Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. en T.H. erkennen financiering door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse excellentiestrategie – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, en hu 997/1-13 (project # 420798410) toe te kennen. M.G. erkent gedeeltelijke steun in het kader van het LOEWE Project iNAPO door het ministerie van Hoger Onderwijs, Onderzoek en Kunsten hessen. Wij danken Dr Wolfgang Bronner en Dr. Agne Zukauskaite van Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF voor de donatie van hoogwaardige goudgecoate siliciumwafels.

OPMERKING: Zie figuur 1 voor een schematisch overzicht.
1. Reagent setup
OPMERKING: De polymeren die voor dit protocol worden gebruikt zijn: maleimide-polyethyleenglycol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), thiol-polyethyleenglycol-thiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol terminated poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) en thiol terminated polystyreen (PS-SH, 1.3 mDa).N
<ol><li>Bereid de goed gedefinieerde en hoge molaire massa PNiPAM-SH via atoom overdracht radicale polymerisatie, gevolgd door conversie en vermindering van de functionele eindgroep voor de invoering van een thiol moiety, zoals beschreven in de literatuur18. Zie figuur 1 voor de gedetailleerde structuren.</li>
	<li>Voor het opslaan van de chemicaliën, bereiden kleinere aliquots binnen een droog handschoenenkastje systeem met stikstof atmosfeer om blootstelling aan atmosferische zuurstof en vocht te voorkomen. PEG en PNiPAM zijn hygroscopische45,46 en de functionele eindgroepen peg, PNiPAM en PS staan erom bekend dat ze gemakkelijk geoxideerd worden wanneer ze worden opgeslagen onder omgevingscondities33,47,48. Alle chemicaliën moeten bij -20 °C worden opgeslagen.</li>
	<li>Gebruik oplosmiddelen van analytische kwaliteit of hoger. Bovendien, gebruik ultrazuiver water om AFM cantilevers chips en glaswerk te spoelen, omdat single molecule experimenten zijn zeer gevoelig voor alle verontreiniging.</li>
</ol>2. Uitrustingsopstelling
LET OP: Gebruik pincet en bekers gemaakt van roestvrij staal of glas. Gebruik omgekeerde pincet voor een veilige grip (bijvoorbeeld model R3 SA met een lage veerconstante).
<ol><li>Bereid RCA (ultrazuiver water, waterstofperoxide en ammoniak (5:1:1)) oplossing voor het reinigen van glaswerk en pincet.</li>
	<li>Doe de vaten in een beker en vul het met RCA tot glaswerk of pincet volledig bedekt zijn.</li>
	<li>Verwarm het bekerglas van stap 2,2 voor 1 uur bij 80 °C.</li>
	<li>Spoel de vaten vervolgens af met ultrazuiver water totdat er geen penetrante geur meer (minstens drie keer) kan worden vastgesteld.</li>
	<li>Droog glaswerk en pincet in een oven (120 °C).</li>
</ol>3. Tip functionalisatie
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een rookkap om inademing van organische dampen te voorkomen. Daarnaast zijn handschoenen, labcoat en oogbescherming vereist. Gebruik nitril- of latexhandschoenen voor elke stap om besmetting te voorkomen. Draag oplosmiddelbestendige handschoenen bij het gebruik van tolueen. Alle stappen, tenzij anders aangegeven, worden gedaan bij RT. Gebruik verse apparatuur en handschoenen voor elke stap om mogelijke kruisbesmetting te voorkomen.
<ol><li>Voer oppervlakteactivering uit door zuurstofplasma toe te passen op de AFM-cantilever chip MLCT-Bio-DC. OPMERKING: De efficiëntie van de plasmabehandeling voor verdere functionalisatiestappen schalen met de inhoud van zuurstof in de plasmakamer.<ol>
<li>Gebruik vers gereinigde pincet om AFM cantilever chips in een plasmakamer (40 kHz, 600 W) te plaatsen.</li>
		<li>Gebruik aangepast activeringsprogramma: evacuatie (0,1 mbar) – overstromingen met zuurstof tot een druk van: 0,2 mbar (4 min) – plasmaproces (vermogen: 40%, duur: 2 min, procesdruk: 0,2 mbar).</li>
		<li>Ventileer kamer en ga onmiddellijk verder met stap 3.2.2 om te voorkomen dat adsorptie van verontreinigingen aan AFM cantilever chips uit de lucht.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanization en PEGylation OPMERKING: Timing is een kritieke parameter tussen de stappen. Bereid oplossingen zo vers mogelijk voor tijdens de wachttijden. Maleimide groepen zijn onderworpen aan hydrolyse in waterige media en thiolen gemakkelijk geoxideerd tot disulfides in oplossing33,47 belemmeren AFM tip functionalisatie reacties.<ol>
<li>Bereid een silane-PEG-mal oplossing in tolueen (1,25 mg/mL) in oplosmiddelbestendig plastic of glazen buizen en giet 6 mL van de oplossing in platte petrischaaltjes, 3 mL per stuk. OPMERKING: Als binding van meerdere sondepolymeren wordt waargenomen in het SMFS-experiment, kan het mengen van silane-PEG-mal met niet-functionele silane-PEG het aantal ankerpunten verminderen. Voor de aanpassing van de passivation laag PEG met verschillende massa's (d.w.z. contourlengtes) kan worden gebruikt27.</li>
		<li>Incubeer de AFM cantilever chips onmiddellijk na stap 3.1.3 in de silane-PEG-mal oplossing (tot 10 chips per petrischaaltje) gedurende 3 uur bij 60 °C35.</li>
		<li>Haal petrischaaltjes uit de oven en laat de oplossing minstens 10 min afkoelen.</li>
		<li>Spoel elke AFM-cantilever chip zorgvuldig af. Verminder de impact van capillaire krachten op de AFM-cantilever bij het passeren van de luchtoplosmiddelinterface, bijvoorbeeld door deze chips iets te kantelen bij het onderdompelen in een oplossing.<ol>
<li>Spoel voor PEG- en PS-polymeren drie keer af met tolueen.</li>
			<li>Voor PNiPAM polymeer, spoel een keer met tolueen en twee keer met ethanol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kies ten minste twee AFM cantilever chips als controle AFM cantilever chips, overslaan stap 3.3 en spoel ze als volgt om de polariteit van het oplosmiddel te verhogen:<ol>
<li>Spoel voor PEG- en PS-polymeren twee keer af met ethanol en één keer met ultrazuiver water.</li>
			<li>Spoel voor PNiPAM polymeer twee keer af met ultrazuiver water. OPMERKING: Controle AFM cantilever chips hebben alle functionalisatiestappen doorlopen, behalve de polymeerbijlage (stap 3.3). Ze dienen om de netheid van het functionalisatieproces te bewijzen, het AFM-chiphoudersysteem, de oppervlakken en de oplosmiddelen die voor het SMFS-experiment worden gebruikt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Covalent polymeerbevestiging OPMERKING: Hoewel de AFM cantilever tip naar verwachting volledig bedekt met maleimide groepen, zijn er slechts een paar bindende sites voor de enkele sonde polymeer, omdat maleimide ondergaat hydrolyse in water leidt tot inactieve PEGs47. Deze inactieve PEGs fungeren als een passivation laag, zoals hierboven beschreven.<ol>
