Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. og T.H. anerkender finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellence strategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, og tilskud HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. anerkender delvis støtte inden for rammerne af LOEWE-projektet iNAPO fra Hessens statsministerium for videregående uddannelse, forskning og kunst. Vi takker Dr. Wolfgang Bronner og Dr. Agne Zukauskaite fra Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF for donation af høj kvalitet guld belagt silicium vafler.

BEMÆRK: Se figur 1 for at få en skematisk oversigt.
1. Opsætning af reagens
BEMÆRK: De polymerer, der anvendes til denne protokol, er: maleimide-polyethylenglycol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), thiol-polyethylenglycol-thiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol afsluttet poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM-SH, 637 kDa) og thiol afsluttet polystyren (PS-SH, 1,3 mDa).N
<ol><li>Forbered den veldefinerede og høje molære masse PNiPAM-SH via atom overførsel radikal polymerisering, efterfulgt af konvertering og reduktion af den funktionelle endegruppe for indførelsen af en thiol moiety, som beskrevet i litteraturen18. Se figur 1 for de detaljerede strukturer.</li>
	<li>Til opbevaring af kemikalierne fremstilles mindre aliquots i et tørt handskebokssystem med nitrogenatmosfære for at undgå udsættelse for atmosfærisk ilt og fugt. PEG og PNiPAM er hygroskopiske45,46 og de funktionelle endegrupper peg, PNiPAM og PS er kendt for at blive let oxideret, når de opbevares under omgivende forhold33,47,48. Alle kemikalier skal opbevares ved -20 °C.</li>
	<li>Brug opløsningsmidler af analytisk kvalitet eller højere. Desuden bruge ultrarent vand til at skylle AFM cantilevers chips og glasvarer, fordi enkelt molekyle eksperimenter er meget følsomme over for al forurening.</li>
</ol>2. Opsætning af udstyr
BEMÆRK: Brug pincet og bægerglas af rustfrit stål eller glas. Brug omvendt pincet for et sikkert greb (f.eks. model R3 SA med en lav fjederkonstant).
<ol><li>Forbered RCA (ultraren vand, hydrogenperoxid og ammoniak (5:1:1)) opløsning til at rense glasvarer og pincet.</li>
	<li>Sæt beholderne i et bægerglas og fyld det med RCA, indtil glas eller pincet er fuldt tildækket.</li>
	<li>Bægerglasset opvarmes fra trin 2.2 i 1 time ved 80 °C.</li>
	<li>Skyl derefter beholderne med ultrarent vand, indtil der ikke længere kan konstateres skarp lugt (mindst tre gange).</li>
	<li>Tørglas og en pincet i en ovn (120 °C).</li>
</ol>3. Funktionalisering af tip
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i en røghætte for at undgå indånding af organiske dampe. Derudover kræves handsker, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse. Brug nitril eller latex handsker for hvert skridt for at undgå forurening. Bær opløsningsmiddelbestandige handsker, når du bruger toluen. Alle trin, medmindre andet er angivet, udføres på RT. Brug nyt udstyr og handsker til hvert trin for at undgå eventuel krydskontaminering.
<ol><li>Udfør overfladeaktivering ved at anvende iltplasma på AFM cantilever-chippen MLCT-Bio-DC. BEMÆRK: Plasmabehandlingens effektivitet ved yderligere funktionaliseringstrin skalaermed indholdet af ilt i plasmakammeret.<ol>
<li>Brug nyrensede pincet til at placere AFM cantilever chips i et plasmakammer (40 kHz, 600 W).</li>
		<li>Brug specialmodificeret aktiveringsprogram: evakuering (0,1 mbar) – oversvømmelse med ilt til et tryk på: 0,2 mbar (4 min) – plasmaproces (effekt: 40%, varighed: 2 min, procestryk: 0,2 mbar).</li>
		<li>Udluft kammer og fortsætte med trin 3.2.2 straks for at forhindre enhver adsorption af forurenende stoffer til AFM cantilever chips fra luften.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanisering og PEGylation BEMÆRK: Timing er en kritisk parameter mellem trinnene. Forbered løsninger så friske som muligt i ventetiderne. Maleimidgrupper er udsat for hydrolyse i vandige medier og thioler let blive oxideret til disulfider i opløsning33,47 hindrer AFM tip funktionalisering reaktioner.<ol>
<li>Der fremstilles en silane-PEG-mal opløsning i toluen (1,25 mg/ml) i opløsningsmiddelbestandige plast- eller glasrør, og 6 ml af opløsningen hældes i flade petriskåle, hver 3 ml. BEMÆRK: Hvis der observeres binding af flere sondepolymerer i SMFS-eksperimentet, kan blanding af silane-PEG-mal med ikke-funktionel silane-PEG reducere antallet af forankringspunkter. Til justering af passiveringslaget PEG med forskellige masser (dvs. konturlængder) kan anvendes27.</li>
		<li>Inkuber af AFM cantilever-spånerne umiddelbart efter trin 3.1.3 i silane-PEG-mal-opløsningen (op til 10 spåner pr. Petriskål) i 3 timer ved 60 °C35.</li>
		<li>Tag petriskåle ud af ovnen og lad opløsningen køle af i mindst 10 min.</li>
		<li>Skyl hver AFM cantilever chip omhyggeligt. Reducer virkningen af kapillær kræfter på AFM cantilever, når de passerer luft-opløsningsmiddel interface, for eksempel ved at vippe disse chips lidt, når nedsænkning i opløsning.<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer skylles tre gange med toluen.</li>
			<li>For PNiPAM polymer skylles én gang med toluen og to gange med ethanol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vælg mindst to AFM cantilever chips som kontrol AFM cantilever chips, springe trin 3.3 og skyl dem som følger for at øge polariteten af opløsningsmidlet:<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer skylles to gange med ethanol og én gang med ultrarent vand.</li>
			<li>For PNiPAM polymer skylles to gange med ultrarent vand. BEMÆRK: Kontrol AFM cantilever chips har været igennem alle funktionalisering trin undtagen polymer vedhæftet fil (trin 3.3). De tjener til at bevise renligheden af funktionaliseringsprocessen, AFM cantilever spånholdersystemet, overfladerne og de opløsningsmidler, der anvendes til SMFS-eksperimentet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Covalent polymer vedhæftet fil BEMÆRK: Selv om AFM cantilever spidsen forventes at være helt dækket med maleimide grupper, der er blot et par bindende steder for enkelt sonde polymer, fordi maleimid gennemgår hydrolyse i vand, der fører til inaktive PEGs47. Disse inaktive PEGs fungerer som et passiveringslag som beskrevet ovenfor.<ol>
