Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. und T.H. Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807 und Stipendium HU 997/1-13 (Projekt Nr. 420798410). M.G. erkennt die teilweise Unterstützung im Rahmen des LOEWE-Projekts iNAPO durch das hessische Staatsministerium für Bildung, Forschung und Kunst an. Wir danken Dr. Wolfgang Bronner und Dr. Agne Zukauskaite vom Fraunhofer-Institut für Angewandte Festkörperphysik IAF für die Spende hochwertiger goldbeschichteter Siliziumwafer.

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für eine schematische Übersicht.
1. Reagenzien-Setup
ANMERKUNG: Die für dieses Protokoll verwendeten Polymere sind: Maleimid-Polyethylenglycol-Triethoxysilan (Silan-PEG-mal, 5 kDa), Thiol-Polyethylenglycol-Thiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), Thiol-beendetes Poly(N-Isopropylacrylamid) (PNiPAM-SH, 637 kDa) und Thiol-terminiertes Polystyrol (PS-SH, 1,3 mDa).N
<ol><li>Bereiten Sie die klar definierte und hohe Molmasse PNiPAM-SH über Atomtransfer-Radikalpolymerisation vor, gefolgt von Umwandlung und Reduktion der funktionellen Endgruppe für die Einführung eines Thiol-Moietys, wie in der Literatur18beschrieben. Die detaillierten Strukturen finden Sie in Abbildung 1.</li>
	<li>Für die Lagerung der Chemikalien, bereiten kleinere Aliquots in einem trockenen Handschuhsystem mit Stickstoffatmosphäre, um die Exposition gegenüber Luftsauerstoff und Feuchtigkeit zu vermeiden. PEG und PNiPAM sind hygroskopische45,46 und die funktionellen Endgruppen von PEG, PNiPAM und PS sind dafür bekannt, leicht oxidiert zu werden, wenn sie unter Umgebungsbedingungen gespeichert werden33,47,48. Alle Chemikalien müssen bei -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie analytische Lösungsmittel oder höher. Verwenden Sie außerdem ultrareines Wasser, um AFM-Auslegerchips und Glaswaren zu spülen, da Einzelmolekülexperimente sehr empfindlich auf jede Kontamination reagieren.</li>
</ol>2. Ausrüstungsaufbau
HINWEIS: Verwenden Sie Pinzette und Becher aus Edelstahl oder Glas. Verwenden Sie eine invertierte Pinzette für einen sicheren Griff (z. B. Modell R3 SA mit einer niedrigen Federkonstante).
<ol><li>Bereiten Sie RCA (Ultrareinstwasser, Wasserstoffperoxid und Ammoniak (5:1:1)) Lösung vor, um Glaswaren und Pinzette zu reinigen.</li>
	<li>Legen Sie die Gefäße in einen Becher und füllen Sie sie mit RCA, bis Glaswaren oder Pinzette vollständig abgedeckt sind.</li>
	<li>Becher ab Schritt 2.2 für 1 h bei 80 °C erhitzen.</li>
	<li>Spülen Sie die Gefäße anschließend mit reinem Reinstwasser, bis kein stechender Geruch mehr feststellbar ist (mindestens dreimal).</li>
	<li>Trockenglas und Pinzette im Ofen (120 °C).</li>
</ol>3. Tip-Funktionalisierung
HINWEIS: Alle Schritte sollten in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden, um das Einatmen organischer Dämpfe zu vermeiden. Zusätzlich sind Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz erforderlich. Verwenden Sie Nitril- oder Latexhandschuhe für jeden Schritt, um Eine Kontamination zu vermeiden. Tragen Sie bei Verwendung von Toluin lösungsmittelbeständige Handschuhe. Alle Schritte, sofern nicht anders angegeben, werden bei RT durchgeführt. Verwenden Sie frische Ausrüstung und Handschuhe für jeden Schritt, um eine mögliche Kreuzkontamination zu vermeiden.