<li>Incubate AFM cantilever chips direct na stap 3.2.5 in een van de volgende polymeeroplossingen in 3 mL petrischaaltjes. Als het betreffende polymeer niet goed is opgelost, gebruik dan een waterbad van 40 °C en roer de oplossing goed door. OPMERKING: Aangezien het gebruik van thiol beëindigde polymeren kan leiden tot de vorming van disulfidebindingen die de reactie met de maleimidegroepen van silane-PEG-mal belemmeren, wordt een reducerend middel aanbevolen, met name wanneer stap 3.3 wordt toegepast in waterige buffers voor in water oplosbare polymeren33.<ol>
<li>Gebruik voor PEG- en PS-polymeren een concentratie van 1,25 mg/mL in tolueen gedurende 1 uur bij 60 °C.</li>
			<li>Gebruik voor PNiPAM polymeren een concentratie van 1,25 mg/mL in ethanol gedurende 3 uur bij RT. OPMERKING: Als in het SMFS-experiment binding van meerdere sondepolymeren wordt waargenomen, moet de concentratie van het polymeer worden verminderd.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spoel elke AFM-cantilever chip zorgvuldig af.<ol>
<li>Voor PEG- en PS-polymeren spoel je twee keer met tolueen, twee keer met ethanol en één keer met ultrazuiver water na 10 min afkoelen.</li>
			<li>Spoel voor PNiPAM polymeren twee keer af met ethanol en twee keer met ultrazuiver water.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bewaar elke AFM-cantilever chip apart in een kleine (1 mL) petrischaal gevuld met ultrazuiver water bij 4 °C tot gebruik in een experiment.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Oppervlaktevoorbereiding
<ol><li>Siliciumoxide wafer OPMERKING: Dit oppervlak werd gebruikt voor SMFS met PEG en PNiPAM.<ol>
<li>Snijd een siliciumoxide wafer in kleine stukjes met behulp van een diamantmes.</li>
		<li>Doe de siliciumoxidestukken apart in microcentrifugebuizen en vul deze buizen met ethanol.</li>
		<li>Sonicate de siliciumoxide stukken voor 10 min.</li>
		<li>Spoel de stukjes siliciumoxide twee keer af met ethanol en droog ze voorzichtig onder een stikstofstroom. Gebruik de siliconenoxidestukken onmiddellijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zelf geassembleerde monolayer van hydrofobe alkane thiol op goud (SAM) OPMERKING: Dit oppervlak werd gebruikt voor SMFS met PS. Zie literatuur39,49 voor meer informatie over SAMs.<ol>
<li>Gebruik een met goud beklede siliciumwafer (A [100], 5 nm titanium, 100 nm goud) om stappen 4.1.1 – 4.1.4 uit te voeren.</li>
		<li>Incubeer de oppervlaktestukken in een 1-dodecanthioloplossing (2 mM) gedurende 18 uur.</li>
		<li>Spoel de vers bereide SAMs twee maal in ethanol.</li>
		<li>Droge SAMs met stikstofstroom voor direct gebruik of bewaar ze in ethanol voor maximaal 4 dagen voor later gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gegevensverwerving
OPMERKING: Alle hier getoonde metingen werden uitgevoerd in ultrazuiver water met een Cypher ES AFM met behulp van een verwarmings- en koelmonsterfase voor temperatuurvariatie. Over het algemeen kunnen alle AFM's die de mogelijkheid bieden om te meten in vloeistoffen worden gebruikt.
<ol><li>Plaats de gefunctionaliseerde AFM-cantilever chip in de AFM.</li>
	<li>Lijm het geprepareerde oppervlak in een monsterhouder die geschikt is voor het meten in vloeistoffen (bijvoorbeeld Replicating Compound 101RF met hoge resolutie of een UV-geneesbare lijm). OPMERKING: Deze bindmiddelen zijn zeer inert en bestand tegen een groot aantal polaire oplosmiddelen. De weerstand van de lijm tegen niet-polaire oplosmiddelen (bijvoorbeeld tolueen of hexaan) of hoge temperaturen moet vóór gebruik worden gecontroleerd.</li>
	<li>Dompel de AFM cantilever chip en het sondemonster onder in de vloeistof, hier: ultrazuiver water. LET OP: Een oplosmiddeldruppel (ongeveer 100 μL) kan worden afgezet op de AFM-chiphouder. Het bedekken van de AFM-chip met oplosmiddel vermindert capillaire krachten, die anders zouden optreden op de AFM-cantilever bij het naderen van het monsteroppervlak dat door de luchtoplosmiddeleninterface gaat.</li>
	<li>Pas indien nodig de temperatuur aan en laat het systeem equilibrate. OPMERKING: Temperatuurveranderingen kunnen leiden tot een afbuiging van de AFM-cantilever als gevolg van een bimetalen effect voor AFM cantilevers met een reflecterende coating zoals aluminium of goud. Equilibratie moet worden uitgevoerd vanaf het oppervlak (meerdere μm) totdat er geen verdere verandering van het afbuigingssignaal wordt waargenomen (tot 15 min voor MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Varieer de temperatuur willekeurig om eventuele effecten van veroudering van de functionalisatie uit te sluiten. Zorg ervoor dat de toegepaste temperaturen niet leiden tot een onomkeerbare buiging van de AFM-cantilever. OPMERKING: Eventuele temperatuureffecten op oplosmiddeleigenschappen (zoals verdamping of veranderingen in viscositeit) kunnen uw experimenten belemmeren. In de gepresenteerde voorbeelden varieerde de temperatuur tot 40 K in stappen van 10 K met water als oplosmiddel (bijvoorbeeld van 278 K tot 318 K).</li>
	<li>Benader het oppervlak om de InvOLS (omgekeerde optische hendelgevoeligheid) te bepalen door kracht-extensiecurven te nemen op een hard oppervlak (zoals siliciumoxide). Neem hiervoor het afbuigingssignaal van de fotodetector (in V) vs piëzoafstand en bepaal de helling van het deel dat de inkeping van de AFM-cantilever tip in het onderliggende oppervlak (weerzinwekkend regime) met behulp van een lineaire functie. Om fouten te verminderen, neemt u het gemiddelde van ten minste vijf waarden om de uiteindelijke InvOLS-waarde te verkrijgen. Zie voor meer informatie de literatuur4,39. OPMERKING: De InvOLS kan alleen betrouwbaar worden bepaald op harde oppervlakken. In het geval van experimenten op zachte oppervlakken of interfaces zorg ervoor dat u een harde ondergrond dicht bij uw zachte oppervlakken plaatst. Vervolgens kan de InvOLS-kalibratie voor of na uw experimenten met zachte oppervlakken worden uitgevoerd zonder dat de AFM-installatie hoeft te worden gedemonteerd.</li>