<li>Inkuber AFM cantilever chips direkte efter trin 3.2.5 i en af følgende polymeropløsninger i 3 ml Petri-skåle. Hvis den pågældende polymer ikke opløses korrekt, skal du bruge et 40 °C vandbad og omrøre opløsningen godt. BEMÆRK: Da brugen af thiolopafsluttetpolymerer kan føre til dannelse af disulfidbindinger, der hæmmer reaktionen med maleimidgrupperne af silane-PEG-mal, anbefales et reduktionsmiddel, især hvis trin 3.3 anvendes i vandige buffere til vandopløselige polymerer33.<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer anvendes en koncentration på 1,25 mg/ml i toluen i 1 time ved 60 °C.</li>
			<li>For PNiPAM-polymerer anvendes en koncentration på 1,25 mg/ml i ethanol i 3 timer ved RT. BEMÆRK: Hvis der observeres binding af flere sondepolymerer i SMFS-eksperimentet, skal polymerkoncentrationen reduceres.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Skyl omhyggeligt hver AFM cantilever chip.<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer skylles to gange med toluen, to gange med ethanol og én gang med ultrarent vand efter 10 min. nedkøling.</li>
			<li>For PNiPAM polymerer skylles to gange med ethanol og to gange med ultrarent vand.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hver AFM-kantilchip opbevares separat i en lille (1 ml) petriskål fyldt med ultrarent vand ved 4 °C, indtil den anvendes i et forsøg.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Forberedelse af overfladen
<ol><li>Siliciumoxid wafer BEMÆRK: Denne overflade blev brugt til SMFS med PEG og PNiPAM.<ol>
<li>Skær en siliciumoxid wafer i små stykker ved hjælp af en diamant kniv.</li>
		<li>Sæt siliciumoxid stykker separat i mikrocentrifuge rør og fyld disse rør med ethanol.</li>
		<li>Sonikere siliciumoxid stykker i 10 min.</li>
		<li>Skyl siliciumoxidstykkerne med ethanol to gange og tør dem under et kvælstofflow omhyggeligt. Brug straks silikonestykkerne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selvsamlet monolag af hydrofobalkane thiol på guld (SAM) BEMÆRK: Denne overflade blev brugt til SMFS med PS. Se litteratur39,49 for mere information om SA'er.<ol>
<li>Brug en guldbelagt siliciumwafer (A [100], 5 nm titanium, 100 nm guld) til at udføre trin 4.1.1 – 4.1.4.</li>
		<li>Der inkuberes overfladestykkerne i en opløsning på 1 dodecanthiol (2 mM) i 18 timer.</li>
		<li>Skyl de frisklavede SAMs i ethanol to gange.</li>
		<li>Tørre SA'er med nitrogengennemstrømning til direkte brug eller opbevar dem i ethanol i op til 4 dage til senere brug.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Dataindsamling
BEMÆRK: Alle målinger vist her blev udført i ultrarent vand med en Cypher ES AFM ved hjælp af en opvarmning og køling prøve fase for temperaturvariation. Generelt kan alle AFM'er, der giver mulighed for at måle i væsker, anvendes.
<ol><li>Sæt den funktionaliserede AFM cantilever chip ind i AFM.</li>
	<li>Lim den forberedte overflade fast i en prøveholder, der er egnet til måling i væsker (f.eks. højopløsningsreplikationsforbindelse 101RF eller et UV-hærdet klæbemiddel). BEMÆRK: Disse bindemidler er meget inert og modstandsdygtige over for et stort antal polære opløsningsmidler. Klæbemidmens modstandsdygtighed over for ikke-polære opløsningsmidler (f.eks. toluen eller hexan) eller høje temperaturer skal kontrolleres før brug.</li>
	<li>Nedsænk AFM cantilever chip og sondeprøven i væsken, her: ultrarent vand. BEMÆRK: Der kan aflejres et opløsningsmiddeldråbe (ca. 100 μL) på AFM-spånholderen. Ved at dække AFM-cantilever-spånen med opløsningsmiddel reduceres kapillærkræfterne, som ellers ville virke på AFM-kantilen, når den nærmer sig prøvefladen, der passerer gennem luftopløsningsmidlet.</li>
	<li>Om nødvendigt justeres temperaturen, og systemet skal bringes i ækvilibrere. BEMÆRK: Temperaturændringer kan resultere i en afbøjning af AFM cantilever på grund af en bimetallisk effekt for AFM cantilevers med en reflekterende belægning som aluminium eller guld. Der skal udføres ligevægt væk fra overfladen (flere μm), indtil der ikke observeres yderligere ændringer af afbøjningssignalet (op til 15 min for MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Varier temperaturen tilfældigt for at udelukke eventuelle virkninger af funktionaliseringens ældning. Sørg for, at de anvendte temperaturer ikke fører til en irreversibel bøjning af AFM cantilever. BEMÆRK: Enhver temperatureffekt på opløsningsmiddelegenskaberne (f.eks. fordampning eller ændringer i viskositeten) kan hæmme dine eksperimenter. I de præsenterede eksempler blev temperaturen varieret over et interval på op til 40 K i trin på 10 K og tog vand som opløsningsmiddel (f.eks. fra 278 K til 318 K).</li>
	<li>Anvæn overfladen for at bestemme InvOLS (omvendt optisk håndtagsfølsomhed) ved at tage kraftforlængelseskurver på en hård overflade (f.eks. siliciumoxid). Til dette formål skal du tage afbøjningssignalet fra fotodetektoren (i V) vs. piezoafstand og bestemme hældningen af den del, der repræsenterer indrykningen af AFM-kantilspidsen ind i den underliggende overflade (frastødende regime) ved hjælp af en lineær funktion. For at reducere fejl skal du tage gennemsnittet på mindst fem værdier for at opnå den endelige InvOLS-værdi. Yderligere oplysninger findes i litteraturen4,39. BEMÆRK: InvOLS kan kun bestemmes pålideligt på hårde overflader. I tilfælde af forsøg på bløde overflader eller grænseflader skal du sørge for at placere en hård overflade tæt på dine bløde overflader. Derefter kan InvOLS-kalibreringen udføres før eller efter dine eksperimenter med den bløde overflade uden at skulle adskille AFM-opsætningen.</li>
