Name: laser-induced brain injury in the motor cortex of rats
Uploaded: 2020-09-26T12:30:00
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ソロカ大学医療センター麻酔科とネゲブのベングリオン大学の研究室スタッフに、この実験の成果に感謝します。

以下の手順は、欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われました。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました.
1. 動物の選択と準備
<ol><li>この処置のための異常な病理学なしで300から350 gの重量を量る65の雄のスプレイグ・ドーリーのラットを選ぶ。サイズが小さいほど、MCAO の手順に技術的な問題が生じ?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+health+estimates:+deaths+by+cause,+age,+sex+and+country,+2000-2012.">Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012.</a> World Health Organization. 9, (2014).</li><li>Meadows, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+focal+and+multifocal+cerebral+ischemia:+a+review.">Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review.</a> Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).</li><li>Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+ischemic+stroke:+a+useful+tool+for+stroke+drug+development.">Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development.</a> Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Li, F., Omae, T., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hyperthermia+and+its+mechanism+in+the+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion+model+of+rats.">Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats.</a> Stroke. 30, 2464-2470 (1999).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+focal+ischemia+using+an+internal+carotid+artery+approach.">An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).</li><li>Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+complicates+middle+cerebral+artery+occlusion+induced+by+an+intraluminal+filament.">Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament.</a> Brain Research. 649, 253-259 (1994).</li><li>Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia:+procedural+pitfalls+and+translational+problems.">Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems.</a> Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).</li><li>Choi, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobehavioural+deficits+correlate+with+the+cerebral+infarction+volume+of+stroke+animals:+a+comparative+study+on+ischaemia-reperfusion+and+photothrombosis+models.">Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alternative+Model+of+Laser-Induced+Stroke+in+the+Motor+Cortex+of+Rats.">An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats.</a> Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).</li><li>Bleilevens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+anesthesia+and+cerebral+blood+flow+on+neuronal+injury+in+a+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+(MCAO)+model.">Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model.</a> Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).</li><li>Kuts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Middle+Cerebral+Artery+Occlusion+Technique+for+Inducing+Post-stroke+Depression+in+Rats.">A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+neuro-behavioral+parallels+in+the+rat+model+of+stroke.">Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke.</a> Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).</li></ol>

レーザー群で死亡またはSAHが発生しなかった場合、レーザー技術は最小限の侵襲性であると考えるのは公正です。死亡の主な原因とSAHは、元のMCAO技術10に示すように、頭蓋内圧(ICP)の上昇につながる血管への損傷である。レーザー群における死およびSAHの欠如は、レーザーの特定の効果による可能性が高い:彼らは血管に直接影響を与えないし、漏出の場合に凝固を誘発する?...

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Erratum: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