	<li>Voor de constante bepaling van de lente, verplaats de AFM cantilever naar een hoogte met noch aantrekkelijke noch weerzinwekkende interacties tussen AFM cantilever tip en oppervlak (meerdere μm). Neem vervolgens een thermisch ruisspectrum op waar de macht spectrale dichtheid (PSD) vs frequentie wordt uitgezet. De volgende stappen worden meestal uitgevoerd door geautomatiseerde ingebouwde functies in commerciële AFM-software: ten eerste wordt het verworven thermische ruisspectrum geanalyseerd door een functie aan de PSD te plaatsen, bijvoorbeeld een eenvoudige harmonische oscillator (SHO). De pasvorm wordt gedaan tot het minimum tussen de eerste en tweede resonantie. Ten tweede wordt het gebied onder het ingerichte deel van het PSD vs-frequentieperceel bepaald, wat de gemiddelde vierkante verplaatsing van de AFM-cantilever in verticale richting vertegenwoordigt. Ten slotte wordt de stelling van de equipartition gebruikt om de AFM-cantilever kracht constante28,50te verkrijgen. OPMERKING: Er moet een passend frequentiebereik worden gebruikt dat de eerste resonantiepiek van de AFM-cantilever omvat. Om een bevredigende signaal-ruisverhouding te krijgen, moeten ten minste 10 PSD's worden verzameld met de hoogst mogelijke frequentieresolutie.</li>
	<li>Start het experiment. Record kracht kaarten door het nemen van kracht-extensie bochten in een raster-achtige manier (bijvoorbeeld 10 x 10 punten voor een oppervlakte van 20 x 20 μm2)om eventuele lokale oppervlakte-effecten (bijvoorbeeld onzuiverheden, dislocaties) en de gemiddelde verschillende oppervlaktes te voorkomen. OPMERKING: Typische parameters zijn een treksnelheid van 1 μm/s en een samplingrate van 5 kHz om voldoende resolutie te garanderen. De bemonsteringssnelheid moet worden aangepast wanneer de treksnelheid varieert. De intrekafstand moet worden aangepast aan de contour- of desorptielengte van het gemeten polymeer (ongeveer tweemaal de verwachte lengte).</li>
	<li>Gebruik en varieer de rusttijd naar het oppervlak om het enkele polymeer aan het oppervlak te laten hechten (meestal 0 – 5 s).</li>
	<li>Herhaal de bepaling van de InvOLS en de veerconstante aan het einde van het experiment om de consistentie en de stabiliteit van het systeem te controleren. OPMERKING: Voor een sterke hechting tussen polymeer en oppervlak kan de kalibratie worden uitgevoerd na het eigenlijke experiment om de functionalisatie te behouden.</li>
</ol>6. Evaluatie van gegevens
OPMERKING: Voor gegevensevaluatie is een op maat gemaakte software op basis van Igor Pro gebruikt voor het uitvoeren van de volgende stappen.
<ol><li>Zet het ruwe afbuigingssignaal (in Volt) in krachtwaarden (in Newtons) door vermenigvuldiging met opgenomen InvOLS en de bepaalde de lenteconstante om.</li>
	<li>Trek de afbuiging van de AFM cantilever (na vermenigvuldiging van het ruwe afbuigingssignaal met de InvOLS) af van de afstand die wordt aangedreven door de piëzo-elementen in verticale richting om de ware uitbreiding (tip-oppervlakteafstand) te verkrijgen4.</li>
	<li>Corrigeer de voor drift verkregen kracht-extensiecurven door een lineaire functie na de laatste gebeurtenis op de basislijn te plaatsen en hetzelfde af te trekken van de kracht-extensiecurve. Het gemonteerde deel moet een voldoende uitbreiding van het oppervlak vertegenwoordigen waar geen aantrekkelijke of weerzinwekkende interacties worden waargenomen tussen AFM cantilever tip en onderliggend oppervlak. Vervolgens wordt de basislijn ingesteld op de nulas. OPMERKING: In het geval van metingen op sterk reflecterende oppervlakken zoals goud kunnen storingen optreden. Deze vloeien voort uit gedeeltelijke reflectie van de laserstraal vanaf het oppervlak en vanaf de achterzijde van de AFM cantilever. Dus, de verkregen kracht-extensie bochten kunnen een sinusoïdale kracht signaal artefact langs de verticale extensie. Dit is een artefact dat de uiteindelijke krachtwaarden belemmert. Om nog rekening te houden met deze kracht-extensie curven, een correctie is mogelijk (figuur 2).</li>
	<li>Als de interferenties worden weergegeven in de kracht-extensie curven, selecteert u een representatieve kracht-extensie curve (intrekking curve) met geen andere gebeurtenissen dan eventueel een piek van niet-specifieke hechting en dezelfde sinusoïdale artefact (dat wil zeggen, amplitude en fase) (Figuur 2A). OPMERKING: Maak de representatieve kracht-extensiecurve glad om het lage frequentiepatroon van de storing te verkrijgen.</li>
	<li>Selecteer een kracht-extensie curve die moet worden gecorrigeerd(figuur 2B).</li>
	<li>Overlay beide kracht-extensie curven uit stappen 6.4. en 6,5. om ervoor te zorgen dat beide hetzelfde sinusoïdale artefact (d.w.z. amplitude en fase)(figuur 2C)vertonen.</li>
	<li>Trek de (gladgestreken) representatieve kracht-extensiecurve af van de kracht-extensiecurve die moet worden gecorrigeerd, wat leidt tot een rechte in plaats van een sinusoïdale basislijn (figuur 2D). OPMERKING: Zorg ervoor dat de niet-specifieke hechtingspiek van de representatieve curve zich onderscheidt van gebeurtenissen die in de curven worden weergegeven. In feite is de selectie van de representatieve curve van cruciaal belang voor een goede correctie.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerend financieel belang hebben.

AFM-gebaseerde SMFS is een van de belangrijkste instrumenten voor het onderzoeken van single molecule interacties in polymeer fysica. Voor een echt enkel molecuul experiment is covalente bevestiging van het sondepolymeer aan een AFM-cantilever tip essentieel.
Veel eerdere werken zijn gebaseerd op nanovisserij-experimenten, met name voor PNiPAM, waarbij polymeren op een oppervlak worden geadsorbeerd en vervolgens worden uitgerekt door ze willekeurig uit het substraat te plukken met behulp van een AFM-tip30,31. Dit kan de resultaten veranderen en leiden tot verkeerde interpretatie van het gedrag van één molecuul. Daar kunnen coöperatieve effecten de resultaten domineren omdat interacties met naburige polymeren niet kunnen worden uitgesloten. Dit heeft een grote impact op de resultaten, vooral voor polymeren die significant verschillend gedrag vertonen in bulk in vergelijking met enkele geïsoleerde moleculen57,58.