	<li>Ved forårskonstantbestemmelse flyttes AFM-kantilnår til en højde med hverken attraktive eller frastødende interaktioner mellem AFM-kanorspids og overflade (flere μm). Derefter registreres et termisk støjspektrum, hvor effektspektraltætheden (PSD) vs. frekvens afbildes. Følgende trin udføres normalt af automatiserede indbyggede funktioner i kommerciel AFM-software: For det første analyseres det erhvervede termiske støjspektrum ved at tilpasse en funktion til PSD, f.eks. Pasformen sker op til minimum mellem den første og anden resonans. For det andet bestemmes arealet under den monterede del af PSD vs-frekvensområdet, der repræsenterer den gennemsnitlige kvadratisk forskydning af AFM-kantileren i lodret retning. Endelig er ækvikle sætning bruges til at opnå AFM cantilever kraft konstant28,50. BEMÆRK: Der bør anvendes et passende frekvensområde, der omfatter den første resonanstop i AFM-kantilen. For at få et tilfredsstillende signal-støj-forhold skal der akkumuleres mindst 10 psd'er med den højest mulige frekvensopløsning.</li>
	<li>Start eksperimentet. Optag kraftkort ved at tage kraftforlængelseskurver på en gitterlignende måde (f.eks. 10 x 10 punkter for et areal på 20 x 20 μm2) for at undgå lokale overfladeeffekter (f.eks. urenheder, forskydninger) og til gennemsnitlige forskellige overfladearealer. BEMÆRK: Typiske parametre er en trækkrafthastighed på 1 μm/s og en prøvetagningshastighed på 5 kHz for at sikre tilstrækkelig opløsning. Prøvetagningshastigheden bør tilpasses, når trækhastigheden er varieret. Tilbagetrækkeafstanden skal tilpasses den målte polymers kontur eller desorptionslængde (ca. det dobbelte af den forventede længde).</li>
	<li>Brug og varier er tid mod overfladen for at gøre det muligt for den enkelte polymer at klæbe til overfladen (typisk 0 – 5 s).</li>
	<li>InvOLS's og fjederkonstantens bestemmelse gentages ved forsøgets afslutning for at kontrollere systemets konsistens og stabilitet. BEMÆRK: Ved stærk vedhæftning mellem polymer og overflade kan kalibreringen udføres efter selve eksperimentet for at bevare funktionaliseringen.</li>
</ol>6. Evaluering af data
BEMÆRK: Til dataevaluering blev der brugt en brugerdefineret skriftlig software baseret på Igor Pro til at udføre følgende trin.
<ol><li>Konverter det rå afbøjningssignal (i Volt) til kraftværdier (i Newton) ved multiplikation med den registrerede InvOLS og den bestemte fjederkonstant.</li>
	<li>Træk afdrejningen af AFM-kantilduken (efter multiplikation af det rå afbøjningssignal med InvOLS) fra den afstand, der drives af piezoelementerne i lodret retning for at opnå den sande forlængelse (spids-overfladeafstand)4.</li>
	<li>Ret de kraftforlængelseskurver, der opnås for afdrift, ved at tilpasse en lineær funktion til baseline efter den sidste hændelse og trække det samme fra kraftforlængelseskurven. Den monterede del skal udgøre en tilstrækkelig forlængelse fra overfladen, hvor der hverken observeres attraktive eller frastødende interaktioner mellem AFM cantilever-spidsen og den underliggende overflade. Derefter indstilles grundlinjen til nulaksen. BEMÆRK: I tilfælde af målinger på meget reflekterende overflader som guld kan der forekomme interferens. Disse skyldes delvis refleksion af laserstrålen fra overfladen og fra bagsiden af AFM cantilever. Så, den opnåede kraft-forlængelse kurver kan vise en sinusformet kraft signal artefakt langs den lodrette forlængelse. Dette er en artefakt, der hæmmer de endelige kraftværdier. For stadig at tage hensyn til disse kraftforlængelseskurver er det muligt at foretage en korrektion (figur 2).</li>
	<li>Hvis interferenserne vises i kraftforlængelseskurverne, skal du vælge en repræsentativ kraftforlængerkurve (tilbagetrækningskurve), der ikke viser andre hændelser end muligvis en top af uspecifik vedhæftning og den samme sinusformede artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2A). BEMÆRK: Udglat den repræsentative kraftforlængerkurve for at opnå interferensens lavfrekvente mønster.</li>
	<li>Vælg en kraftudvidelseskurve, der skal korrigeres (Figur 2B).</li>
	<li>Overlejr begge kraftforlængelseskurver fra trin 6.4. og 6,5. for at sikre, at begge udviser den samme sinusformede artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2C).</li>
	<li>Træk den (glattede) repræsentative kraftforlængerkurve fra kraftforlængelseskurven for at blive korrigeret, hvilket fører til en lige snarere end en sinusformet baseline (figur 2D). BEMÆRK: Pas på, at den uspecifikke vedhæftningstop i den repræsentative kurve adskiller sig fra eventuelle hændelser med et enkelt molekyle, der vises i de kurver, der skal korrigeres. Faktisk er udvælgelsen af den repræsentative kurve afgørende for en korrekt korrektion.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomisk interesse.

AFM-baserede SMFS er et af de vigtigste værktøjer til at undersøge enkelt molekyle interaktioner i polymer fysik. For en sand enkelt molekyle eksperiment, kovalent fastgørelse af sonden polymer til en AFM cantilever tip er afgørende.
Mange tidligere værker er baseret på nanofiskeri eksperimenter, især for PNiPAM, hvor polymerer adsorberes på en overflade og derefter strakt ved tilfældigt plukke dem fra substratet ved hjælp af en AFM cantilever tip30,31. Dette kan ændre resultaterne og føre til fejlfortolkning af det indre molekyle adfærd. Der kan samarbejdseffekter dominere resultaterne, fordi interaktioner med tilstødende polymerer ikke kan udelukkes. Dette har en stor indvirkning på resultaterne, især for polymerer, der viser signifikant anderledes adfærd i løs vægt sammenlignet med enkelt isolerede molekyler57,58.
Funktionaliseringsprotokollen præsenteres her, er pålidelig og kan let anvendes på forskellige polymerer, uanset konturlængde, hydrofobicity eller monomernes steriske hindring. Derudover er en passivitet forudsat at forhindre uønskede interaktioner mellem den enkelte sonde polymer og AFM cantilever spids samt mellem AFM cantilever spidsen og den underliggende overflade. Desuden vises evalueringen af kraftforlængelseskurver, der viser strækhændelser. Der foreslås en procedure for bestemmelse af master kraft-forlængelse kurver. Dette er et bedre middel til at afsløre, fx temperaturrelaterede effekter på kraft-forlængelse adfærd. Endvidere er analysen af enkelt molekyle desorption begivenheder byder konstant kraft plateauer forudsat. Også en enkel måde at korrigere sinusformede kraft signal artefakter i kraft-forlængelse kurver er givet, som ellers kunne forringe resultaterne af forsøget.
