Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
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B.N.B. et T.H. reconnaissent le financement de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande de la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC-2193/1 - 390951807, gefàrdert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der L’nder - EXC-2193/1 - 390951807, et subvention HU 997/1-13 (projet 420798410). M.G. reconnaît le soutien partiel dans le cadre du projet LOEWE iNAPO par le ministère de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et des Arts de l’État de Hessen. Nous remercions le Dr Wolfgang Bronner et le Dr Agne Zukauskaite de l’Institut Fraunhofer pour la physique appliquée de l’État solide IAF pour le don de gaufrettes de silicium enduit d’or de haute qualité.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent.

Le SMFS basé sur l’AFM est l’un des principaux outils pour étudier les interactions à une seule molécule dans la physique des polymères. Pour une véritable expérience à molécule unique, l’attachement covalent du polymère de la sonde à une pointe de porte-à-faux AFM est essentiel.
Beaucoup d’œuvres précédentes sont basées sur des expériences de nanopêche, en particulier pour PNiPAM, où les polymères sont adsorbés sur une surface, puis étirés en les cueillant au hasard à partir du substrat à l’aide d’un tip en porte-à-faux AFM30,31. Cela pourrait modifier les résultats et conduire à une mauvaise interprétation du comportement de la molécule unique. Là, les effets coopératifs pourraient dominer les résultats parce que les interactions avec les polymères voisins ne peuvent pas être exclues. Cela a un impact important sur les résultats, en particulier pour les polymères qui montrent un comportement significativement différent en vrac par rapport aux molécules isoléessimples 57,58.
Le protocole de fonctionnalisation présenté ici est fiable et peut être facilement appliqué à différents polymères, indépendamment de leur longueur de contour, hydrophobicity ou l’obstacle stérique des monomers. En outre, une passivation est fournie pour prévenir les interactions indésirables entre le polymère de sonde unique et la pointe de porte-à-faux AFM ainsi qu’entre la pointe de porte-à-faux AFM et la surface sous-jacente. En outre, l’évaluation des courbes d’extension de force montrant des événements d’étirement est montrée. Là, une procédure est proposée pour la détermination des courbes de force-extension. Cela offre un meilleur moyen de révéler, par exemple, les effets liés à la température sur le comportement d’extension de la force. En outre, l’analyse des événements de désorption d’une seule molécule comportant des plateaux de force constante est fournie. En outre, un moyen simple de corriger les artefacts de signal de force sinusoïdale dans les courbes de force-extension est donné qui pourrait autrement altérer les résultats de l’expérience.
Par rapport à Stetter et al.39, la procédure de fonctionnalisation présentée ici est réduite à trois étapes au lieu de quatre et la robustesse de la procédure est améliorée. L’avantage majeur de l’exécution de PEGylation et de silanization en une seule étape est d’avoir une réaction mieux contrôlée et d’augmenter le rendement. En outre, moins de solutions doivent être préparées et moins d’étapes de rinçage sont nécessaires. Cela réduit l’effort et le temps de préparation et augmente la reproductibilité. En outre, le déplacement des cantilevers AFM est toujours une partie essentielle du processus de fonctionnalisation. Un transfert d’une solution à l’autre risque toujours d’influencer fortement la qualité de la fonctionnalisation en raison des transferts par l’interface air-eau ou de la perte de porte-à-faux AFM par une mauvaise utilisation de pincettes.
Afin de prouver l’attachement covalent approprié d’un seul polymère à un cantilever AFM pointe différentes conditions doivent être remplies. Tout d’abord, les porte-à-faux de contrôle de l’AFM sont d’une importance significative et doivent être préparés à chaque fonctionnalisation. Le processus de fonctionnalisation et la cellule liquide pour effectuer les expériences ne sont considérés comme propres, que si un petit nombre de courbes d’extension de force montrent des étirements ou des plateaux dans l’expérience de contrôle (dans les exemples présentés de moins de 2%).
Un modèle d’étirement clair sans d’autres gouttes ou maxima est essentiel pour avoir des événements d’étirement de molécule unique approprié. En outre, la dépendance de la force de rupture sur le taux de chargement de la force à la rupture ou la réponse élastique complète de la courbe d’étirement doit être analysée afin d’exclure la désorption simultanée de polymères multiples59,60. Pour PEG et PNiPAM, 19 % et 42 % des courbes d’extension de force prises à différentes positions de la surface présentaient un tel schéma d’étirement, respectivement. Afin d’obtenir des événements d’étirement, la physisorption du polymère à la surface sous-jacente respective doit être forte. Sinon, un événement de desorption de plateau-comme est observé. Ceci est encore plus décisif pour la détection d’étirements à haute force (jusqu’à 500 pN ou plus). Comme cette forte physisorption n’est pas satisfaite pour chaque courbe d’extension de force, le rendement de tels événements est inférieur aux événements purs de desorption de plateau-comme. Comme alternative, des groupes fortement adhérants tels que des catéchols ou la chimioption entre le polymère et la surface sous-jacente peuvent être utilisés. Toutefois, cela nécessite l’introduction d’autres groupes fonctionnels ou des sites d’accouplement au polymère61,62.