Het hier gepresenteerde functionalisatieprotocol is betrouwbaar en kan eenvoudig worden toegepast op verschillende polymeren, ongeacht hun contourlengte, hydrofoob of de steric hinder van de monomeren. Daarnaast wordt een passivation verstrekt om ongewenste interacties tussen het single probe polymeer en de AFM cantilever tip en tussen de AFM cantilever tip en het onderliggende oppervlak te voorkomen. Verder wordt de evaluatie van kracht-extensie curven weergegeven stretching gebeurtenissen getoond. Daar wordt een procedure voorgesteld voor de bepaling van de hoofdkrachtuitbreidingscurven. Dit biedt een betere manier om bijvoorbeeld temperatuurgerelateerde effecten op het kracht-extensiegedrag te onthullen. Bovendien wordt de analyse van single molecule desorptie gebeurtenissen met constante kracht plateaus. Ook wordt een eenvoudige manier gegeven om sinusoïdale krachtsignaalartefacten in kracht-extensiecurven te corrigeren die anders de resultaten van het experiment zouden kunnen schaden.
In vergelijking met Stetter et al.39wordt de hier gepresenteerde functionalisatieprocedure teruggebracht tot drie stappen in plaats van vier en wordt de robuustheid van de procedure verbeterd. Het grote voordeel van het uitvoeren van PEGylation en silanization in een stap is om een beter gecontroleerde reactie hebben en om de opbrengst te verhogen. Bovendien hoeven er minder oplossingen te worden voorbereid en zijn er minder spoelstappen nodig. Dit vermindert de inspanning en de tijd voor de voorbereiding en verhoogt de reproduceerbaarheid. Bovendien is het verplaatsen van AFM cantilevers altijd een cruciaal onderdeel van het functionalisatieproces. Een overdracht van de ene oplossing naar de andere loopt altijd het risico de functionaliteitskwaliteit sterk te beïnvloeden als gevolg van overdrachten via de lucht-waterinterface of het verliezen van AFM-cantilevers door oneigenlijk gebruik van pincet.
Om een goede covalente bevestiging van een enkel polymeer aan een AFM-cantilever tip te bewijzen, moet aan verschillende voorwaarden worden voldaan. Ten eerste, controle AFM cantilevers zijn van groot belang en moet worden voorbereid op elke functionalisatie. Het functionalisatieproces en de vloeistofcel voor het uitvoeren van de experimenten worden alleen als schoon beschouwd, als een klein aantal kracht-extensiecurven rek of plateaus in het controle-experiment tonen (in de gepresenteerde voorbeelden minder dan 2%).
Een duidelijk rekpatroon zonder verdere dalingen of maxima is essentieel voor het hebben van juiste enige molecule het uitrekken gebeurtenissen. Bovendien moet de afhankelijkheid van breukkracht op de krachtbelasting bij breuk of de volledige elastische respons van de rekcurve worden geanalyseerd om gelijktijdige desorptie van meerdere polymeren59,60uit te sluiten . Voor PEG en PNiPAM vertoonden respectievelijk 19% en 42% van de kracht-extensiecurven die op verschillende posities van het oppervlak werden ingenomen een dergelijk rekpatroon. Om rekgebeurtenissen te verkrijgen, moet de fysisorptie van het polymeer aan het respectieve onderliggende oppervlak sterk zijn. Anders wordt een plateau-achtige desorptie gebeurtenis waargenomen. Dit is nog beslissender voor de detectie van stretching gebeurtenissen bij hoge krachten (tot 500 pN of meer). Aangezien niet voor elke kracht-extensiecurve aan deze sterke fysisorptie wordt voldaan, is de opbrengst van dergelijke gebeurtenissen minder dan voor pure plateau-achtige desorptiegebeurtenissen. Als alternatief kunnen sterk vasthoudende groepen zoals catecholen of chemisorptie tussen polymeer en onderliggend oppervlak worden gebruikt. Dit vereist echter de invoering van verdere functionele groepen of koppelingslocaties op het polymeer61,62.
In feite biedt de massa (d.w.z. contourlengte) van het polymeer een waardevolle vingerafdruk. Hoewel de massa om de volgende redenen niet direct in de gemeten contourlengte kan worden vertaald, is de lengteverdeling zeer waardevol om gebeurtenissen met één molecuul te definiëren. In het geval van een PNiPAM polymeer met een lage polydispersitie(?= 1,28), vonden we aanzienlijke verschillen in de uitbreidingswaarden voor de verkregen stretching gebeurtenissen (en dus in de polymeerlengte) in de experimenten. Een van de redenen hiervoor zou de bepaling van de polymeerlengte en de verdeling ervan kunnen zijn. In de chromatografie (SEC) van grootteuitsluiting wordt een relatief gewicht van het doelpolymeer bepaald in vergelijking met normen als PS of poly (methylmethacrylaat) (PMMA)63. Het veronderstelde relatieve gewicht zal naar verwachting afwijken van het absolute molecuulgewicht, omdat de hydrodynamische straal van het doelpolymeer en de standaard aanzienlijk kunnen verschillen. Bovendien kan de silane laag worden oligomerized door vals water in tolueen tijdens het functionalisatieproces. De bevestiging van dergelijke oligomeren aan de AFM cantilever tip leidt tot een flexibelere laag met minder ankerpunten64. Ook kan het bevestigingspunt van het polymeer aan de siliciumlaag niet noodzakelijkerwijs aan de top zijn, wat leidt tot een verschuiving van de gedetecteerde lengtewaarden29. Hoewel een polymeermodel zoals de wormachtige keten (WLC) of het vrij verbonden ketenmodel (FJC) het respectieve kracht-extensiegedrag voor PEG of PNiPAM niet goed kan reproduceren over het gehele uitbreidingsbereik18,29,41,65,66, kan een dergelijk polymeermodel waardevol zijn voor andere polymere en eiwitsystemen10,15,67,68.
De covalente bevestiging van één PS-polymeer (met een contourlengte van meer dan 1 μm) wordt alleen als succesvol beschouwd, wanneer een aanzienlijk aantal kracht-extensiecurven een lang genoeg plateau van constante kracht vertonen (figuur 5). Een plateau dat voortvloeit uit het desoriseren van een enkel polymeer wordt gedefinieerd door een enkele scherpe daling van een constante kracht naar de basislijn bij een bepaalde uitbreiding, zoals vermeld in figuur 5A. Als er meer polymeren aan de AFM-cantilever-tip zijn bevestigd, wordt een cascade van plateaus waargenomen56 (figuur 5C). De plateaulengte (desorptielengte), correlerend met de polymeercontourlengte51, moet aanzienlijk langer zijn dan een hechtingspiek als gevolg van niet-specifieke hechting van de AFM-cantilevertip aan het onderliggende oppervlak (hier rond 200 nm). Functies die uitsluitend in één kracht-extensiecurve worden weergegeven, mogen niet worden geïnterpreteerd. In de gepresenteerde experimenten, ten minste 80 van de 100 bochten toonde een plateau langer dan 200 nm in ten minste twee kracht kaarten op twee verschillende plekken op het oppervlak. Bovendien blijkt uit de verdeling van dedesorptielengtes, met behulp van strooipercelen zoals gegeven in figuur 5B en 5D,of en hoeveel polymeren gebonden zijn aan de AFM-cantilevertip. In het geval van PS dienden een smalle verdeling van dedesorptiekracht en lengte van plateaus van de kracht-uitbreidingskrommen als bewijs van een succesvolle covalente bevestiging. Dit bleek uiteindelijk het succes van het functionalisatieprotocol. Daarom raden we ten zeerste aan om dergelijke kracht- en lengtedistributies in publicaties te presenteren.