Sammenlignet med Stetter et al.39reduceres funktionaliseringsproceduren her til tre trin i stedet for fire , og procedurens robusthed forbedres. Den største fordel ved at udføre PEGylation og silanisering i ét trin er at have en bedre kontrolleret reaktion og øge udbyttet. Desuden skal der udarbejdes færre løsninger, og der er behov for færre skylningstrin. Dette reducerer indsatsen og tiden til forberedelse og øger reproducerbarheden. Desuden er flytning af AFM-cantilevers altid en kritisk del af funktionaliseringsprocessen. En overførsel fra den ene løsning til den anden indebærer altid risiko for stærkt at påvirke funktionaliseringskvaliteten på grund af overførsler gennem luftvandsgrænsefladen eller for at miste AFM-cantilevers ved forkert brug af pincet.
For at bevise korrekt kovalent fastgørelse af en enkelt polymer til en AFM cantilever tip forskellige betingelser skal være opfyldt. For det første, kontrol AFM cantilevers er af væsentlig betydning og bør være forberedt på hver funktionalisering. Funktionaliseringsprocessen og væskecellen til udførelse af forsøgene anses kun for at være rene, hvis et lille antal kraftforlængelseskurver viser strækninger eller plateauer i kontroleksperimentet (i de præsenterede eksempler mindre end 2 %).
En klar stretching mønster uden yderligere dråber eller maxima er afgørende for at have ordentlig enkelt molekyle stretching begivenheder. Desuden bør afhængigheden af brudkraft på kraftbelastningshastigheden ved brud eller den komplette elastiske reaktion af strækkurven analyseres for at udelukke samtidig desorption af flere polymerer59,60. For PEG og PNiPAM viste henholdsvis 19 % og 42 % af de kraftforlængelseskurver, der blev indtaget på forskellige positioner af overfladen. For at opnå stretching begivenheder, skal physisorption af polymeren til de respektive underliggende overflade være stærk. Ellers observeres en plateaulignende desorptionshændelse. Dette er endnu mere afgørende for påvisning af stretching begivenheder ved høje kræfter (op til 500 pN eller mere). Da denne stærke physisorption ikke er opfyldt for hver kraft-udvidelse kurve, udbyttet af sådanne begivenheder er mindre end for ren plateau-lignende desorption begivenheder. Alternativt kan der anvendes stærkt klæbende grupper såsom katekoler eller chemisorption mellem polymer og underliggende overflade. Dette kræver imidlertid, at der indføres yderligere funktionelle grupper eller koblingssteder på polymeren61,62.
Faktisk giver polymerens masse (dvs. konturlængde) et værdifuldt fingeraftryk. Selvom massen ikke direkte kan oversættes til den målte konturlængde af følgende årsager, er længdefordelingen meget værdifuld til at definere enkeltmolekylehændelser. I tilfælde af en PNiPAM polymer med en lav polydispersity (= = 1,28), fandt vi betydelige forskelle i forlængelsesværdierne for de opnåede stretching hændelser (og dermed i polymerlængden) i forsøgene. En af grundene til dette kunne være bestemmelsen af polymerens længde og dens fordeling. I størrelsesudelukkelseskromatografi (SEK) bestemmes målpolymerens relative vægt i forhold til standarder som PS eller poly (methylmethacrylat) (PMMA)63. Den formodede relative vægt forventes at afvige fra den absolutte molekylvægt, fordi målpolymerens og standardens hydrodynamiske radius og standard en væsentligt forskellig. Derudover kan silane lag være oligomerized af falske vand i toluen under funktionaliseringsprocessen. Fastgørelsen af sådanne oligomerer til AFM cantilever spidsen fører til et mere fleksibelt lag med færre ankerpunkter64. Polymerens fastgørelsespunkt til siliciumlaget er måske ikke nødvendigvis i spidsen, hvilket fører til et skift af de fundne længdeværdier29. Mens en polymermodel som den ormelignende kæde (WLC) eller fjc-modellen (frit fende kæde) ikke kan gengive den respektive kraftudvidelsesadfærd for PEG eller PNiPAM korrekt over hele udvidelsesområdet18,29,41,65,66, kan en sådan polymermodel være værdifuld for andre polymer- og proteinsystemer10,15,67,68.
Den kovalente fastgørelse af en enkelt PS-polymer (med en konturlængde på mere end 1 μm) anses kun for at være vellykket, når et betydeligt antal kraftforlængelseskurver viser et tilstrækkeligt plateau med konstant kraft (figur 5). Et plateau som følge af desorbing en enkelt polymer er defineret ved en enkelt skarp dråbe af en konstant kraft til baseline ved en vis forlængelse, som angivet i figur 5A. Hvis der er knyttet flere polymerer til AFM-kanorspidsen, observeres en kaskade af plateauer56 (Figur 5C). Plateauetlængde (desorptionslængde), der korrelerer med polymerkonturlængden51,skal være betydeligt længere end nogen vedhæftningstop på grund af uspecifik vedhæftning af AFM-kanorspidsen til den underliggende overflade (her omkring 200 nm). Funktioner, der udelukkende vises i en enkelt kraftudvidelseskurve, bør ikke fortolkes. I de præsenterede forsøg viste mindst 80 ud af 100 kurver et plateau, der var længere end 200 nm på mindst to kraftkort to forskellige steder på overfladen. Desuden viser fordelingen af desorptionslængder ved hjælp af punktområder som angivet i figur 5B og 5D,om og hvor mange polymerer der er bundet til AFM cantilever spidsen. For PS's vedkommende tjente en snæver fordeling af desorptionskraften og længden fra plateauerne i kraftforlængelseskurverne som bevis for en vellykket kovalent fastgørelse. Dette viste sig endelig at være en succes for funktionaliseringsprotokollen. Vi anbefaler derfor på det kraftigste, at der præsenteres sådanne kraft- og længdefordelinger i publikationer.
Evaluering kraft-udvidelse kurver ved hjælp af indbyggede algoritmer, der omfatter mange forudindstillede parametre bør ske med omhu. Årsagerne er f.eks., at en fast prøvetagningshastighed ikke er passende for hver anvendt trækkrafthastighed, eller at en automatiseret udjævning af kraftforlængelseskurverne kan være en gennemsnitsværdi for vigtige detaljer. Normalt kan en korrekt forståelse af den respektive evalueringsprocedure forhindre fejl i evalueringsproceduren, hvilket igen kan have stor indflydelse på de endelige resultater af et AFM-baseret SMFS-eksperiment.