世界的に、脳卒中は第2の主要な死因であり、障害の第3位の原因である。脳卒中はまた、重度の障害につながり、多くの場合、医療スタッフや親戚からの余分なケアを必要とします。したがって、障害に関連する合併症を理解し、より肯定的な結果の可能性を改善する必要があります。
動物モデルの使用は、病気を理解するための最初のステップです。最良の研究成果を得るために、一般的なモデルには、単純な手法、手頃な価格、高い再現性、および最小限の変動性が含まれます。虚血性脳卒中モデルにおける決定因子としては、脳浮腫容積、梗塞サイズ、血液脳関門(BBB)の破壊の程度、および神経学的重症度スコア2を介して一般的に評価される機能障害が含まれる。
げっ歯類モデルで最も広く使用されている脳卒中誘導技術は、中大脳動脈(MCA)を一過性または永久的に閉塞させる3.この技術は、ヒトのものと同様のストロークモデルを生成する:それは、ストローク領域を囲む陰茎を有し、高度に再現性があり、虚血持続時間および再灌流4を調節する。それにもかかわらず、MCAO法には若干の合併症がある。この技術は、多くの場合、追加の結果につながる視覚皮質および一般的な温熱の機能不全を伴う頭蓋内出血およびipsi側性の腎不全への傷害を起こしやすい55、6、7。6,7他の制限には、誘発された脳卒中の高い変動(虚血の可能性のある拡張から、外部頸動脈領域のような意図しない領域に起因する)、MCAの閉塞が不十分、および早期再灌流が含まれる。また、異なる株や大きさのラットは、様々な梗塞容積8を示す。前述のすべての欠点に加えて、MCAOモデルは、カテーテル法のための最小血管サイズの要件の点で技術的に限られているため、深部脳領域で小さな単離されたストロークを誘導することはできません。これにより、代替モデルの必要性がますます重要になります。別の方法、フォトトロンボシスは、MCAO手順に代わる可能性があるが、効率9を改善しない。このテクニックは、光でストロークをターゲットにし、以前のモデルでいくつかの改善を提供します。しかし、光血栓症は、二次的な併発に関連する侵襲的な頭蓋切り出しを必要とする。
ここで示す欠点の観点から、ここで提示されるプロトコルはげっ歯類の脳損傷を誘発するための可能な代替レーザー技術を提供する。レーザー技術の作用機序は、生体組織に与えるレーザーの光熱効果に基づいており、身体組織による光ビームの吸収と熱への変換につながります。レーザー技術を使用する利点は、その安全性と操作の容易さです。レーザーが出血を止めるために熱を生成する能力は医学において非常に重要であり、与えられた満点で異なるビームを増幅する能力は、レーザーが目標点10の邪魔になる健康な組織を破壊することを避けることを保証する。このプロトコルで使用されるレーザービームは、そのエネルギーを放出したり、破壊を引き起こすことなく、骨などの低液体媒体を通過することができます。脳組織などの高い液体培地に到達すると、エネルギーを使って標的組織を破壊します。したがって、この技術は、脳の適切な領域でのみ脳損傷を誘発することができる。
ここで提示された技術は、照射のレベルを調節する能力の膨大な量を示し、最初から意図された脳損傷の選択されたバリエーションを生み出した。皮質と線条体の両方に影響を与える元のMCAOとは異なり、レーザー技術は脳損傷の影響を調節することができ、意図した運動皮質にのみ傷害を誘発した。本明細書において、レーザー誘発性脳損傷プロトコルおよびラットの大脳皮質に対して行われる処置の代表的な結果の概要が提供される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="666">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">298-96-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">50% trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Cannula Venflon 22 G</td>
			<td style="width:123px;">KD-FIX</td>
			<td style="width:161px;">1.83604E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Compact Analytical Balances</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Digital Weighing Scale</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf pipette</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Ethanol 96 %</td>
			<td style="width:123px;">ROMICAL</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Flammable Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Evans Blue 2%</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Fluorescence detector</td>
			<td style="width:123px;">Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td style="width:161px;">model Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Infusion Cuff</td>
			<td style="width:123px;">ABN</td>
			<td style="width:161px;">IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Isofluran, USP 100%</td>
			<td style="width:123px;">Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:161px;">NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Multiset</td>
			<td style="width:123px;">TEVA MEDICAL</td>
			<td style="width:161px;">998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Olympus BX 40 microscope</td>
			<td style="width:123px;">Olympus</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Optical scanner</td>
			<td style="width:123px;">Canon</td>
			<td style="width:161px;">Cano Scan 4200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades 11</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine</td>
			<td style="width:123px;">Laser Industries Ltd</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Stereotaxic head holder</td>
			<td style="width:123px;">KOPF</td>
			<td style="width:161px;">900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Sterile Syringe 2 ml</td>
			<td style="width:123px;">Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe-needle 27 G</td>
			<td style="width:123px;">Braun</td>
			<td style="width:161px;">305620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced brain injury in the motor cortex of rats

実験的なげっ歯類モデルで脳卒中を誘導するための一般的な技術は、カテーテルを使用して中大脳動脈(MCAO-p)の過渡性(しばしばMCAO-tと呼ばれる)または永久的な(MCAO-pと呼ばれる)閉塞を含む。しかし、この一般的に受け入れられている手法には、いくつかの制限があり、それによってその広範な使用が制限されます。この方法による脳卒中誘導は、虚血領域の局在化および大きさの変動性の高さ、出血の周期的発生、および高い死亡率によって特徴づけられる。また、一時的または永続的な手順のいずれかを正常に完了するには、専門知識が必要であり、多くの場合、約30分間続きます。このプロトコルでは、げっ歯類モデルにおける脳損傷を誘発し、研究するための代替方法として役立つレーザー照射技術が提示される。
対照群およびMCAO群のラットと比較した場合、レーザー誘導による脳損傷は体温、梗塞容積、脳浮腫、頭蓋内出血、および死亡率の変動を減少させた。さらに、レーザーによる傷害の使用は、運動皮質と線条体組織の両方の破壊が観察されるMCAO実験とは異なり、運動皮質でのみ脳組織に損傷を与えた。
この調査結果から、レーザー照射は、運動皮質の脳損傷を誘発するための代替的かつ効果的な技術として役立つ可能性があることを示唆している。このメソッドは、プロシージャを完了する時間を短縮し、専門家のハンドラーを必要としません。

制御または実験群のいずれにも死亡またはSAHが登録されなかった(表1)。MCAOグループは死亡率とSAHの両方の20%の割合を有していた。
両群のラットにおける相対体温変化も同様であったが、両群のばらつきの違いにもかかわらず(表1)。
レーザー(16 ±1.1)とMCAO(20±1.5)モデルの両方で、シャム操作対照群(1±0.3)と比較して有意に悪い...