En fait, la masse (c.-à-d. la longueur du contour) du polymère fournit une empreinte précieuse. Bien que la masse ne puisse pas être traduite directement dans la longueur mesurée du contour pour les raisons suivantes, la distribution de longueur est très précieuse pour définir les événements à molécule unique. Dans le cas d’un polymère PNiPAMƉ avec une faible polydispersité (1,28), nous avons trouvé des différences significatives dans les valeurs d’extension pour les événements d’étirement obtenus (et donc dans la longueur du polymère) dans les expériences. L’une des raisons en est la détermination de la longueur du polymère et de sa distribution. Dans la chromatographie de taille-exclusion (SEC), un poids relatif du polymère cible est déterminé par rapport à des normes comme PS ou poly (méthacrylate méthylique) (PMMA)63. On s’attend à ce que le poids relatif présumé s’écarte du poids moléculaire absolu parce que le rayon hydrodynamique du polymère cible et de la norme peut différer considérablement. En outre, la couche de silane peut être oligométisée par de l’eau fallacieuse dans le toluène pendant le processus de fonctionnalisation. L’attachement de ces oligomers à la pointe de porte-à-faux AFM conduit à une couche plus flexible avec moins de points d’ancrage64. En outre, le point d’attachement du polymère à la couche de silicium pourrait ne pas nécessairement être au sommet conduisant à un déplacement des valeurs de longueur détectées29. Alors qu’un modèle de polymère comme la chaîne vermifuge (WLC) ou le modèle de chaîne librement joint (FJC) ne peut pas reproduire le comportement d’extension de force respectif pour PEG ou PNiPAM correctement sur toute la gamme d’extension18,29,41,65,66, un tel modèle de polymère pourrait être précieux pour d’autres systèmes polymères et protéinés10,15,67,68.
L’attachement covalent d’un seul polymère PS (d’une longueur de contour de plus de 1 m) n’est considéré comme un succès que lorsqu’un nombre considérable de courbes d’extension de force montrent un plateau assez long de force constante(figure 5). Un plateau résultant du désorbage d’un seul polymère est défini par une seule chute brutale d’une force constante à la ligne de base à une certaine extension, comme le donne la figure 5A. Si plus de polymères sont attachés à la pointe de porte-à-faux de l’AFM, une cascade de plateaux est observée56 (figure 5C). La longueur du plateau (longueur de desorption), corrélante avec la longueur de contour de polymère51, doit être significativement plus longue que n’importe quel pic d’adhérence dû à l’adhérence non spécifique de la pointe de porte-à-faux d’AFM à la surface sous-jacente (ici autour de 200 nm). Les caractéristiques apparaissant uniquement dans une courbe d’extension de force unique, ne doivent pas être interprétées. Dans les expériences présentées, au moins 80 courbes sur 100 ont montré un plateau de plus de 200 nm dans au moins deux cartes de force à deux endroits différents sur la surface. En outre, la distribution des longueurs de desorption, à l’aide de parcelles de dispersion telles que donnée dans la figure 5B et 5D, révèlent si et combien de polymères sont liés à la pointe de porte-à-faux AFM. Dans le cas du PS, une distribution étroite de la force et de la longueur de desorption provenant des plateaux des courbes d’extension de la force a servi de preuve d’un attachement covalent réussi. Cela a finalement prouvé le succès du protocole de fonctionnalisation. Ainsi, nous recommandons fortement de présenter de telles distributions de force et de longueur dans les publications.
L’évaluation des courbes d’extension de force à l’aide d’algorithmes intégrés qui comprennent de nombreux paramètres prédésé doit être effectuée avec soin. Les raisons sont par exemple qu’un taux d’échantillonnage fixe n’est pas approprié pour chaque vitesse de traction appliquée ou qu’un lissage automatisé des courbes d’extension de force pourrait en moyenne des détails importants. Habituellement, une bonne compréhension de la procédure d’évaluation respective peut prévenir les erreurs dans la procédure d’évaluation, ce qui peut à son tour influencer fortement les résultats finaux d’une expérience SMFS basée sur l’AFM.
En résumé, nous présentons un protocole de fonctionnalisation qui est fiable et peut être facilement appliqué à une variété de polymères. En outre, une évaluation appropriée des courbes d’extension de force d’une molécule est présentée, permettant la détermination des paramètres physiques tels que la force d’étirement, la force de désorption et la longueur de desorption. Les protocoles et procédures présentés sont précieux pour l’étude des systèmes sensibles aux stimuli au niveau de la molécule unique.