Sammenfattende præsenterer vi en funktionaliseringsprotokol, der er pålidelig og let kan anvendes på en række polymerer. Desuden præsenteres korrekt evaluering af enkelt molekylekraftforlængelseskurver, der gør det muligt at bestemme fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde. De præsenterede protokoller og procedurer er værdifulde for undersøgelsen af stimuli-responsive systemer på enkelt molekyleniveau.

Siden sin opfindelse i 1980'erne1, atomkraftmikroskopet (AFM) er blevet en af de vigtigste billeddannelsesteknikker i naturvidenskaben med rumlig opløsning under nanometer , subpiconewton kraftopløsning og muligheden for at måle i forskellige opløsningsmiddel- og temperaturforhold2,3,4,5,6,7.,
Bortset fra billeddannelse8,9, AFM bruges til at udføre enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMFS) giver indsigt i klæbende interaktioner mellem en enkelt polymer og overflader, fysiske egenskaber af enkelte polymerer og udfoldelse mekanismer proteiner7,10,11,12,13,14,15,16. I et almindeligt SMFS-eksperiment kommer den funktionaliserede cantilever spids i kontakt med en overflade, så polymeren ved AFM cantilever spidsen sorber til denne overflade. Ved at trække AFM cantilever spidsen fra overfladen, en ændring i afbøjning af AFM cantilever omdannes til en kraft, der fører til en kraft-udvidelse kurve4. Fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde kan bestemmes som afhængige af forskellige parametre såsom trækkraft, dvæletid på overfladen, indrykningsdybde ind i overfladen, temperaturen, opløsningsmiddel17,,18 og forskellige overflader som faste substrater, polymerfilm eller understøttede lipidbilag19,20,21,22. Desuden kan en polymer undersøges i forskellige rumlige retninger, og dermed undersøge friktionsegenskaberne af polymeren23,24,25,26.
En kovalent fastgørelse af den undersøgte polymer til en AFM cantilever tip er afgørende for sådanne undersøgelser. Således forhindrer et højt udbytte af enkeltmolekylehændelser med en og samme polymer, der er bundet til en AFM cantilever-spids, enhver skævhed i resultaterne på grund af kalibrering af afårskonstanten af AFM-kantilever27,28, varierende fastgørelsespunkter29 eller varierende polymerer (med forskellige konturlængder), som i tilfælde af nanofisk3030,31,32. Interaktioner med andre polymerer samt gennemsnitseffekter kan også i vid udstrækning forebygges18,28. For den kovalente fastgørelse af en polymer til AFM cantilever spidsen, kan forskellige typer af kemiske ændringer anvendes, hvoraf mange er sammenfattet i bogen af Hermanson33. Amin og thiol-baserede sammenkædningsreaktioner samt klikkemi repræsenterer de mest anvendte metoder i AFM cantilever tip funktionalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 viser, hvordan man bruger 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS kemi til at knytte et protein til en AFM cantilever tip. Men de nævnte funktionelle grupper har tendens til at krydslinke, hvilket fører til et tab af funktionalitet43,44. Carbodimides udviser også en tendens til hurtig hydrolyse i opløsning43. Maleimide og thiol grupper er generelt mere stabile og viser ikke crosslinking reaktioner. Den præsenterede protokol er en optimering af de tidligere offentliggjorte protokoller ireferencerne 35,39.
Her præsenteres en pålidelig funktionaliseringsprotokol, der let kan justeres til et stort antal forskellige polymerer, uanset egenskaber som konturlængde eller hydrofobitet. Tre forskellige polymerer blev valgt som eksempel: hydrofile polyethylenglycol (PEG) og poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM) samt høj molære masse hydrofobe polystyren (PS).N For at sikre en kovalent bindingsevne med et passende linkermolekyle blev de tre polymerer udvalgt til at byde på en telechelic thiol moiety som funktionel slutgruppe. Selve linkermolekylet er typisk en kort PEG-polymer med to aktive steder, en silanegruppe i den ene ende og en maleimidegruppe i den anden ende. Førstnævnte muliggør en kovalent fastgørelse til AFM cantilever spidsen og sidstnævnte en bindende reaktion med thiol gruppen af funktionaliseret høj molære masse polymer. Desuden tjener inaktive PEG-linkermolekyler som et passiveringslag for at forhindre uønskede interaktioner mellem sondepolymeren og AFM-kantilerspidsen samt mellem AFM-kantilspidsen og den underliggende overflade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

Atomic force mikroskopi (AFM)-baserede enkelt molekyle kraft spektroskopi er et ideelt værktøj til at undersøge samspillet mellem en enkelt polymer og overflader. For et ægte enkelt molekyle eksperiment, kovalent fastgørelse af sonden molekyle er afgørende, fordi først da kan hundredvis af kraft-forlængelse spor med en og samme enkelt molekyle opnås. Mange spor er igen nødvendige for at bevise, at et enkelt molekyle alene er undersøgt. Derudover, passivitet er afgørende for at forhindre uønskede interaktioner mellem enkelt sonde molekyle og AFM cantilever spids samt mellem AFM cantilever spidsen og den underliggende overflade. Funktionaliseringsprotokollen præsenteres her, er pålidelig og kan nemt anvendes på en række polymerer. Karakteristiske enkeltmolekylehændelser (dvs. strækninger og plateauer) påvises i kraftforlængelsessporene. Fra disse hændelser kan fysiske parametre såsom strækkraft, desorptionskraft og desorptionslængde opnås. Dette er især vigtigt for den præcise undersøgelse af stimuli-responsive systemer på enkelt molekyleniveau. Som eksemplariske systemer poly (ethylenglycol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamid) (PNiPAM) og polystyren (PS) er strakt og desorbed fra SiOx (for PEG og PNiPAM) og fra hydrofobisk selvsamlede monolagoverflader (for PS) i vandige omgivelser.N

Følgende eksempler viser resultater af enkelt molekyle stretching og desorption af polymerer PEG, PNiPAM og PS. Alle AFM cantilever tips blev funktionaliseret med protokollen ovenfor. PEG og PNiPAM blev målt på SiOx med temperaturvariation. For en detaljeret diskussion af de deraf følgende temperaturafhængige strækkurver for PEG og PNiPAM, se Kolberg et al.18 Et andet kraftforlængelsesmotiv er et plateau af konstant kraft (f.eks. når desorbing PS fra selvsamlede monolag af methyl opsagt alkane thioler på guld (SAM) i vand4,27,39,51).
