了对大鼠大脑皮层的手术具有代表性的结果。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="666">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">298-96-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">50% trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Cannula Venflon 22 G</td>
			<td style="width:123px;">KD-FIX</td>
			<td style="width:161px;">1.83604E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Compact Analytical Balances</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Digital Weighing Scale</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf pipette</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Ethanol 96 %</td>
			<td style="width:123px;">ROMICAL</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Flammable Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Evans Blue 2%</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Fluorescence detector</td>
			<td style="width:123px;">Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td style="width:161px;">model Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Infusion Cuff</td>
			<td style="width:123px;">ABN</td>
			<td style="width:161px;">IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Isofluran, USP 100%</td>
			<td style="width:123px;">Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:161px;">NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Multiset</td>
			<td style="width:123px;">TEVA MEDICAL</td>
			<td style="width:161px;">998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Olympus BX 40 microscope</td>
			<td style="width:123px;">Olympus</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Optical scanner</td>
			<td style="width:123px;">Canon</td>
			<td style="width:161px;">Cano Scan 4200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades 11</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine</td>
			<td style="width:123px;">Laser Industries Ltd</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Stereotaxic head holder</td>
			<td style="width:123px;">KOPF</td>
			<td style="width:161px;">900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Sterile Syringe 2 ml</td>
			<td style="width:123px;">Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe-needle 27 G</td>
			<td style="width:123px;">Braun</td>
			<td style="width:161px;">305620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced brain injury in the motor cortex of rats

在实验啮齿动物模型中诱导中风的一种常见技术涉及使用导管的中脑动脉（MCA）的瞬态（通常表示为 MCAO-t）或永久（指定为 MCAO-p）闭塞。然而，这种普遍接受的技术有一些局限性，从而限制了其广泛使用。该方法的中风诱导通常表现为缺血区定位和大小变化大、出血周期性发生、死亡率高等。此外，成功完成任何临时或永久程序都需要专业知识，通常持续约 30 分钟。在该协议中，提出了一种激光辐照技术，可以作为诱导和研究啮齿动物模型中脑损伤的替代方法。
与对照组和MCAO组大鼠相比，激光诱导的脑损伤在体温、梗塞量、脑水肿、颅内出血和死亡率方面变化减小。此外，使用激光引起的损伤只对运动皮层的脑组织造成损害，这与在 MCAO 实验中不同，在 MCAO 实验中观察到运动皮层和石体组织的破坏。
这项调查的结果表明，激光照射可以作为诱导运动皮层脑损伤的替代和有效的技术。该方法还缩短了完成该过程的时间，不需要专家处理程序。

对照组或实验组无死亡或SAH登记（表1）。MCAO组的死亡率和SAH死亡率均达到20%。
尽管两组大鼠的变异性不同（表1），但两组大鼠的相对体温变化也相似。
与假操作对照组（1 ± 0.3）相比，激光（16 ±1.1）和MCAO（20±1.5）型号的NSS明显恶化。 表 1;p<0.01）。
与假操作对照组（2.4% = 0.3% 对 0.5% = 0.1） 相...

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Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

此处介绍的协议显示了创建脑损伤啮齿动物模型的技术。此处描述的方法使用激光照射和目标运动皮层。

大鼠运动皮层中的激光诱发脑损伤

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

我们的协议提供了一种新方法，用于利用激光照射在大鼠中制造创伤性脑损伤，从而在运动皮层中产生焦点冲击。该技术的主要优点是梗塞面积变化小，死亡率低，程序相对简单，不需要专家处理。演示这个程序的将是德米特里·纳塔内尔，一个来自我们实验室的研究人员。为了进行激光引起的脑损伤，首先将20，300至350克Sprague Dawley大鼠分配到激光组，将20只分配给控制Sham操作组。在确认对戒断反射缺乏反应后，将一只老鼠放在直肠温度调节加热垫上，并使用剃须刀从损伤部位去除足够的头发，切口周围有大约两厘米的无毛边缘。用 70% 乙醇对裸露的皮肤进行消毒，将大鼠放在立体型头架的易发位置。做一个三厘米的切口，让头皮的横向反射暴露之间的区域， 布雷格玛和羔羊。手持峰值波长为1064纳米的Nd：YAG激光器，距离头骨两毫米的距离，以1秒脉冲持续时间对右半球上方头骨的暴露区域施用50焦耳倍10点。激光损伤后，将老鼠从设备中取出，用3-0丝丝手术缝合线关闭头皮。然后，将大鼠放在笼子里，进行监测，直到完全卧发。手术24小时后，使用43分评分系统评估神经严重性评分。测试动物的神经缺陷、行为障碍、光束平衡任务和反射，并为更严重的残疾分配更高的分数。评估后，根据标准规程从每个实验和控制动物中采集大脑。为了评估大脑的梗塞体积，将收获的大脑切成六个两毫米厚的日冕片，并在0.05%TTC中孵育每片，在37摄氏度下孵育30分钟。染色后，使用光学扫描仪扫描此切片，每英寸分辨率为 1600 分 1600 点。固定大脑切片的未污染区域被定义为梗死。为了评估血脑屏障破损的发生率，激光诱导损伤后24小时，将2%的埃文斯蓝色染料用2%的Evas蓝色染料用稀释在每公斤盐水溶液中，然后通过可抽的尾静脉将溶液静脉注射给受伤并控制大鼠。在使用手术针和剪刀打开第一只动物的胸部之前，让溶液循环一小时。通过左心室在110毫米压力下用冷却0.9%盐水将暴露的心脏灌注，直到从右中庭观察到无色填充液。接下来，收获大脑，获得两毫米的足体果子片。将左脑切片与右脑切片分开，以便分别评估受伤和非受伤的半球，并称重样本。使用砂浆和害虫使样品均质，并在 50%三氯乙酸中孵育组织样品 24 小时。第二天，在10，000倍的G和室温下将均质脑组织样本离心20分钟，将1毫升上半液与1.5毫升96%乙醇混合，比例为1比3。然后，使用荧光探测器在620纳米的激发和680纳米发射波长，以评估血脑屏障断裂。组织学分析指出，埃文斯蓝色染色可用于揭示激光和MCAO模型动物脑损伤的发生率。在这个代表性的分析中，对照组或实验组都没有死亡或亚布拉奇内出血，MCAO组的死亡率和亚布拉奇出血率均达到20%。尽管两组大鼠的变异性不同，但两组大鼠的相对体温变化也相似。与Sham操作对照组相比，激光和MCAO模型的神经严重性得分都明显差。与Sham操作对照组相比，激光诱发脑损伤也导致目标半球的梗塞体积显著增加。然而，与受MCAO技术伤害的动物相比，激光模型的法化体积更小。激光诱发脑损伤模型与沙姆操作对照组之间未观察到脑水肿差异。然而，激光模型和MCAO受伤组在脑水肿方面存在显著差异。与沙姆操作对照组相比，激光引起的脑损伤和MCAO技术都导致非损伤半球和目标半球的血脑屏障断裂显著增加。在尝试此模型时，请记住精确定位运动皮层区域，并标准化能量、辐照点数和总展示时间。按照此过程，可以执行大量的行为测试，如光束行走、Froedert 和其他评估。

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