Het evalueren van kracht-extensie curven met behulp van ingebouwde algoritmen die vele vooraf ingestelde parameters omvatten moet worden gedaan met zorg. Redenen zijn bijvoorbeeld dat een vaste bemonsteringssnelheid niet geschikt is voor elke toegepaste treksnelheid of dat een geautomatiseerde afvlaking van de kracht-extensiecurven belangrijke details kan bereiken. Gewoonlijk kan een behoorlijk begrip van de respectieve evaluatieprocedure fouten in de evaluatieprocedure verhinderen, die beurtelings de definitieve bevindingen van een op AFM-gebaseerd SMFS experiment sterk kunnen beïnvloeden.
Samengevat presenteren we een functionalisatieprotocol dat betrouwbaar is en gemakkelijk kan worden toegepast op een verscheidenheid aan polymeren. Bovendien wordt een goede evaluatie van de kracht-extensiecurven van één molecuul gepresenteerd, waardoor fysieke parameters zoals rekkracht, desorptiekracht en desorptielengte kunnen worden bepaald. De gepresenteerde protocollen en procedures zijn waardevol voor het onderzoek van stimuli-responsieve systemen op het niveau van één molecuul.

Sinds de uitvinding in de jaren 19801, de atoomkracht microscoop (AFM) is uitgegroeid tot een van de belangrijkste beeldvorming technieken in de natuurwetenschappen met sub-nanometer ruimtelijke resolutie, sub-piconewton kracht resolutie en de mogelijkheid van het meten in verschillende oplosmiddel en temperatuur voorwaarden2,3,4,5,6,7.
Afgezien van beeldvorming8,9, wordt de AFM gebruikt om enkelvoudige molecule krachtspectroscopie (SMFS) uit te voeren die inzicht geeft in lijminteracties tussen een enkel polymeer en oppervlakken, fysische eigenschappen van enkele polymeren en uitvouwmechanismen van eiwitten7,10,11,12,13,14,15,16. In een regulier SMFS-experiment wordt de gefunctionaliseerde cantilever tip in contact gebracht met een oppervlak, zodat het polymeer bij de AFM cantilever tip physisorbs aan dit oppervlak. Door de AFM-cantilever tip van het oppervlak in te trekken, wordt een verandering in de afbuiging van de AFM-cantilever omgezet in een kracht die leidt tot een kracht-extensie curve4. Fysische parameters zoals rekkracht, desorptiekracht en desorptielengte kunnen worden bepaald als afhankelijk van verschillende parameters zoals treksnelheid, stilstaande tijd aan het oppervlak, inkepingsdiepte in het oppervlak, temperatuur, oplosmiddel17,18 en verschillende oppervlakken zoals vaste substraten, polymeerfolies of ondersteunde lipidebilagen19,20,21,22. Bovendien kan een polymeer in verschillende ruimtelijke richtingen worden onderzocht, waardoor de wrijvingseigenschappen van het polymeer23,24,25,26worden onderzocht.
Een covalente bevestiging van het onderzochte polymeer aan een AFM cantilever tip is essentieel voor dergelijke studies. Zo voorkomt een hoge opbrengst van enkelmolecuulgebeurtenissen met één en hetzelfde polymeer gebonden aan een AFM-cantilevertip elke vooringenomenheid van de resultaten als gevolg van kalibratie van de veerconstante van de AFM cantilever27,28, verschillende bevestigingspunten29 of verschillende polymeren (met verschillende contourlengtes), zoals in het geval van nanovisexperimenten30,31,32. Ook interacties met andere polymeren en middeling effecten kunnen op grote schaal worden voorkomen18,28. Voor het covalente aanhechting van een polymeer aan de AFM cantilever tip kunnen verschillende soorten chemische modificaties worden toegepast, waarvan er vele zijn samengevat in het boek van Hermanson33. Amine en thiol-based linking reacties evenals klik chemie vertegenwoordigen de meest gebruikte methoden in AFM cantilever tip functionalisatie34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 laten zien hoe je 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS chemie gebruiken om een eiwit aan een AFM-cantilevertip te bevestigen. Echter, de genoemde functionele groepen hebben de neiging om crosslink, wat leidt tot een verlies van functionaliteit43,44. Ook carbodiimides tonen de neiging om snel hydrolyse in oplossing43. Maleimide en thiol groepen zijn over het algemeen stabieler en vertonen geen crosslinking reacties. Het gepresenteerde protocol is een optimalisatie van de eerder gepubliceerde protocollen in referenties35,39.
Hier wordt een betrouwbaar functionalisatieprotocol gepresenteerd dat gemakkelijk kan worden aangepast aan een groot aantal verschillende polymeren, ongeacht eigenschappen zoals contourlengte of hydrofoob. Er werden bijvoorbeeld drie verschillende polymeren gekozen: hydrofielpolyethyleenglycol (PEG) en poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) en hoge molaire massa hydrofoob polystyreen (PS).N Om te voorzien in een covalent bindingsvermogen met een passend linkermolecuul, werden de drie polymeren geselecteerd voor het kenmerken van een telechelische thiol moiety als functionele eindgroep. Het linkermolecuul zelf is meestal een kort PEG-polymeer met twee actieve sites, een silane-groep aan de ene kant en een maleimidegroep aan de andere kant. De eerste maakt een covalente gehechtheid aan de AFM cantilever tip en de laatste een bindende reactie met de thiol groep van de gefunctionaliseerde hoge molaire massa polymeer. Bovendien dienen inactieve PEG-linkermoleculen als passivation-laag om ongewenste interacties tussen het sondepolymeer en de AFM-cantilevertip en tussen de AFM-cantilevertip en het onderliggende oppervlak te voorkomen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-gebaseerde single molecule force spectroscopie is een ideaal hulpmiddel voor het onderzoeken van de interacties tussen een enkel polymeer en oppervlakken. Voor een echt enkel molecuulexperiment is covalente gehechtheid van het sondemolecuul essentieel, omdat alleen dan honderden sporen van kracht-extensie met één en hetzelfde molecuul kunnen worden verkregen. Veel sporen zijn op hun beurt nodig om te bewijzen dat een enkel molecuul alleen wordt onderzocht. Daarnaast is passivation cruciaal voor het voorkomen van ongewenste interacties tussen het enkele sondemolecuul en de AFM-cantilever tip en tussen de AFM cantilever tip en het onderliggende oppervlak. Het hier gepresenteerde functionalisatieprotocol is betrouwbaar en kan eenvoudig worden toegepast op een verscheidenheid aan polymeren. Karakteristieke enkele molecuulgebeurtenissen (d.w.z. rek en plateaus) worden gedetecteerd in de sporen van kracht-extensie. Uit deze gebeurtenissen kunnen fysieke parameters worden verkregen, zoals rekkracht, desorptiekracht en desorptielengte. Dit is vooral belangrijk voor het nauwkeurige onderzoek van stimuli-responsieve systemen op het niveau van één molecuul. Als voorbeeldige systemen worden poly(ethyleenglycol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) en polystyreen (PS) uitgerekt en gedesorbeerd van SiOx (voor PEG en PNiPAM) en van hydrofobe zelfgeassembleerde monolayer oppervlakken (voor PS) in waterige omgeving.N

De volgende voorbeelden tonen resultaten van enkele molecuul stretching en desorptie van de polymeren PEG, PNiPAM en PS. Alle AFM cantilever tips werden gefunctionaliseerd met het bovenstaande protocol. PEG en PNiPAM werden gemeten op SiOx met temperatuurvariatie. Voor een gedetailleerde bespreking van de resulterende temperatuur-afhankelijke stretching bochten voor PEG en PNiPAM, zie Kolberg et al.18 Een ander kracht-extensie motief is een plateau van constante kracht (bijvoorbeeld, wanneer desorbing PS van zelf gemonteerde monolagen van eindigde methylalkane thiols op goud (SAM) in water4,27,39,51).
