Name: laser-induced brain injury in the motor cortex of rats
Uploaded: 2020-09-26T12:30:00
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Nos gustaría dar las gracias al Departamento de Anestesiología del Centro Médico de la Universidad de Soroka y al personal de laboratorio de la Universidad Ben-Gurion del Negev por su ayuda en la realización de este experimento.

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de conformidad con las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales en la Universidad Ben-Gurion del Negev.
1. Selección y preparación de animales
<ol><li>Seleccione 65 ratas macho Sprague-Dawley que pesen de 300 a 350 g sin patología general para este procedimiento. El tamaño más pequeño plantea dificultades técnicas para el proce...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+health+estimates:+deaths+by+cause,+age,+sex+and+country,+2000-2012.">Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012.</a> World Health Organization. 9, (2014).</li><li>Meadows, K. 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L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermia+complicates+middle+cerebral+artery+occlusion+induced+by+an+intraluminal+filament.">Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament.</a> Brain Research. 649, 253-259 (1994).</li><li>Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia:+procedural+pitfalls+and+translational+problems.">Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems.</a> Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).</li><li>Choi, B. 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(147), e58875 (2019).</li><li>Boyko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+neuro-behavioral+parallels+in+the+rat+model+of+stroke.">Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke.</a> Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).</li></ol>