Depuis son invention dans les années 19801, le microscope à force atomique (AFM) est devenu l’une des techniques d’imagerie les plus importantes en sciences naturelles avec une résolution spatiale sous-nanométrique, la résolution des forces sous-piconewton et la possibilité de mesurer dans diverses conditions de solvant et de température2,3,4,5,6,7.
Outre l’imagerie8,9, AFM est utilisé pour effectuer la spectroscopie de force de molécule unique (SMFS) donnant un aperçu des interactions adhésives entre un seul polymère et les surfaces, les propriétés physiques des polymères simples et les mécanismes de déploiement des protéines7,10,11,12,13,14,15,16. Dans une expérience SMFS régulière, la pointe de porte-à-faux fonctionnalisée est mise en contact avec une surface de sorte que le polymère à l’AFM cantilever pointe physisorbs à cette surface. En rétractant la pointe de porte-à-faux AFM de la surface, un changement dans la déviation du porte-à-faux AFM est converti en une force menant à une courbe d’extension de force4. Les paramètres physiques tels que la force d’étirement, la force de désorption et la longueur de desorption peuvent être déterminés comme dépendants de différents paramètres tels que la vitesse de traction, le temps d’habiter à la surface, la profondeur d’indentation dans la surface, la température, le solvant17,18 et différentes surfaces comme les substrats solides, les films de polymère ou les bilayers lipidiques soutenus19,20,21,22. En outre, un polymère peut être sondé dans différentes directions spatiales, étudiant ainsi les propriétés de frottement du polymère23,24,25,26.
Une attachement covalente du polymère étudié à une pointe de porte-à-faux d’AFM est essentielle pour de telles études. Ainsi, un rendement élevé des événements à molécule unique avec un seul et même polymère lié à une pointe de porte-à-faux AFM empêche tout biais des résultats en raison de l’étalonnage de la constante printanière de l’AFM cantilever27,28, différents points d’attachement29 ou des polymères variables (avec des longueurs de contours différentes) comme dans le cas des expériences de nanopêche30,31,32. En outre, les interactions avec d’autres polymères ainsi que la moyenne des effets peuvent être largementévitées 18,28. Pour l’attachement covalent d’un polymère à la pointe de porte-à-faux AFM, différents types de modifications chimiques peuvent être appliqués, dont beaucoup sont résumés dans le livre par Hermanson33. Les réactions de liaison à base d’Amine et de thiol ainsi que la chimie des clics représentent les méthodes les plus couramment utilisées dans la fonctionnalisation de pointe de porte-à-faux AFM34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et coll.40 montrent comment utiliser la chimie 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS chimie pour attacher une protéine à une pointe de porte-à-faux AFM. Cependant, lesdits groupes fonctionnels ont tendance à lien croisé, conduisant ainsi à une perte de fonctionnalité43,44. En outre, les carbodiimides montrent une tendance à l’hydrolyse rapide dans la solution43. Les groupes de maleimide et de thiol sont généralement plus stables et ne montrent pas de réactions transversales. Le protocole présenté est une optimisation des protocoles précédemment publiés donnés dans les références35,39.
Ici, un protocole de fonctionnalisation fiable est présenté qui peut être facilement ajusté à un grand nombre de polymères différents, indépendamment des propriétés telles que la longueur de contour ou l’hydrophobicité. Trois polymères différents ont été choisis à titre d’exemple : le polyéthylène glycol hydrophile (PEG) et le poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) ainsi que le polystyrène hydrophobe de masse de masse de haute molaire (PS). Afin de fournir une capacité de liaison covalente avec une molécule appropriée de liaison, les trois polymères ont été choisis pour comportant une moiety de thiol téléchellique comme groupe final fonctionnel. La molécule de liaison elle-même est généralement un polymère PEG court avec deux sites actifs, un groupe de silane à une extrémité et un groupe de maleimide à l’autre extrémité. Le premier permet un attachement covalent à la pointe de porte-à-faux de l’AFM et le second une réaction contraignante avec le groupe de thiol du polymère de masse de haute molaire fonctionnalisé. En outre, les molécules inactives de liaison PEG servent de couche de passivation pour empêcher les interactions indésirables entre le polymère de sonde et la pointe de porte-à-faux d’AFM aussi bien qu’entre la pointe de porte-à-faux d’AFM et la surface sous-jacente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