Voorbeeld 1: Stretching van PEG en PNiPAM in water Het temperatuurafhankelijke rekgedrag in water werd gemeten met behulp van enkele PNiPAM- en PEG-polymeren die covalently gebonden zijn aan een AFM-cantilever-tip aan de ene kant en fysisorbed op een SiOx-oppervlak aan de andere kant. Na de kalibratie- en clean control-experimenten (minder dan 2% van de kracht-extensiecurven vertonen enkele molecuulgebeurtenissen), werden voor elke AFM-cantilever ten minste twee krachtkaarten geregistreerd. Het temperatuurafhankelijke experiment werd uitgevoerd door bij elke temperatuur ten minste één krachtkaart vast te maken. Toen slechts weinig stretching gebeurtenissen verschenen, werd de respectieve AFM cantilever weggegooid en de volgende AFM cantilever van de chip werd genomen (meestal in de volgorde C, B, D en E van MLCT-Bio-DC). Voor de voorbeeldige gegevens van PEG werd één enkele stretching-gebeurtenis waargenomen in 95 van de 500 gemeten kracht-extensiecurven (19%). Voor PNiPAM vertoonden 252 van de 600 krachtverlengingscurven een rekpatroon (42%). Voor een betere vergelijking van de kracht-extensie bochten, een enkele master curve voor elke temperatuur werd gegenereerd. Daartoe werden alleen gekozen voor krommen met een uitrekkende gebeurtenis tot ten minste 500 pN, waarbij conformatieschommelingen en oplosmiddeleffecten verwaarloosbaar zijn,52. Het uiteindelijke aantal trajecten dat in aanmerking werd genomen was 3 op 278 K, 7 op 298 K en 4 op 318 K voor PEG en 4 bij 278 K, 3 op 298 K en 3 op 318 K voor PNiPAM18.
De procedure voor het genereren van hoofdcurven is opgenomen in figuur 3. De gekozen krachtverlengingscurven (figuur 3A) worden opgeschaald tot een lengte L0 (uitbreiding met een kracht van 500 pN), zie figuur 3B. De hechtingspiek vertoont een grote variatie van niet-specifieke hechting tussen het oppervlak en de AFM-cantilevertip, maar heeft geen invloed op het polymeerrekgedrag. Na het samenvoegen van de opgeschaalde kracht-extensiecurven worden ze gemiddeld gekenmerkt door een binominale smoothing zoals gepresenteerd in figuur 3C. Hiervoor convolves een Gaussian-filter de gegevens met genormaliseerde coëfficiënten afkomstig van Pascal's driehoek op een niveau dat gelijk is aan de gladmakende parameter 2053. Ten slotte wordt voor elke temperatuur een hoofdcurve verkregen, zoals gegeven in figuur 3D. De zoom-in toont het bereik waar het temperatuureffect op het kracht-extensiegedrag het meest uitgesproken is.
Een vergelijking van het temperatuurgedrag van PEG (A) en PNiPAM (B) is te vinden in figuur 4. Voor PEG werd een afname van de rekkracht met stijgende temperatuur waargenomen. Een stijging van ongeveer 5% van de herschaalde uitbreiding bij 100 pN werd waargenomen bij het verhogen van de temperatuur van 278 naar 318 K. Voor PNiPAM zou een tegenovergestelde temperatuurafhankelijke verschuiving kunnen worden onthuld. Een daling van ongeveer 1% van de herschaalde uitbreiding bij 100 pN werd waargenomen toen de temperatuur werd verhoogd van 278 naar 328 K. Bovendien kon de rekvrije energie worden verkregen uit de kracht-extensie master curves door het bepalen van het gebied onder de curve voor een bepaalde krachtwaarde. Dit kan worden gebruikt voor het extraheren van energetische en entrope bijdragen van de stretching vrije energie met behulp van moleculaire dynamica (MD) simulaties18.
Voorbeeld 2: Desorptie van PS van een SAM-oppervlak in water De desorptie van PS van een SAM-oppervlak in water kan worden gebruikt om de desorptiekracht en lengte te bepalen en zo de hydrofobe interactie te kwantificeren. Na kalibratie werden ten minste twee krachtkaarten geregistreerd op twee verschillende plekken van het oppervlak. Toen de polymeerbevestiging succesvol was, vertoonden de kracht-uitbreidingskrommen plateaus van constante kracht, als kenmerkend kenmerk, figuur 5A en figuur 5C. Plateau-achtige desorptie wordt waargenomen wanneer de dynamiek van de gesondeerde obligaties veel sneller is dan de treksnelheid van de AFM cantilever tip (quasi-evenwicht). Desorptiekrachten van plateau-achtige kracht-uitbreiding krommen bieden direct hechtingvrije energieën door de integratie van de kracht-extensie spoor54. Ze zijn gebruikt om elektrostatische, dispersieve en hydrofobe interacties te bepalen, evenals wrijvingseigenschappen van afzonderlijke polymeren op oppervlakken in vloeibare omgeving2,4,23,51,54,55.
Elk plateau van constante kracht was uitgerust met een sigmoïdale curve om de desorptiekracht en desorptielengte te bepalen, die vervolgens in histogrammen werden uitgezet. De histogrammen werden uitgerust met een Gaussian om de maximale waarde en standaarddeviatie te extraheren. Voor een beter overzicht werden de desorptiekracht en lengtewaarden samen weergegeven in een spreidingsplot, zoals vermeld in figuur 5B en figuur 5D.
Voor polystyreen op SAM in water komen de vastberaden desorptiekrachten overeen met eerder verkregen waarden19,23. Aangezien de desorptielengte correleert met de polymeercontourlengte51, kan de desorptielengteverdeling worden gebruikt als bewijs van de covalente binding van het respectieve polymeer aan de AFM-cantilevertip via de functionele eindgroep. Zo dient de desorptielengte als vingerafdruk.