Es justo suponer que la técnica láser es mínimamente invasiva, dado que no se produjeron muertes o SAH en el grupo láser. La causa principal de la muerte y la SAH es el daño a los vasos sanguíneos que conduce a una elevación de la presión intracraneal (ICP), como se muestra en las técnicas originales de MCAO10. La ausencia de muerte y SAH en el grupo láser es probable debido a los efectos específicos de los láseres: no tienen impacto directo en los vasos sanguíneos y pueden inducir la...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60928">Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats</a>. The Authors section was updated.
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Erratum: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y la tercera causa principal de discapacidad1. El accidente cerebrovascular también conduce a una discapacidad grave, a menudo requiere atención adicional del personal médico y sus familiares. Por lo tanto, es necesario comprender las complicaciones asociadas con el trastorno y mejorar el potencial de resultados más positivos.
El uso de modelos animales es el primer paso para entender las enfermedades. Para garantizar los mejores resultados de investigación, un modelo típico incluiría una técnica simple, asequibilidad, alta reproducibilidad y variabilidad mínima. Los determinantes en los modelos de accidente cerebrovascular isquémico incluyen el volumen de edema cerebral, el tamaño del infarto, la extensión de la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) y el deterioro funcional generalmente evaluado a través de la puntuación de gravedad neurológica2.
La técnica de inducción por accidente cerebrovascular más utilizada en modelos de roedores ocluye la arteria cerebral media (MCA) transitoria o permanentemente3. Esta técnica produce un modelo de trazo similar a los de los seres humanos: tiene una penumbra que rodea el área acariciada, es altamente reproducible, y regula la duración de la isquemia y la reperfusión4. Sin embargo, el método MCAO tiene algunas complicaciones. La técnica es propensa a hemorragia intracraneal y lesiones a la retina ipsilateral con una disfunción de la corteza visual y hipertermia común que a menudo conducen a resultados adicionales5,,6,,7. Otras limitaciones incluyen altas variaciones en el accidente cerebrovascular inducido (que surgen de la extensión probable de la isquemia a regiones no deseadas, como la región externa de la arteria carótida), oclusión insuficiente del MCA y reperfusión prematura. Además, las ratas de diferentes cepas y tamaños exhiben varios volúmenes de infarto8. Además de todas las desventajas mencionadas, el modelo MCAO no puede inducir pequeños accidentes cerebrovasculares aislados en áreas cerebrales profundas, ya que está limitado técnicamente en términos de su requisito de tamaño mínimo del recipiente para el cateterismo. Esto hace que la necesidad de un modelo alternativo sea aún más crítica. Otro método, la fototrombosis, proporciona una posible alternativa a los procedimientos MCAO pero no mejora la eficiencia9. Esta técnica apunta a la carrera con la luz y ofrece algunas mejoras en los modelos anteriores. Sin embargo, la fototrombosis requiere una craneotomía invasiva que se asocia con compicaciones secundarias9.
A la luz de las deficiencias esbozadas, el protocolo presentado aquí proporciona una técnica láser alternativa capaz para inducir lesiones cerebrales en roedores. El mecanismo de acción de la técnica láser se basa en los efectos fototérmicos del láser impartidos en tejidos vivos, lo que conduce a la absorción de haces de luz por los tejidos del cuerpo y su conversión en calor. Las ventajas de utilizar una técnica láser son su seguridad y facilidad de manipulación. La capacidad de un láser para producir calor para detener el sangrado lo hace muy importante en la medicina, mientras que su capacidad para amplificar diferentes haces en un punto de encuentro dado asegura que los láseres evitan destruir los tejidos sanos que se interponen en el camino del punto de destino10. El rayo láser utilizado en este protocolo puede pasar a través de un medio líquido bajo, como el hueso, sin emitir su energía y / o causar ninguna destrucción. Una vez que alcanza un medio líquido alto, como los tejidos cerebrales, consume su energía para destruir los tejidos diana. La técnica, por lo tanto, puede inducir lesiones cerebrales sólo en el área apropiada del cerebro.
La técnica presentada aquí mostró una enorme cantidad de capacidad para regular sus niveles de irradiación, produciendo las variaciones elegidas de lesión cerebral previstas desde el principio. A diferencia del MCAO original que afecta tanto a la corteza como al estriado, la técnica láser fue capaz de regular el impacto de la lesión cerebral, induciendo lesiones sólo en la corteza motora prevista. Aquí, se proporciona el protocolo de lesión cerebral inducida por láser y un resumen de los resultados representativos para el procedimiento realizado en la corteza cerebral de ratas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="666">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">298-96-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">50% trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Cannula Venflon 22 G</td>
			<td style="width:123px;">KD-FIX</td>
			<td style="width:161px;">1.83604E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Compact Analytical Balances</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Digital Weighing Scale</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf pipette</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Ethanol 96 %</td>
			<td style="width:123px;">ROMICAL</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Flammable Liquid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Evans Blue 2%</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Fluorescence detector</td>
			<td style="width:123px;">Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td style="width:161px;">model Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Infusion Cuff</td>
			<td style="width:123px;">ABN</td>
			<td style="width:161px;">IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Isofluran, USP 100%</td>
			<td style="width:123px;">Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:161px;">NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Multiset</td>
			<td style="width:123px;">TEVA MEDICAL</td>
			<td style="width:161px;">998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Olympus BX 40 microscope</td>
			<td style="width:123px;">Olympus</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Optical scanner</td>
			<td style="width:123px;">Canon</td>
			<td style="width:161px;">Cano Scan 4200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades 11</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA - ALDRICH</td>
			<td style="width:161px;">S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine</td>
			<td style="width:123px;">Laser Industries Ltd</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Stereotaxic head holder</td>
			<td style="width:123px;">KOPF</td>
			<td style="width:161px;">900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">Sterile Syringe 2 ml</td>
			<td style="width:123px;">Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe-needle 27 G</td>
			<td style="width:123px;">Braun</td>
			<td style="width:161px;">305620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced brain injury in the motor cortex of rats