La spectroscopie à molécule unique à base de force de force de force de force de force de force de force de force de force de force de force de force atomique (AFM) est un outil idéal pour étudier les interactions entre un seul polymère et des surfaces. Pour une véritable expérience de molécule unique, l’attachement covalent de la molécule de sonde est essentiel parce que ce n’est qu’alors que des centaines de traces d’extension de force avec une seule molécule unique peuvent être obtenues. De nombreuses traces sont à leur tour nécessaires pour prouver qu’une seule molécule est sondée. En outre, la passivation est cruciale pour prévenir les interactions indésirables entre la molécule de sonde unique et la pointe de porte-à-faux AFM ainsi qu’entre la pointe de porte-à-faux AFM et la surface sous-jacente. Le protocole de fonctionnalisation présenté ici est fiable et peut facilement être appliqué à une variété de polymères. Des événements caractéristiques à molécule unique (c.-à-d. des étirements et des plateaux) sont détectés dans les traces d’extension de la force. À partir de ces événements, des paramètres physiques tels que la force d’étirement, la force de désorption et la longueur de desorption peuvent être obtenus. Ceci est particulièrement important pour l’étude précise des systèmes sensibles aux stimuli au niveau de la molécule unique. Comme les systèmes exemplaires poly (éthylène glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) et polystyrène (PS) sont étirés et désorbés de SiOx (pour PEG et PNiPAM) et de surfaces monoolayers auto-assemblés hydrophobes (pour PS) dans un environnement aqueux.