Eksempel 1: Strækning af PEG og PNiPAM i vand Den temperaturafhængige strækadfærd i vand blev målt ved hjælp af en enkelt PNiPAM og PEG polymerer kovalent bundet til en AFM cantilever spids i den ene ende og physisorbed på en SiOx overflade i den anden ende. Efter kalibreringog ren kontrol eksperimenter (mindre end 2% af kraft-udvidelse kurver viser enkelt molekyle begivenheder), mindst to kraft kort blev registreret for hver AFM cantilever. Det temperaturafhængige eksperiment blev udført ved at registrere mindst ét kraftkort ved hver temperatur. Når kun få stretching begivenheder dukkede op, den respektive AFM cantilever blev kasseret, og den næste AFM cantilever af chippen blev taget (normalt i rækkefølgen C, B, D og E af MLCT-Bio-DC). For peg's eksemplariske data blev der observeret en enkelt stretching-hændelse i 95 ud af 500 målte kraftforlængelseskurver (19 %). For PNiPAM viste 252 ud af 600 kraftforlængerkurver et strækmønster (42 %). For en bedre sammenligning af kraft-forlængelse kurver, en enkelt master kurve for hver temperatur blev genereret. Til dette formål blev kun de kurver med en strækkende hændelse til mindst 500 pN, hvor konformationsudsving og opløsningsmiddeleffekter er ubetydelige, valgt52. Det endelige antal strækninger taget i betragtning var 3 ved 278 K, 7 ved 298 K og 4 ved 318 K for PEG og 4 ved 278 K, 3 ved 298 K og 3 ved 318 K for PNiPAM18.
Proceduren for generering af masterkurver findes i figur 3. De valgte kraftforlængerkurver (figur 3A) skaleres til en længde L0 (forlængelse med en kraft på 500 pN), se figur 3B. Den vedhæftning peak viser en stor variation af uspecifik vedhæftning mellem overfladen og AFM cantilever tip, men påvirker ikke polymer stretching adfærd. Efter sammenlægning af de nyskalerede kraftforlængelseskurver beregnes de i gennemsnit ved en binominel udjævning som vist i figur 3C. Til dette, en Gaussisk filter involves data med normaliserede koefficienter stammer fra Pascal's trekant på et niveau svarende til udjævning parameter 2053. Endelig opnås en masterkurve for hver temperatur som angivet i figur 3D. Zoom-in viser det område, hvor temperatureffekten på kraftforlængelsesadfærden er mest udtalt.
En sammenligning af peg (A) ' temperaturfunktionsmåde og PNiPAM (B) findes i figur 4. For PEG blev der observeret et fald i strækkraften med stigende temperatur. En stigning på ca. 5% af den nyskalerede forlængelse ved 100 pN blev observeret ved en forøgelse af temperaturen fra 278 til 318 K. For PNiPAM kunne der afsløres et modsat temperaturafhængigt skift. Der blev observeret et fald på ca. 1 % af den nyskalerede forlængelse ved 100 pN, da temperaturen blev forøget fra 278 til 328 K. Derudover kunne den strækkefrie energi opnås fra kraftforlængelsesmasterkurverne ved at bestemme arealet under kurven for en given kraftværdi. Dette kunne bruges til at udvinde energiske og entropic bidrag af stretching fri energi ved hjælp af molekylære dynamik (MD) simuleringer18.
Eksempel 2: Desorption af PS fra en SAM-overflade i vand Desorptionen af PS fra en SAM-overflade i vand kan anvendes til at bestemme desorptionskraften og længden og derved kvantificere den hydrofobe interaktion. Efter kalibrering blev der optaget mindst to kraftkort på to forskellige steder på overfladen. Når polymertilbehøret var vellykket, viste kraftforlængelseskurverne plateauer med konstant kraft, som karakteristisk træk, se figur 5A og figur 5C. Plateau-lignende desorption observeres, når dynamikken i de undersøgte obligationer er meget hurtigere end trækhastigheden af AFM cantilever spidsen (kvasi-ligevægt). Desorptionskræfter af plateaulignende kraftforlængelseskurver giver direkte adhæsionfrie energier ved at integrere kraftforlængelsessporet54. De er blevet anvendt til at bestemme elektrostatiske, dispersive og hydrofobe interaktioner samt friktionsegenskaber af enkelte polymerer på overflader i flydende miljø2,4,23,51,54,55.
Hvert plateau af konstant kraft var udstyret med en sigmoidal kurve til at bestemme desorption kraft og desorption længde, som derefter blev plottet i histogrammer. Histogrammerne var udstyret med en gaussisk til at udtrække den maksimale værdi og standardafvigelse. For at få et bedre overblik blev desorptionskraften og længdeværdierne vist sammen i et punktområde, som angivet i figur 5B og figur 5D.
For polystyren på SAM i vand svarer de bestemte desorptionskræfter til tidligere opnåede værdier19,23. Da desorptionslængden korrelerer med polymerkonturlængden51,kan fordelingen af desorptionslængden bruges som bevis for den kovalente binding af den respektive polymer til AFM-kantilspidsen via dens funktionelle slutgruppe. Således desorption længde fungerer som et fingeraftryk.
For mere end én polymer fastgjort til AFM cantilever spidsen, kaskader af plateauer (diskrete trin) kan observeres i kraft-forlængelse kurver56. Hvert plateau repræsenterer desorption af en polymer på en anden udvidelse. Forsøget i figur 5C og figur 5D viste et typisk tilfælde af to polymerer, der var fastgjort til AFM-kanstillspidsen på samme tid. Ved montering af det endelige brud kunne der findes en bimodal fordeling for desorptionslængden, mens desorptionskraften viste en smal fordeling. I dette tilfælde kunne den mindre desorptionslængde findes i 90% af kraftforlængelseskurverne, enten som et enkelt plateau eller som et ekstra plateau på det længere plateau, som angivet i figur 5C. Den højere desorptionslængde blev fundet i 37% af de opnåede kraftforlængelseskurver. Således desorption længde fordeling kunne bruges til at bestemme antallet af forskellige polymerer knyttet til AFM cantilever spidsen. Generelt er en smal fordeling af desorptionslængdeværdierne en god indikation af, at en og samme enkelt polymer blev undersøgt i de opnåede kraftforlængelseskurver. Samtidig kan en overposition af de respektive styrker-forlængelse bruges til at afgøre, om en og samme enkelt polymer er blevet målt.