Una técnica común para inducir accidente cerebrovascular en modelos experimentales de roedores implica la oclusión transitoria (a menudo denotada como MCAO-t) o permanente (designada como MCAO-p) de la arteria cerebral media (MCA) utilizando un catéter. Esta técnica generalmente aceptada, sin embargo, tiene algunas limitaciones, limitando así su uso extensivo. La inducción del accidente cerebrovascular por este método se caracteriza a menudo por una alta variabilidad en la localización y el tamaño del área isquémica, ocurrencias periódicas de hemorragia y altas tasas de mortalidad. Además, la finalización exitosa de cualquiera de los procedimientos transitorios o permanentes requiere experiencia y a menudo dura unos 30 minutos. En este protocolo, se presenta una técnica de irradiación láser que puede servir como un método alternativo para inducir y estudiar lesiones cerebrales en modelos de roedores.
En comparación con las ratas en los grupos de control y MCAO, la lesión cerebral por inducción láser mostró una menor variabilidad en la temperatura corporal, volumen de infarto, edema cerebral, hemorragia intracraneal y mortalidad. Además, el uso de una lesión inducida por láser causó daño a los tejidos cerebrales sólo en la corteza motora a diferencia de los experimentos MCAO donde se observa la destrucción de la corteza motora y los tejidos estriados.
Los resultados de esta investigación sugieren que la irradiación láser podría servir como una técnica alternativa y eficaz para inducir lesiones cerebrales en la corteza motora. El método también acorta el tiempo para completar el procedimiento y no requiere controladores expertos.

No se registraron muertes ni SAH ni en el control ni en los grupos experimentales(Tabla 1). El grupo MCAO tenía una tasa del 20% tanto de mortalidad como de SAH.
Los cambios relativos de la temperatura corporal en las ratas de ambos grupos también fueron similares, a pesar de una diferencia en la variabilidad de ambos grupos (Tabla 1).
Hubo un SEN significativamente peor tanto en los modelos láser (16 x 1,1) como en el MCAO (20 x...

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Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

El protocolo presentado aquí muestra una técnica para crear un modelo de roedor de lesión cerebral. El método descrito aquí utiliza irradiación láser y apunta a la corteza motora.