Voor meer dan één polymeer dat aan de AFM-cantilever-tip is bevestigd, kunnen cascades van plateaus (discrete stappen) worden waargenomen in de kracht-extensiecurven56. Elk plateau vertegenwoordigt de desorptie van een polymeer bij een andere uitbreiding. Het experiment in figuur 5C en figuur 5D toonde een typisch geval van twee polymeren die tegelijkertijd aan de AFM-cantilever-tip zijn bevestigd. Door de uiteindelijke breuk te monteren, kon een bimodale verdeling worden gevonden voor de desorptielengte, terwijl de desorptiekracht een smalle verdeling vertoonde. In dit geval kon de kleinere desorptielengte worden gevonden in 90% van de kracht-uitbreiding bochten, hetzij als een enkel plateau, hetzij als een extra plateau op het langere plateau, zoals vermeld in figuur 5C. De hogere desorptielengte werd gevonden in 37% van de verkregen kracht-uitbreidingkrommen. Zo kan de desorptielengteverdeling worden gebruikt om het aantal verschillende polymeren aan de AFM-cantilevertip te bepalen. In het algemeen is een smalle verdeling van de desorptielengtewaarden een goede aanwijzing dat één en hetzelfde polymeer in de verkregen kracht-extensiekrommen werden onderzocht. Tegelijkertijd kan een superpositie van de respectieve krachten-extensie worden gebruikt om te beslissen of één en hetzelfde polymeer is gemeten.
Na het bewijzen van covalente binding van een enkel PS-polymeer, kunnen verdere experimenten met dit PS-polymeer worden uitgevoerd met verschillende substraat (vaste oppervlakte en polymeerfilms), oplosmiddelcondities, temperatuur, treksnelheid of stilstaande tijd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van het tipfunctionalisatieproces. Omvat de chemische modificatie van de AFM cantilever tip na (1) plasma activering (2) silanization / PEGylation en (3) polymeer bevestiging. Daarnaast worden de gedetailleerde chemische structuren van de gebruikte polymeren getoond, namelijk PEG, PNiPAM en PS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Figuur 2: Eliminatie van storingen in kracht-uitbreiding bochten. (A) Zoek een kracht-extensie curve met een sinusoïdale kracht signaal artefact langs de extensie, maar met geen enkele molecuul stretching gebeurtenis. (B) Kies een kracht-extensie curve met een enkel molecuul gebeurtenis, die moet worden gecorrigeerd uit de sinusoïdale artefact. (C) Superimpose de bochten om te controleren of de sinusoïdale artefacten van de bochten echt overeenkomen. (D) Door de kracht-extensiecurve (A) vanb) af te trekken, wordt een kracht-extensiecurve met een rechte basislijn verkregen. Hoewel de hechtingspiek niet kan worden gebruikt voor verdere analyse, wordt de kracht-extensiecurve nu gecorrigeerd voor het artefact dat leidt tot veel nauwkeurigere krachtwaarden in de regio van de gebeurtenis met één molecuul (hier: > 0,2 μm extensie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Figuur 3: Bepaling van hoofdcurven van kracht-extensiecurven van PEG bij 298 K. (A) Experimentele gegevens bij 298 K, met behulp van 7 kracht-extensie curven. Na herschaling tot een lengte L0 met een kracht van 500 pN (B),kunnen de kracht-extensie curven worden samengevoegd en gemiddeld worden door binominale smoothing verkrijgen van een master curve (C). De geschaalde curven worden gegeven als stippen, terwijl de hoofdcurve wordt weergegeven als een vaste lijn. Ten slotte kunnen de verkregen mastercurves voor verschillende temperaturen worden vergeleken (D). De zoom-in geeft het bereik aan waar het temperatuureffect op het krachtextensiegedrag het meest uitgesproken is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Figuur 4: Vergelijking van de temperatuurafhankelijke hoofdcurven van PNiPAM en PEG. Voor PEG wordt een toename van de herschaalde uitbreiding bij 100 pN (mid-force range) waargenomen bij het verhogen van de temperatuur(A),terwijl voor PNiPAM een tegenovergestelde temperatuurafhankelijke verschuiving wordt onthuld(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Figuur 5: Analyse van kracht-uitbreiding bochten van PS op SAM in water. (A) Voorbeeldige kracht-extensie curve (blauw) met een sigmoidal fit van het plateau (paars). Bovendien markeren de pijlen de bepaalde kracht (rood) en lengte (groen) van het plateau. De desorptiekracht en desorptielengtewaarden verkregen door sigmoïdale pasvormen worden weergegeven in een verstrooiingsplot en de resulterende histogrammen zijn uitgerust met een Gaussian. (B) De vastgestelde gemiddelde desorptiekracht en desorptielengtewaarden zijn (112 ± 6) pN en (659 ± 7) nm, waarbij 93% van de krachtsuitbreidingscurven dergelijke enkelvoudige plateaugebeurtenissen vertonen. (C) Voorbeeldige kracht-extensie curve (blauw) voor twee polymeren bevestigd aan de AFM cantilever tip op hetzelfde moment. Hier vertoont de desorptiekracht een unimodale verdeling met een gemiddelde krachtwaarde van (117 ± 5) pN, terwijl een bimodale verdeling kan worden gevonden voor de desorptielengte die leidt tot gemiddelde lengtewaarden van (656 ± 9) nm en (1050 ± 16) nm. (D) 90% van de bemonsterde kracht-extensie curven tonen slechts enkele plateau gebeurtenissen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Single molecule force spectroscopie stelt ons in staat om fysieke parameters te meten die de mechanische en kleefeigenschappen van polymeren beschrijven. Bij het gebruik van afm-gebaseerde krachtspectroscopie om enkele moleculen te bestuderen, is het essentieel om een betrouwbaar en efficiënt protocol te hebben om deze moleculen covalent te binden aan een AFM cantilever tip. Dit protocol kan worden aangenomen om veel verschillende polymeren, ongeacht de contourlengte of hydrofobeiteit.Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een rookkap om inademing van organische dampen te voorkomen. Daarnaast zijn oplosmiddelbestendig glas, labcoat en oogbescherming vereist. Gebruik eerst vers gereinigde pincet om AFM cantilever chips in de plasmakamer te plaatsen.Start het plasmakameroppervlak activeringsprogramma door start te selecteren en dan ja. Controleer of het plasmaproces goed werkt. Een plasmaproces met een hoog zuurstofgehalte toont een lichtblauwe kleur.Terwijl het oppervlakteactiveringsprogramma wordt uitgevoerd, los silane-PEG-mal in tolueen op om een concentratie van 1.25 milligram per milliliter te verkrijgen. Plaats drie milliliter van de oplossing in een platte petrischaal. Nadat het plasmaproces is voltooid, ventileer de plasmakamer door bevestigen te selecteren en vervolgens te ontluchten.Ga onmiddellijk naar de volgende stap om absorptie van verontreinigingen te voorkomen. Plaats de chips in de petrischaal en broed de chips drie uur lang uit op 60 graden Celsius. Haal de petrischaal uit de oven en laat hem minstens 10 minuten afkoelen.Spoel vervolgens de chips. Voor PEG- of polystyreenbinding spoelt u de spanen drie keer met tolueen. Voor polynipambinding moeten chips eenmaal met tolueen en twee maal met ethanol worden gespoeld.Om de impact van capillaire krachten op de AFM cantilever te verminderen, kantel je de chips iets bij het spoelen. De AFM cantilever chips moeten goed