Les exemples suivants montrent les résultats de l’étirement et de la désorption des polymères PEG, PNiPAM et PS. Tous les conseils en porte-à-faux AFM ont été fonctionnalisés avec le protocole donné ci-dessus. PEG et PNiPAM ont été mesurés sur SiOx avec variation de température. Pour une discussion détaillée des courbes d’étirement dépendantes de la température qui en résultent pour PEG et PNiPAM, voir Kolberg et coll.18 Un motif d’extension de force différent est un plateau de force constante (p. ex., lorsque le PS désorbe des monolayers auto-assemblés de méthyle terminé alkane thiols sur l’or (SAM) dans l’eau4,27,39,51).
Exemple 1 : Étirement de PEG et PNiPAM dans l’eau Le comportement d’étirement dépendant de la température dans l’eau a été mesuré à l’aide de polymères PNiPAM et PEG uniques covalentement liés à une pointe de porte-à-faux AFM à une extrémité et physisorbed sur une surface siOx à l’autre extrémité. Après les expériences d’étalonnage et de contrôle propre (moins de 2 % des courbes d’extension de la force montrent des événements à molécule unique), au moins deux cartes de force ont été enregistrées pour chaque porte-à-faux AFM. L’expérience dépendante de la température a été réalisée en enregistrant au moins une carte de force à chaque température. Lorsque seulement peu d’événements d’étirement sont apparus, le porte-à-faux AFM respectif a été jeté et le prochain porte-à-faux AFM de la puce a été prise (généralement dans l’ordre C, B, D et E de MLCT-Bio-DC). Pour les données exemplaires de PEG, un seul événement d’étirement a été observé dans 95 des 500 courbes mesurées d’extension de force (19 %). Pour le PNiPAM, 252 courbes d’extension de force sur 600 ont montré un schéma d’étirement (42 %). Pour une meilleure comparaison des courbes d’extension de force, une courbe de maître unique pour chaque température a été générée. À cette fin, seules les courbes avec un événement d’étirement à au moins 500 pN, où les fluctuations conformationnelles et les effets de solvant sont négligeables, ont été choisis52. Le nombre final d’étirements pris en compte était de 3 à 278 K, 7 à 298 K et 4 à 318 K pour PEG et 4 à 278 K, 3 à 298 K et 3 à 318 K pour PNiPAM18.
La procédure de génération de courbes maîtresses est donnée dans la figure 3. Les courbes d’extension de force choisies(figure 3A) sont redimensionnelles à une longueur L0 (extension à une force de 500 pN), voir la figure 3B. Le pic d’adhérence montre une grande variation de l’adhérence non spécifique entre la surface et la pointe de porte-à-faux AFM, mais n’influence pas le comportement d’étirement du polymère. Après avoir fusionné les courbes redimensionnalées d’extension de force, elles sont moyennes par un lissage binominal tel que présenté dans la figure 3C. Pour cela, un filtre gaussien convove les données avec des coefficients normalisés dérivés du triangle de Pascal à un niveau égal au paramètre de lissage 2053. Enfin, une courbe principale est obtenue pour chaque température donnée dans la figure 3D. Le zoom-in montre la plage où l’effet de température sur le comportement de force-extension est le plus prononcé.
Une comparaison du comportement de température de PEG (A) et PNiPAM (B) peut être trouvée dans la figure 4. Pour PEG, on a observé une diminution de la force d’étirement avec une température croissante. Une augmentation d’environ 5 % de l’extension redimensionné à 100 pN a été observée lors de l’augmentation de la température de 278 à 318 K. Pour le PNiPAM, un changement opposé dépendant de la température pourrait être révélé. Une diminution d’environ 1 % de l’extension redimensionnée à 100 pN a été observée lorsque la température est passée de 278 à 328 K. En outre, l’énergie sans étirement pouvait être obtenue à partir des courbes du maître d’extension de la force en déterminant la zone sous la courbe pour une valeur de force donnée. Cela pourrait être utilisé pour extraire les contributions énergétiques et entropiques de l’énergie libre d’étirement à l’aide de la dynamique moléculaire (MD) simulations18.
Exemple 2 : Désorption de PS à partir d’une surface SAM dans l’eau La désorption de PS d’une surface SAM dans l’eau pourrait être employée pour déterminer la force et la longueur de desorption et ainsi quantifier l’interaction hydrophobe. Après l’étalonnage, au moins deux cartes de force ont été enregistrées à deux endroits différents de la surface. Lorsque l’attachement des polymères a été couronné de succès, les courbes d’extension de la force montraient des plateaux de force constante, comme caractéristique, voir la figure 5A et la figure 5C. La désorption en ce qui a sur le plateau est observée lorsque la dynamique des liaisons sondées est beaucoup plus rapide que le taux de traction de la pointe en porte-à-faux AFM (quasi-équilibre). Les forces de désorption des courbes de force-extension de plateau fournissent directement des énergies libres d’adhérence en intégrant la trace de force-extension54. Ils ont été utilisés pour déterminer les interactions électrostatiques, dispersives et hydrophobes ainsi que les propriétés de friction des polymères simples sur les surfaces dans l’environnement liquide2,4,23,51,54,55.
Chaque plateau de force constante a été équipé d’une courbe sigmoidale pour déterminer la force de désorption et la longueur de desorption, qui ont ensuite été tracées dans histogrammes. Les histogrammes ont été équipés d’un Gaussien pour extraire la valeur maximale et l’écart standard. Pour une meilleure vue d’ensemble, la force de désorption et les valeurs de longueur ont été affichées ensemble dans une parcelle de dispersion, comme indiqué dans la figure 5B et la figure 5D.