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Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

ここで示すプロトコルは、脳損傷のげっ歯類モデルを作成する技術を示しています。ここで説明する方法は、レーザー照射を使用し、運動皮質を標的とする。

ラットの運動皮質におけるレーザー誘発脳損傷

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

我々のプロトコルは、レーザー照射を用いてラットの外傷性脳損傷を作成し、運動皮質に焦点の影響を与えるための新しい方法論を提供する。この技術の主な利点は、梗塞領域の低い変動性、低い死亡率、および専門家のハンドラーを必要としない手順の相対的な単純性です。この手順を実証することは、私たちの研究室の研究者であるドミトリー・ナタネルです。レーザー誘発脳損傷を行うために、まず20、300〜350グラムのスプレイグ・ドーリーラットをレーザー群に割り当て、20を対照シャム操作群に割り当てる。離脱反射に対する応答の欠如を確認した後、直腸温度調節加熱パッドに1匹のラットを置き、切開の周りに約2センチメートルの無毛マージンを持つ傷害部位から十分な髪を取り除くために剃毛を使用する。70%エタノールで露出した皮膚を消毒し、立体性ヘッドホルダーの傾向にラットを置きます。頭皮の横反射がブレグマとラムダの間の領域を露出できるように、3センチメートルの切開を行います。頭蓋骨から2ミリメートルの距離で1064ナノメートルのピーク波長を持つNd:YAGレーザーを保持し、右半球の上の頭蓋骨の露出領域に1秒のパルス持続時間で50ジュール倍の10ポイントを投与する。レーザー損傷が届いた後、装置からラットを取り出し、3-0シルク外科縫合糸で頭皮を閉じます。その後、完全な債務まで監視してケージにラットを置きます。処置の24時間後、43点スコアリングシステムを用いて神経学的重症度スコアを評価する。神経学的な欠陥、行動障害、ビームバランスタスク、反射神経のために動物をテストし、より重度の障害のためにより高いスコアを割り当てます。評価後、各実験から脳を収穫し、標準的なプロトコルに従って動物を制御する。脳梗塞の体積を評価するには、収穫した脳を6つの2ミリメートルの厚さのコロナスライスに切り分け、各スライスを摂氏37度で30分間0.05%TTCでインキュベートする。染色後、1600 x 1600 ドット/インチの解像度の光学式スキャナーでこのスライスをスキャンします。固定脳スライスの染色されていない領域は梗塞と定義されます。血液脳関門破損の発生率を評価するために、レーザー誘発傷害の24時間後に、生理食塩水の1キログラム当たり4ミリリットルで希釈した2%エバンスブルー染料を含む注射器をロードし、カニューレートされた尾静脈を介して負傷および対照ラットに静脈内に溶液を送達する。外科用ピンセットとはさみを使用して最初の動物の胸を開く前に、溶液を1時間循環させます。右心房から無色の拡散液が観察されるまで、110ミリメートルの水銀圧で左心室を介して冷却された0.9%生理食動で露出した心臓を浸透させる。次に、脳を収穫し、2ミリメートルのロストラル尾のスライスを得る。左脳スライスを右脳スライスから分離して、負傷した半球と負傷していない半球を別々に評価できるようにし、サンプルの重量を量る。乳鉢と害虫を使用してサンプルを均質化し、24時間トリクロロ酢酸で組織サンプルをインキュベートします。翌日、均質化された脳組織サンプルをGと室温の10,000倍で20分間遠心分離し、上澄みの1ミリリットルを1~3倍の割合で96%エタノールの1.5ミリリットル混合する。次に、620ナノメートルの励起で蛍光検出器を用い、680ナノメートルの発光波長を用いて血液脳関門破損を評価する。組織学的分析によって観察されるように、エバンス青染色はレーザーおよびMCAOのモデル動物の脳損傷の発生率を明らかにするために使用することができる。この代表的な分析では、コントロール群または実験群のいずれにも死亡またはくも膜下出血は登録されず、MCAO群は死亡率とくも膜下出血の両方の20%率を有していた。両群からのラットの相対体温変化も同様であったが、両群の変動性の差にも関わらず。神経学的重症度スコアは、シャム操作対照群と比較して、レーザーおよびMCAOモデルの両方で有意に悪化した。脳損傷にレーザー誘発はまた、シャム作動制御群と比較して標的半球の梗塞容積の有意な増加を引き起こした。しかし、レーザーモデルの梗塞容積はMCAO技術により負傷した動物に比べて小さかった。レーザー誘発性脳損傷モデルとシャム操作対照群との間には脳浮腫の違いは認められなかった。しかし、レーザーモデルとMCAOの負傷群との間には脳浮腫に有意な差があった。シャム操作対照群と比較して、レーザー誘発脳損傷およびMCAO技術は共に、非傷害および標的半球における血液脳関門破壊の有意な増加を引き起こした。このモデルを試みている間、正確に運動皮質領域をターゲットにし、エネルギー、照射されるポイントの数、および総博覧会時間を標準化することを忘れないでください。この手順に従って、ビームウォーキング、フロエデルト、およびその他の評価などの幅広い行動テストを行うことができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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