worden gespoeld om eventuele overtollige fysieke polymeren die het experiment kunnen beïnvloeden te verwijderen. Spoelen moet zorgvuldig worden uitgevoerd om eventuele schade aan de AFM cantilevers te voorkomen.Ten slotte, bereid ten minste twee chips om te dienen als controles die niet zal ondergaan covalente polymeer bevestiging. Voor controles versus PEG- en polystyreenchips spoelt u twee maal met ethanol en één keer met water. Voor controles versus polynipamchips, spoel twee keer met water.Om covalente bevestiging van PEG of polystyreen uit te voeren, bereidt u drie milliliter polymeeroplossing in tolueen bij een concentratie van 1,25 milligram per milliliter. Voeg de oplossing en de chips toe aan een petrischaaltje en broed de chips een uur lang uit op 60 graden Celsius. Na incubatie met PEG of polystyreen laat u de chips 10 minuten afkoelen.Spoel de chips twee keer met tolueen, twee keer met ethanol, en een keer met water. Om covalente bevestiging van polynipam uit te voeren, bereidt u drie milliliter polymeeroplossing in ethanol voor met een concentratie van 1,25 milligram per milliliter. Voeg de oplossing en de chips toe aan een petrischaaltje en broed de chips drie uur lang op kamertemperatuur uit.Na incubatie met polynipam, spoel de chips twee keer met ethanol en twee maal met water. Om de chips op te slaan tot het gebruik in een experiment, plaats elke chip afzonderlijk in een een milliliter petrischaal gevuld met water. Hou de petrischaaltjes op vier graden Celsius.Plaats eerst de gefunctionaliseerde AFM cantilever chip in een chiphouder. Lijm het voorbereide oppervlak in een monsterhouder die geschikt is voor metingen in vloeistof. Gebruik een pipet om de chip onder te dompelen in water.Monteer het monsteroppervlak in de AFM. Dompel het monsteroppervlak onder in water. Sluit de chiphouder aan op de AFM.Nader vervolgens de chip naar het monsteroppervlak. Gebruik het omgevingspaneel om de doeltemperatuur in te stellen en schakel de modus en de feedback-radioknoppen aan. Laat het systeem vervolgens ongeveer 15 minuten in evenwicht zijn.Om een krachtuitbreidingscurve te nemen, benader je de AFM cantilever tip naar het oppervlak en selecteer je single force. De resulterende curve geeft de afbuiging tegen de piëzoafstand weer met de benadering van het in het rood weergegeven oppervlak en de in het blauw weergegeven intrekking. Vouw het gedeelte van de curve dat de inkeping van de AFM cantilever tip vertegenwoordigt in het onderliggende oppervlak.Als u een lineaire pasvorm wilt uitvoeren, stelt u cursors in op de nadering of de intrekcurve en selecteert u INVOLS bijwerken in het contextmenu. De resulterende waarde voor de inverse gevoeligheidswaarde voor optische hendel wordt weergegeven in het paneel linksboven. Bereken na het herhalen van deze procedure ten minste vijf keer een gemiddelde voor de gevoeligheid van de inverse optische hendel en voer het gemiddelde in het paneel in.Plaats de AFM cantilever op een hoogte van ongeveer 100 micrometer boven het oppervlak door te selecteren bewegen om vooraf in te schakelen. Om een bevredigende signaal-ruisverhouding voor het thermische ruisspectrum te krijgen, stelt u het gemiddelde aantal gemiddelden in op ten minste 10 en kiest u de hoogst mogelijke frequentieresolutie. Vervolgens registreert u het thermische ruisspectrum door het vastleggen van thermische gegevens te selecteren.Om het thermische ruisspectrum te passen met een eenvoudige harmonische oscillatorfunctie, vouwt u het gedeelte van de curve uit dat de eerste resonantiepiek vertegenwoordigt. Selecteer vervolgens de fit initialiseren. Tot slot, verfijnen van de pasvorm met behulp van de fit thermische data knop.De respectievelijke krachtconstante verschijnt in het paneel. Stel de parameters voor het experiment in om te beginnen met het verzamelen van de gegevens. Stel treksnelheid in op één micrometer per seconde en krachttrekker tot één nanonewton.Benader de AFM cantilever tip naar het oppervlak en selecteer enkele kracht om een enkele curve op te nemen en te bepalen of de parameters moeten worden aangepast zoals beschreven in het manuscript. Selecteer F-kaart in het hoofdpaneel. Om een krachtkaart met 100 curven te verkrijgen, stelt u het aantal krachtpunten en krachtlijnen in op 10.Begin met het opnemen van de force map door te selecteren doe F-kaart. Neem kracht uitbreiding bochten in een grid-achtige manier om eventuele lokale oppervlakte-effecten te voorkomen en om de gemiddelde verschillende oppervlakte. Herhaal na het experiment de bepaling van de inverse optische hendelgevoeligheid en de veerconstante om de consistentie en de stabiliteit van het systeem te controleren.Enkele polynipam en PEG polymeren waren covalently gebonden aan een AFM cantilever tip aan de ene kant en fysisorbed op het siliciumdioxide oppervlak aan de andere kant. Om temperatuurafhankelijk rekgedrag te meten, werd een duidelijke single-molecule stretching gebeurtenis geïdentificeerd gevolgd door een laatste maximum aan het einde van de respectievelijke krachtextensiecurve. Vervolgens werd voor elke temperatuur één mastercurve gegenereerd.Voor PEG werd een afname van de rekkracht waargenomen bij toenemende temperatuur. Voor polynipam werd de tegenovergestelde trend waargenomen. De desorptie van polystyreen uit een SAM-oppervlak in water kan worden gebruikt om de desorptiekracht en -lengte te bepalen.Toen de polymeerbevestiging succesvol was, toonden de krachtuitbreidingscurven plateaus van constante kracht. Elk plateau was uitgerust met een sigmoïdale curve om de desorptiekracht en desorptielengte te bepalen. De waargenomen desorptiekrachten beantwoordden aan eerder verkregen waarden.Wanneer meer dan één polymeer aan de AFM cantileverpunt werd bevestigd, werden cascades van plateaus waargenomen in de krachtuitbreidingscurven. Met twee polymeren bevestigd, werd een bimodale distributie gevonden voor de desorptielengte terwijl de desorptiekracht een smalle distributie toonde. Een gefunctionaliseerde AFM cantilever tip kan worden gebruikt om de krachtrespons van enkele moleculen in een vloeibare omgeving en met externe stimuli te kwantificeren.Het gebruik van schone apparatuur, oplosmiddelen, AFM cantilever tips, en herhaalde spoeling is zeer belangrijk om een hoog niveau van reinheid die moet worden bevestigd voorafgaand aan de beschreven gecontroleerde experimenten te bereiken. De gepresenteerde protocollen en procedures maakten de weg vrij voor een beter begrip van responsieve polymeersystemen. De resultaten kunnen direct worden vergeleken met moleculaire dynamische simulaties.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Activerende moleculen, ionen, en Vaste deeltjes met akoestische cavitatie

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektrochemische impedantie spectroscopie als een instrument voor elektrochemische Rate Constant schatting

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Self-Assembly van hybride lipid membranen doped met hydrofobe organische moleculen op de Water / Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...