Pour le polystyrène sur SAM dans l’eau, les forces de désorption déterminées correspondent à des valeurs précédemment obtenues19,23. Comme la longueur de desorption est corrélée avec la longueur de contour de polymère51, la distribution de longueur de desorption peut être utilisée comme preuve de la liaison covalente du polymère respectif à la pointe de porte-à-faux D’AFM via son groupe final fonctionnel. Ainsi, la longueur de desorption sert d’empreinte digitale.
Pour plus d’un polymère attaché à la pointe de porte-à-faux AFM, des cascades de plateaux (étapes discrètes) peuvent être observées dans les courbes d’extension de force56. Chaque plateau représente le desorption d’un polymère à une extension différente. L’expérience donnée dans la figure 5C et la figure 5D a montré un cas typique de deux polymères attachés à la pointe de porte-à-faux de l’AFM en même temps. En adaptant la rupture finale, une distribution bimodale pouvait être trouvée pour la longueur de desorption, tandis que la force de desorption a montré une distribution étroite. Dans ce cas, la plus petite longueur de desorption pourrait être trouvée dans 90% des courbes d’extension de force, soit comme un plateau unique ou comme un plateau supplémentaire sur le plateau plus long, tel que donné dans la figure 5C. La longueur de désorption plus élevée a été trouvée dans 37% des courbes de force-extension obtenues. Ainsi, la distribution de longueur de desorption pourrait être utilisée pour déterminer le nombre de différents polymères attachés à la pointe de porte-à-faux D’AFM. En général, une distribution étroite des valeurs de longueur de desorption est une bonne indication qu’un seul polymère a été sondé dans les courbes d’extension de force obtenues. Dans le même temps, une superposition des forces respectives-extension peut être utilisée pour décider si un et même polymère unique a été mesuré.
Après s’être avéré la liaison covalente d’un seul polymère PS, d’autres expériences avec ce polymère PS peuvent être effectuées substrat variable (surface solide ainsi que des films de polymère), conditions de solvants, température, vitesse de traction ou temps de séjour.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Figure 1 : Aperçu schématique du processus de fonctionnalisation des pourboires. Inclut la modification chimique de la pointe de porte-à-faux d’AFM après (1) activation plasmatique (2) silanization/PEGylation et (3) l’attachement de polymère. En outre, les structures chimiques détaillées des polymères utilisés, à savoir PEG, PNiPAM et PS sont montrées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Figure 2 : Élimination des interférences dans les courbes d’extension de la force. (A) Trouver une courbe d’extension de force montrant un artefact de signal de force sinusoïdale le long de l’extension mais n’ayant pas d’événement d’étirement de molécule unique. (B) Choisissez une courbe d’extension de force avec un seul événement de molécule, qui doit être corrigée à partir de l’artefact sinusoïdale. (C) Superposer les courbes pour contrôler si les artefacts sinusoïdales des courbes correspondent vraiment. (D) En soustrayant la courbe d’extension de force (A) à partir de (B) une courbe d’extension de force avec une ligne de base droite est obtenue. Bien que le pic d’adhérence ne puisse pas être utilisé pour une analyse plus approfondie, la courbe d’extension de la force est maintenant corrigée pour l’artefact menant à des valeurs de force beaucoup plus précises dans la région de l’événement de molécule unique (ici: 'gt; 0.2 'm d’extension). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Figure 3 : Détermination des courbes de maître des courbes d’extension de force de PEG à 298 K. (A) Données expérimentales à 298 K, à l’aide de 7 courbes d’extension de force. Après redimensionnement à une longueur L0 à une force de 500 pN (B), les courbes d’extension de force peuvent être fusionnées et moyennes par lissage binominal obtenant une courbe de maître (C). Les courbes redimensionné sont données comme points tandis que la courbe de maître est montrée comme une ligne solide. Enfin, les courbes maîtresses obtenues pour différentes températures peuvent être comparées (D). Le zoom-in indique la plage où l’effet de température sur le comportement de force-extension est le plus prononcé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Figure 4 : Comparaison des courbes de maître dépendantes de la température du PNiPAM et du PEG. Pour PEG, on observe une augmentation de l’extension redimensionnalée à 100 pN (gamme de milieu de force) lors de l’augmentation de la température(A),tandis que pour le PNiPAM, un changement opposé dépendant de la température est révélé(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Figure 5 : Analyse des courbes d’extension de force du PS sur le SAM dans l’eau. (A) Courbe exemplaire d’extension de force (bleu) avec un ajustement sigmoïdale du plateau (violet). En outre, les flèches marquent la force déterminée (rouge) et la longueur (verte) du plateau. La force de désorption et les valeurs de longueur de desorption obtenues par des ajustements sigmoidal sont affichées dans une parcelle de dispersion et les histogrammes qui en résultent sont équipés d’un Gaussien. (B) Les valeurs moyennes déterminées de la force de desorption et de la longueur desorption sont (112 à 6) pN et (659 à 7) nm, où 93 % des courbes d’extension de force montrent de tels événements de plateau unique. (C) Courbe exemplaire d’extension de force (bleu) pour deux polymères attachés à la pointe de porte-à-faux AFM en même temps. Ici, la force de desorption montre une distribution unimodale avec une valeur de force moyenne de (117 à 5) pN, tandis qu’une distribution bimodale peut être trouvée pour la longueur de desorption menant à des valeurs moyennes de longueur de (656 - 9) nm et (1050 - 16) nm. (D) 90% des courbes échantillonnées de force-extension ne montrent que des événements de plateau unique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