Efter at have bevist kovalent binding af en enkelt PS polymer, kan yderligere forsøg med denne PS polymer udføres varierende substrat (fast overflade samt polymer film), opløsningsmiddel betingelser, temperatur, trække hastighed eller dvæle tid.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over tipfunktionaliseringsprocessen. Omfatter den kemiske modifikation af AFM cantilever spidsen efter (1) plasma aktivering (2) silanisering / PEGylation og (3) polymer vedhæftet fil. Desuden vises de detaljerede kemiske strukturer af de anvendte polymerer, nemlig PEG, PNiPAM og PS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Figur 2: Eliminering af interferens i kraftforlængelseskurver. (A) Find en kraft-forlængelse kurve viser en sinusformet kraft signal artefakt langs forlængelsen, men har ingen enkelt molekyle stretching begivenhed. (B) Vælg en kraft-forlængelse kurve med et enkelt molekyle begivenhed, som skal korrigeres fra sinusformet artefakt. (C) Overlejr kurverne for at kontrollere, om de sinusformede artefakter af kurverne virkelig passer. (D) Ved at trække kraftforlængelseskurven (A) fra (B) opnås en kraftforlængelseskurve med en lige baseline. Selvom vedhæftningstoppen ikke kan bruges til yderligere analyse, korrigeres kraftforlængelseskurven nu for artefakten, hvilket fører til langt mere nøjagtige kraftværdier i området af enkeltmolekylehændelsen (her: > 0,2 μm forlængelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Figur 3: Bestemmelse af masterkurver fra PEG's kraftforlængelseskurver ved 298 K. (A) Forsøgsdata ved 298 K ved hjælp af 7 kraftforlængelseskurver. Efter reskalering til en længde L0 ved en kraft på 500 pN (B) kan kraftforlængelseskurverne flettes og beregnes i gennemsnit ved binominel udjævning, der opnår en masterkurve (C). De nyskalerede kurver angives som prikker, mens masterkurven vises som en fast linje. Endelig kan de opnåede master kurver for forskellige temperaturer sammenlignes (D). Zoom-in angiver det område, hvor temperatureffekten på kraftforlængelsesadfærden er mest udtalt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Figur 4: Sammenligning af pNiPAM's og PEG's temperaturafhængige masterkurver. For PEG observeres en stigning i den nyskalerede forlængelse ved 100 pN (mellemkraftområde), når temperaturen øges (A), mens der for PNiPAM konstateres et modsat temperaturafhængigt skift (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Figur 5: Analyse af kraftforlængelseskurver af PS på SAM i vand. (A) Eksemplarisk kraft-forlængelse kurve (blå) med en sigmoidal pasform af plateauet (lilla). Derudover markerer pilene plateauets bestemte kraft (rød) og længde (grøn). Desorptionskraften og desorptionslængdeværdierne opnået ved sigmoidal-krampepasser vises i et scatter plot, og de resulterende histogrammer er udstyret med en gaussisk. (B) Den bestemte gennemsnitlige desorptionskraft og desorptionslængdeværdierne er (112 ± 6) pN og (659 ± 7) nm, hvor9 % af kraftforlængelseskurverne viser sådanne hændelser med et enkelt plateau. (C) Eksemplarisk kraftforlængelseskurve (blå) for to polymerer, der er fastgjort til AFM-kantilspidsen på samme tid. Her viser desorptionskraften en ikke-modal fordeling med en gennemsnitlig kraftværdi på (117 ± 5) pN, mens der kan findes en tomodal fordeling for desorptionslængden, der fører til gennemsnitlige længdeværdier på (656 ± 9) nm og (1050 ± 16) nm. (D) 90 % af de styrkeudvidelseskurver, der er udtaget prøver, viser kun enkeltplateauhændelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Kovalent fastgørelse af sondemolekyler til atomkraftmikroskopi (AFM) cantilever tips er en vigtig teknik til undersøgelse af deres fysiske egenskaber. Dette giver os mulighed for at bestemme stretching kraft, desorption kraft og længden af polymerer via AFM-baserede enkelt molekyle kraft spektroskopi med høj reproducerbarhed.

Kovalent fastgørelse af enkelte molekyler til AFM-baseret kraftspektroskopi

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Enkelt molekyle kraft spektroskopi gør det muligt for os at måle fysiske parametre, der beskriver de mekaniske og klæbende egenskaber af polymerer. Når du bruger AFM-baseret kraftspektroskopi til at studere enkelte molekyler, er det vigtigt at have en pålidelig og effektiv protokol til at binde disse molekyler kovalent til en AFM cantilever tip. Denne protokol kan vedtages til mange forskellige polymerer uanset konturlængde eller hydrofobiitet.Alle trin bør udføres i en røghætte for at undgå indånding af organiske dampe. Derudover er opløsningsmiddelresistent glas, laboratoriekittel og øjenbeskyttelse påkrævet. Første brug friskrensede pincet til at placere AFM cantilever chips i plasmakammeret.Start plasmakammeroverfladeaktiveringsprogrammet ved at vælge start og derefter ja. Kontroller, at plasmaprocessen fungerer korrekt. En plasmaproces med et højt iltindhold viser en lyseblå farve.Mens overfladen aktivering program udfører, opløse silan-PEG-mal i toluen at opnå en koncentration på 1.25 milligram per milliliter. Ansende tre milliliter af opløsningen i en flad petriskål. Når plasmaprocessen er færdig, skal plasmakammeret ventileres ved at vælge bekræft og derefter udluftning.Fortsæt straks til næste trin for at forhindre absorption af forurenende stoffer. Placer chips i Petriskålen og inkubere chips i tre timer ved 60 grader Celsius. Fjern petriskålen fra ovnen og lad den køle af i mindst 10 minutter.Skyl derefter spånerne. Ved BINDING AF PEG eller polystyren skylles spånerne med toluen tre gange. Ved binding af polynipam skal spåner skylles én gang med toluen og to gange med ethanol.For at reducere virkningen af kapillære kræfter på AFM cantilever, vippe chips lidt ved skylning. AFM cantilever chips skal skylles ordentligt for at fjerne eventuelle overskydende fysiske polymerer, som kan påvirke forsøget. Skylning skal udføres omhyggeligt for at undgå skader på AFM-kantilevers.Endelig forberede mindst to chips til at tjene som kontrol, som ikke vil gennemgå kovale polymer vedhæftet fil. For kontrol versus PEG og polystyren chips, skyl to gange med ethanol og én gang med vand. For kontrol versus polynipam chips, skyl to gange med vand.For at udføre kovalent fastgørelse af PEG eller polystyren, forberede tre milliliter polymer opløsning i toluen i en koncentration på 1,25 mg pr. milliliter. Tilsæt opløsningen og chips til en petriskål og inkuber chips ved 60 grader Celsius i en time. Efter inkubation med PEG eller polystyren skal spånerne køle af i 10 minutter.Skyl