Lesión cerebral inducida por láser en la corteza motora de ratas

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Nuestro protocolo proporciona una metodología novedosa para crear lesiones cerebrales traumáticas en ratas que utilizan irradiación láser para crear un impacto de enfoque en la corteza motora. La principal ventaja de esta técnica son la baja variabilidad en el área de infarto, las bajas tasas de mortalidad y la relativa simplicidad del procedimiento que no requiere manejadores expertos. Demostrando el procedimiento estará Dmitry Natanel, un investigador de nuestro laboratorio.Para realizar una lesión cerebral inducida por láser, primero asigne 20, 300 a 350 ratas Sprague Dawley en el grupo láser y 20 al grupo operado por Sham de control. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo de abstinencia, coloque una rata en una almohadilla de calentamiento regulada por temperatura rectal y use una afeitadora para eliminar suficiente vello del sitio de la lesión con un margen libre de pelo de aproximadamente dos centímetros alrededor de la incisión. Desinfectar la piel expuesta con 70% de etanol y colocar la rata en la posición propensa en un soporte de cabeza estereotaxico.Haga una incisión de tres centímetros para permitir que el reflejo lateral del cuero cabelludo exponga el área entre bregma y lambda. Sosteniendo un láser Nd:YAG con una longitud de onda máxima de 1064 nanómetros a una distancia de dos milímetros del cráneo, administre 50 julios veces 10 puntos con una duración de pulso de un segundo al área expuesta del cráneo por encima del hemisferio derecho. Después de que se haya entregado la lesión láser, retire la rata del dispositivo y cierre el cuero cabelludo con suturas quirúrgicas de seda 3-0.A continuación, coloque la rata en su jaula con supervisión hasta la plena reclinación. 24 horas después del procedimiento, utilice un sistema de puntuación de 43 puntos para evaluar la puntuación de gravedad neurológica. Probar a los animales en busca de déficits neurológicos, alteraciones del comportamiento, tarea de equilibrio de haces y reflejos, y asignar puntuaciones más altas para discapacidades más graves.Después de la evaluación, cosecha los cerebros de cada animal experimental y control de acuerdo con los protocolos estándar. Para evaluar el volumen del infarto cerebral, secciona el cerebro cosechado en seis rodajas coronales de dos milímetros de espesor e incuba cada rebanada en 0.05%TTC durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después de la tinción, escanee estas rebanadas con un escáner óptico con una resolución de 1600 por 1600 puntos por pulgada.Las áreas no manchadas de las rebanadas cerebrales fijas se definen como infarto. Para evaluar la incidencia de rotura de la barrera hematoencefálica, 24 horas después de que la lesión inducida por el láser cargue una jeringa con un tinte azul de 2%Evans diluido en cuatro mililitros por kilogramo de solución salina y entregue la solución por vía intravenosa a las ratas lesionadas y controle a través de la vena de cola cannulada. Deje que la solución circule durante una hora antes de usar pinciets quirúrgicos y tijeras para abrir el pecho del primer animal.Perfunda el corazón expuesto con 0,9% de solución salina enfriada a través del ventrículo izquierdo a 110 milímetros de mercurio de presión hasta que se observe un líquido de profusión incoloro desde la aurícula derecha. A continuación, cosecha el cerebro y obtener dos rodajas caudales rostrales milimétricas. Separe las rebanadas cerebrales izquierdas de las rebanadas cerebrales derechas para permitir la evaluación de los hemisferios lesionados y no lesionados por separado, y pese las muestras.Homogeneizar las muestras con un mortero y un mortero e incubar las muestras de tejido en 50%ácido tricloroacético durante 24 horas. Al día siguiente, centrifugar las muestras de tejido cerebral homogeneizada durante 20 minutos a 10.000 veces G y temperatura ambiente, y mezcle un mililitro del sobrenadante con 1,5 mililitros de 96% de etanol en una proporción de uno a tres. Luego, utilice un detector de fluorescencia en una excitación de 620 nanómetros y la longitud de onda de emisión de 680 nanómetros para evaluar la rotura de la barrera hematoencefálica.Como se observa en el análisis histológico, la tinción azul de Evans se puede utilizar para revelar la incidencia de lesiones cerebrales en animales láser y modelo MCAO. En este análisis representativo no se registraron muertes ni hemorragias subaracnoideas ni en los grupos de control o experimentales, y el grupo MCAO tenía una tasa del 20% de mortalidad y hemorragia subaracnoidea. Los cambios relativos de la temperatura corporal en las ratas de ambos grupos también fueron similares, a pesar de una diferencia en la variabilidad de ambos grupos.Las puntuaciones de gravedad neurológica fueron significativamente peores en los modelos láser y MCAO en comparación con el grupo de control operado por Sham. Inducido por láser a lesiones cerebrales también causó un aumento significativo en el volumen de infarto en el hemisferio objetivo en comparación con el grupo de control operado por Sham. Sin embargo, el volumen de infarto del modelo láser era menor en comparación con los animales heridos por la técnica MCAO.No se observó ninguna diferencia en el edema cerebral entre el modelo de lesión cerebral inducida por láser y el grupo de control operado por Sham. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en el edema cerebral entre el modelo láser y los grupos lesionados de MCAO. En comparación con el grupo de control operado por Sham, las técnicas de lesión cerebral inducida por láser y MCAO causaron un aumento significativo en la rotura de la barrera hematoencefálica en los hemisferios no lesionados y objetivo.Al intentar este modelo, recuerde apuntar con precisión al área de la corteza motora y estandarizar la energía, el número de puntos que se irradian y el tiempo total de exposición. Después de este procedimiento, se puede realizar una amplia plétora de pruebas conductuales, como caminar con haz, Froedert y otras evaluaciones.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociencias

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Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Investigación de alteraciones en Caecum Microbiota después de una lesión cerebral traumática en ratones

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Modulación no invasiva y mapeo robótico de la corteza motora en el cerebro en desarrollo

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...