L’attachement covalent des molécules de sonde aux pointes de porte-à-faux de force atomique (AFM) est une technique essentielle pour l’étude de leurs propriétés physiques. Cela nous permet de déterminer la force d’étirement, la force de désorption et la longueur des polymères via la spectroscopie de force à molécule unique à base d’AFM avec une reproductibilité élevée.

Attachement covalent de molécules uniques pour la spectroscopie de force basée sur l’AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

La spectroscopie à force d’une molécule unique nous permet de mesurer les paramètres physiques qui décrivent les propriétés mécaniques et adhésives des polymères. Lors de l’utilisation de la spectroscopie de force basée sur l’AFM pour étudier des molécules simples, il est essentiel d’avoir un protocole fiable et efficace pour lier ces molécules de façon covalente à une pointe en porte-à-faux AFM. Ce protocole peut être adopté pour de nombreux polymères différents indépendamment de la longueur du contour ou de l’hydrophobicité.Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de fumée pour éviter l’inhalation de vapeurs organiques. En outre, le verre résistant aux solvants, le manteau de laboratoire et la protection oculaire sont nécessaires. Utilisez d’abord des pinces fraîchement nettoyées pour placer les copeaux de porte-à-faux AFM dans la chambre plasmatique.Démarrez le programme d’activation de surface de chambre à plasma en sélectionnant le début et puis oui. Vérifiez que le processus plasmatique fonctionne correctement. Un processus plasmatique à haute teneur en oxygène montre une couleur bleu clair.Pendant que le programme d’activation de surface est en cours d’exécution, dissoudre silane-PEG-mal en toluène pour obtenir une concentration de 1,25 milligramme par millilitre. Placer trois millilitres de la solution dans une boîte de Pétri plate. Une fois le processus plasmatique terminé, ventiler la chambre plasmatique en sélectionnant confirmer puis évacuer.Passez immédiatement à l’étape suivante afin d’éviter l’absorption des contaminants. Placez les croustilles dans la boîte de Pétri et incubez les croustilles pendant trois heures à 60 degrés Celsius. Retirer la boîte de Pétri du four et laisser refroidir pendant au moins 10 minutes.Ensuite, rincez les copeaux. Pour la fixation PEG ou polystyrène, rincer les copeaux avec du toluène trois fois. Pour la reliure en polynipam, les copeaux doivent être rincés une fois avec du toluène et deux fois avec de l’éthanol.Pour réduire l’impact des forces capillaires sur le porte-à-faux AFM, inclinez légèrement les copeaux lors du rinçage. Les puces en porte-à-faux AFM doivent être rincées correctement pour éliminer tout excès de polymères physiques qui pourrait influencer l’expérience. Le rinçage doit être effectué avec soin afin d’éviter tout dommage aux cantilevers de l’AFM.Enfin, préparez au moins deux copeaux pour servir de commandes qui ne subiront pas d’attachement au polymère covalent. Pour les commandes par rapport aux copeaux de PEG et de polystyrène, rincer deux fois à l’éthanol et une fois à l’eau. Pour les commandes par rapport aux copeaux de polynipam, rincer deux fois à l’eau.Pour effectuer l’attachement covalent de PEG ou de polystyrène, préparez trois millilitres de solution polymère en toluène à une concentration de 1,25 milligramme par millilitre. Ajouter la solution et les croustilles dans une boîte de Pétri et incuber les croustilles à 60 degrés Celsius pendant une heure. Après incubation avec peg ou polystyrène, laisser refroidir les copeaux pendant 10 minutes.Rincer les copeaux deux fois avec du toluène, deux fois avec de l’éthanol et une fois avec de l’eau. Pour effectuer l’attachement covalent du polynipam, préparez trois millilitres de solution de polymère dans l’éthanol à une concentration de 1,25 milligramme par millilitre. Ajouter la solution et les croustilles dans une boîte de Pétri et incuber les croustilles à température ambiante pendant trois heures.Après incubation avec du polynipam, rincer les copeaux deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec de l’eau. Pour conserver les copeaux jusqu’à utilisation dans une expérience, placez chaque puce séparément dans une boîte petri d’un millilitre remplie d’eau. Gardez les boîtes de Pétri à quatre degrés Celsius.Tout d’abord, insérez la puce en porte-à-faux AFM fonctionnalisée dans un porte-puce. Collez la surface préparée dans un support d’échantillon qui convient aux mesures dans le liquide. Utilisez une pipette pour plonger la puce dans l’eau.Montez la surface de l’échantillon dans l’AFM. Immerger la surface de l’échantillon dans l’eau. Connectez le porte-puce à l’AFM.Approchez ensuite la puce à la surface de l’échantillon. Utilisez le panneau environnemental pour régler la température cible et allumer le mode et les boutons de la radio de rétroaction. Ensuite, laissez le système équilibrer pendant environ 15 minutes.Pour prendre une courbe d’extension de force, approchez la pointe en porte-à-faux AFM vers la surface et sélectionnez une seule force. La courbe résultante affiche la déviation contre la distance piezo avec l’approche de la surface indiquée en rouge et la rétractation indiquée en bleu. Étendre la partie de la courbe qui représente l’indentation de la pointe en porte-à-faux AFM dans la surface sous-jacente.Pour effectuer un ajustement linéaire, définissez des curseurs sur l’approche ou la courbe de rétractation et sélectionnez la mise à jour INVOLS du menu contexte. La valeur résultante de la