spånerne to gange med toluen, to gange med ethanol, og én gang med vand. For at udføre kovale fastgørelse af polynipam, forberede tre milliliter polymer opløsning i ethanol i en koncentration på 1,25 mg pr. milliliter. Tilsæt opløsningen og spånerne til en petriskål og inkuber spånerne ved stuetemperatur i tre timer.Efter inkubation med polynipam skylles spånerne to gange med ethanol og to gange med vand. For at opbevare spånerne, indtil de bruges i et eksperiment, skal hver chip placeres separat i en en milliliter petriskål fyldt med vand. Hold petriskåle på fire grader Celsius.Først skal du indsætte den funktionaliserede AFM cantilever chip i en spånholder. Lim den forberedte overflade ind i en prøveholder, der er egnet til målinger i væske. Brug en pipette til at nedsænke spånen i vand.Monter prøveoverfladen i AFM. Prøveoverfladen nedsænkes i vand. Tilslut chipholderen til AFM.Anstænt derefter chippen til prøveoverfladen. Brug miljøpanelet til at indstille måltemperaturen og skifte tilstanden og feedback-alternativknapperne til. Lad derefter systemet ligevægte i ca 15 minutter.Hvis du vil tage en kraftforlængelseskurve, skal du nærme dig AFM-tip'en til overfladen og vælge en enkelt kraft. Den resulterende kurve viser afbøjningen mod piezoafstanden med indflyvningen til overfladen vist med rødt og tilbagetrækningen vist med blåt. Udvid den del af kurven, der repræsenterer indrykningen af AFM-tip'en, ind i den underliggende overflade.Hvis du vil udføre en lineær tilpasning, skal du angive markører på enten indflyvningskurven eller trækkurven og vælge Opdater INVOLS i genvejsmenuen. Den resulterende værdi for den inverse optiske løftestangs følsomhedsværdi vises i panelet øverst til venstre. Når du har gentaget denne procedure mindst fem gange, skal du beregne et gennemsnit for omvendt optisk løftestangs følsomhed og indtaste gennemsnittet i panelet.Afm-cantilever placeres i en højde af ca. 100 mikrometer over overfladen ved at vælge flyt for at forkotre. For at få et tilfredsstillende signal-støj-forhold for det termiske støjspektrum skal du indstille gennemsnitstallet til mindst 10 og vælge den højest mulige frekvensopløsning. Dernæst registrerer det termiske støjspektrum ved at vælge opfange termiske data.For at passe det termiske støjspektrum med en simpel harmonisk oscillatorfunktion skal du udvide den del af kurven, der repræsenterer den første resonanstop. Vælg derefter initialiser pasform. Endelig skal du forfine pasformen ved hjælp af den termiske dataknap.Den respektive kraftkonstant vises i panelet. Hvis du vil begynde at indsamle dataene, skal du angive parametrene for eksperimentet. Indstil trække hastighed til et mikrometer per sekund og kraft udløse til en nanonewton.Indpasses af AFM-tipet til overfladen, og vælg en enkelt kraft for at registrere en enkelt kurve og afgøre, om parametrene skal justeres som beskrevet i manuskriptet. Vælg F-kort i masterpanelet. Hvis du vil have et kraftkort med 100 kurver, skal du indstille antallet af kraftpunkter og kraftlinjerne til 10.Begynd at optage kraftkortet ved at vælge gør F-kort. Tag kraft forlængelse kurver i et gitter-lignende måde for at undgå lokale overflade effekter og til gennemsnittet forskellige overfladearealer. Efter forsøget gentages bestemmelsen af den inverse optiske løftestangsfølsomhed og fjederkonstanten for at kontrollere systemets konsistens og stabilitet.Enkelt polynipam og PEG polymerer var kovalent bundet til en AFM cantilever spids i den ene ende og physisorbed på siliciumdioxid overflade i den anden ende. For at måle temperaturafhængig stretching adfærd, en klar enkelt-molekyle stretching begivenhed efterfulgt af et endeligt maksimum i slutningen af den respektive kraft forlængelse kurve blev identificeret. Så en enkelt master kurve blev genereret for hver temperatur.For PEG blev der observeret et fald i stretchingkraften med stigende temperatur. For polynipam blev den modsatte tendens observeret. Desorption af polystyren fra en SAM overflade i vand kan bruges til at bestemme desorption kraft og længde.Når polymertilbehøret var vellykket, viste kraftforlængelseskurverne plateauer af konstant kraft. Hvert plateau var udstyret med en sigmoidal kurve til at bestemme desorption kraft og desorption længde. De observerede desorptionskræfter svarede til tidligere opnåede værdier.Når mere end én polymer fastgjort til AFM cantilever spids, kaskader af plateauer blev observeret i kraft forlængelse kurver. Med to polymerer fastgjort, en bimodal fordeling blev fundet for desorption længde, mens desorption kraft viste en smal fordeling. En funktionaliseret AFM cantilever tip kan bruges til at kvantificere kraftrespons af enkelte molekyler i et flydende miljø og med eksterne stimuli.Brugen af rent udstyr, opløsningsmidler, AFM-cantilever-spidser og gentagen skylning er meget vigtig for at nå et højt niveau af renlighed, som bør bekræftes forud for de beskrevne kontrollerede forsøg. De præsenterede protokoller og procedurer banede vejen for en bedre forståelse af stimulerende polymersystemer. Resultaterne kan sammenlignes direkte med molekylære dynamiske simuleringer.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Mikrofluid On-chip Capture-cycloadditionsreaktion reversibelt Immobilisere små molekyler eller Multikomponenttekstilprodukter strukturer biosensoranvendelser

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent binding af BMP-2 på overflader med en selv-samlet monolag Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Aktivering Molecules, ioner, og faste partikler med Acoustic Kavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Indsigt i samspillet mellem aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Brug Single-Molecule force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektrokemiske impedans spektroskopi som et redskab for elektrokemisk sats konstant estimering

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Syntese af informationsbærende Peptoids og deres sekvens-instrueret Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

En Femtoliter dråbe array for massivt parallel proteinsyntese fra single DNA molekyler

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Selvsamling af hybridlipidmembraner dopede med hydrofobe organiske molekyler på Vand / Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomprøvesprængningsmikroskopi kombineret med infrarød spektroskopi som et værktøj til sonde enkelt bakteriekemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...