valeur de sensibilité inverse du levier optique apparaît dans le panneau en haut à gauche. Après avoir répété cette procédure au moins cinq fois, calculer une moyenne pour la sensibilité inverse du levier optique et entrer la moyenne dans le panneau.Placez le porte-à-faux AFM à une hauteur d’environ 100 micromètres au-dessus de la surface en sélectionnant le passage au préengager. Pour obtenir un rapport signal-bruit satisfaisant pour le spectre du bruit thermique, réglez le nombre moyen à au moins 10 et choisissez la résolution de fréquence la plus élevée possible. Ensuite, enregistrez le spectre du bruit thermique en sélectionnant les données thermiques de capture.Pour s’adapter au spectre du bruit thermique avec une fonction d’oscillateur harmonique simple, élargissez la partie de la courbe représentant le premier pic de résonance. Sélectionnez ensuite paraize ajustement. Enfin, affiner l’ajustement en utilisant le bouton de données thermiques ajustement.La constante de force respective apparaîtra dans le panneau. Pour commencer à collecter les données, définissez les paramètres de l’expérience. Réglez la vitesse de traction à un micromètre par seconde et forcez la gâchette à un nanonewton.Approchez la pointe en porte-à-faux de l’AFM jusqu’à la surface et sélectionnez une seule force pour enregistrer une seule courbe et déterminer si les paramètres doivent être ajustés comme décrit dans le manuscrit. Sélectionnez la carte F du panneau principal. Pour obtenir une carte de force avec 100 courbes, réglez le nombre de points de force et de lignes de force à 10.Commencez à enregistrer la carte de force en sélectionnant la carte do F. Prenez les courbes d’extension de force d’une manière de grille-comme pour éviter tous les effets de surface locaux et pour la moyenne différentes zones de surface. Après l’expérience, répétez la détermination de la sensibilité inverse du levier optique et de la constante printanière pour vérifier la cohérence et la stabilité du système.Les polymères polynipam et PEG simples étaient liés de façon covalente à une pointe en porte-à-faux AFM à une extrémité et physéorbés à la surface du dioxyde de silicium à l’autre extrémité. Pour mesurer le comportement d’étirement dépendant de la température, un événement d’étirement simple molécule clair suivi d’un maximum final à la fin de la courbe d’extension de force respective a été identifié. Ensuite, une seule courbe principale a été générée pour chaque température.Pour peg, une diminution de la force d’étirement a été observée avec l’augmentation de la température. Pour le polynipam, la tendance inverse a été observée. La désorption du polystyrène à partir d’une surface SAM dans l’eau peut être utilisée pour déterminer la force et la longueur de désorption.Lorsque l’attachement au polymère a été couronné de succès, les courbes d’extension de force ont montré des plateaux de force constante. Chaque plateau a été équipé d’une courbe sigmoïde pour déterminer la force de désorption et la longueur de désorption. Les forces de désorption observées correspondaient aux valeurs précédemment obtenues.Lorsque plus d’un polymère attaché à la pointe en porte-à-faux de l’AFM, des cascades de plateaux ont été observées dans les courbes d’extension de force. Avec deux polymères attachés, une distribution bimodale a été trouvée pour la longueur de désorption tandis que la force de désorption a montré une distribution étroite. Une pointe en porte-à-faux AFM fonctionnalisée peut être utilisée pour quantifier la réponse de force de molécules simples dans un environnement liquide et avec des stimuli externes.L’utilisation d’équipement propre, de solvants, de bouts en porte-à-faux AFM et de rinçage répété est très importante pour atteindre un niveau élevé de propreté qui devrait être confirmé avant les expériences contrôlées décrites. Les protocoles et procédures présentés ont ouvert la voie à une meilleure compréhension des systèmes polymères sensibles aux stimuli. Les résultats peuvent être directement comparés aux simulations dynamiques moléculaires.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Recherche

Chimie

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Liaison covalente de BMP-2 sur les surfaces en utilisant une approche monocouche auto-assemblée

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Préparation de nanoparticules de silice Grâce assistée par micro-ondes acide catalyse

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Activation de molécules, des ions et des particules solides avec cavitation acoustique

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Regards sur les interactions des acides aminés et Peptides avec matériaux inorganiques à l&#39;aide d&#39;une seule molécule de travail Spectroscopy

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Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Spectroscopie d’impédance électrochimique comme outil d’Estimation constante taux électrochimique

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Synthèse de Peptoïdes porteurs d’informations et de leur auto-assemblage dynamique covalent dirigé par séquence

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Auto-assemblage de membranes lipidiques hybrides dopées de molécules organiques hydrophobes à l’interface eau/air

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

La microscopie à force atomique combinée à la spectroscopie infrarouge comme outil pour sonder la chimie d’une seule bactérie

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