<ol><li>Führen Sie die Oberflächenaktivierung durch Auftragen von Sauerstoffplasma auf den AFM-Auslegerchip MLCT-Bio-DC. HINWEIS: Die Effizienz der Plasmabehandlung für weitere Funktionalisierungsschritte skaliert mit dem Sauerstoffgehalt in der Plasmakammer.<ol>
<li>Verwenden Sie frisch gereinigte Pinzette, um AFM Auslegerchips in eine Plasmakammer (40 kHz, 600 W) zu legen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein kundenspezifisches Aktivierungsprogramm: Evakuierung (0,1 mbar) – Sauerstoffüberflutung auf einen Druck von: 0,2 mbar (4 min) – Plasmaprozess (Leistung: 40%, Dauer: 2 min, Prozessdruck: 0,2 mbar).</li>
		<li>Belüften Sie die Kammer und fahren Sie sofort mit Schritt 3.2.2 fort, um eine Adsorption von Verunreinigungen an AFM Auslegerchips aus der Luft zu verhindern.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanisierung und PEGylation HINWEIS: Timing ist ein kritischer Parameter zwischen den Schritten. Bereiten Sie Lösungen so frisch wie möglich während der Wartezeiten vor. Maleimidgruppen unterliegen einer Hydrolyse in wässrigen Medien und Thiole werden leicht zu Disulfiden in Lösung33,47 behindernden AFM-Spitzenfunktionalisierungsreaktionen oxidiert.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Silan-PEG-mal Lösung in Toluin (1,25 mg/ml) in lösungsmittelbeständigen Kunststoff- oder Glasröhren vor und gießen Sie 6 ml der Lösung in flachen Petrischalen, jeweils 3 ml. HINWEIS: Wenn im SMFS-Experiment die Bindung mehrerer Sondenpolymere beobachtet wird, kann das Mischen von Silan-PEG-mal mit nicht-funktionellem Silan-PEG die Anzahl der Verankerungspunkte reduzieren. Zur Einstellung der Passivierungsschicht kann PEG mit unterschiedlichen Massen (d.h. Konturlängen) verwendet werden27.</li>
		<li>Die AFM Auslegerchips unmittelbar nach Schritt 3.1.3 in der Silane-PEG-mal-Lösung (bis zu 10 Chips pro Petrischale) für 3 h bei 60 °C35inkubieren.</li>
		<li>Petrischalen aus dem Ofen nehmen und die Lösung mindestens 10 min abkühlen lassen.</li>
		<li>Spülen Sie jeden AFM AuslegerChip sorgfältig aus. Reduzieren Sie die Auswirkungen von Kapillarkräften auf den AFM-Ausleger beim Passieren der Luft-Lösungsmittel-Schnittstelle, indem Sie diese Chips beispielsweise beim Eintauchen in die Lösung leicht kippen.<ol>
<li>Für PEG- und PS-Polymere dreimal mit Toluin ausspülen.</li>
			<li>Für PNiPAM-Polymer einmal mit Toluin und zweimal mit Ethanol abspülen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wählen Sie mindestens zwei AFM Auslegerchips als Steuer AFM Ausleger Chips, überspringen Schritt 3.3 und spülen Sie sie wie folgt, um die Polarität des Lösungsmittels zu erhöhen:<ol>
<li>Für PEG- und PS-Polymere zweimal mit Ethanol und einmal mit Reinstwasser abspülen.</li>
			<li>Für PNiPAM-Polymer zweimal mit Reinstwasser abspülen. HINWEIS: Control AFM Auslegerchips haben alle Funktionalisierungsschritte mit Ausnahme der Polymerbefestigung durchlaufen (Schritt 3.3). Sie dienen dazu, die Sauberkeit des Funktionalisierungsprozesses, des AFM-Auslegerchiphaltersystems, der Oberflächen und der für das SMFS-Experiment verwendeten Lösungsmittel zu beweisen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kovalente Polymeraufsatz HINWEIS: Obwohl die AFM-Auslegerspitze voraussichtlich vollständig mit Maleimidgruppen bedeckt ist, gibt es nur wenige Bindungsstellen für das Single-Sonden-Polymer, da Maleimid eine Hydrolyse in Wasser durchläuft, was zu inaktiven PEGs47führt. Diese inaktiven PEGs fungieren wie oben beschrieben als Passivierungsschicht.<ol>
<li>AFM Auslegerchips direkt nach Schritt 3.2.5 in einer der folgenden Polymerlösungen in 3 ml Petrischalen inkubieren. Wenn das jeweilige Polymer nicht richtig gelöst ist, verwenden Sie ein 40 °C Wasserbad und rühren Sie die Lösung gut. ANMERKUNG: Da die Verwendung von Thiol-beendeten Polymeren zur Bildung von Disulfidbindungen führen kann, die die Reaktion mit den Maleimidgruppen von Silan-PEG-mal behindern, wird ein Reduktionsmittel empfohlen, insbesondere wenn Schritt 3.3 in wässrigen Puffern für wasserlösliche Polymere33aufgetragen wird.<ol>
<li>Verwenden Sie für PEG- und PS-Polymere eine Konzentration von 1,25 mg/ml in Toluin für 1 h bei 60 °C.</li>
			<li>Verwenden Sie für PNiPAM-Polymere eine Konzentration von 1,25 mg/ml in Ethanol für 3 h bei RT. HINWEIS: Wenn im SMFS-Experiment die Bindung mehrerer Sondenpolymere beobachtet wird, sollte die Konzentration des Polymers reduziert werden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spülen Sie vorsichtig jeden AFM Auslegerchip.<ol>
<li>Für PEG- und PS-Polymere zweimal mit Toluin, zweimal mit Ethanol und einmal mit Reinstwasser nach 10 min Abkühlung abspülen.</li>
			<li>Für PNiPAM-Polymere zweimal mit Ethanol und zweimal mit Reinstwasser abspülen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bewahren Sie jeden AFM Auslegerchip separat in einer kleinen (1 ml) Petrischale auf, die mit Reinstwasser bei 4 °C gefüllt ist, bis er in einem Experiment verwendet wird.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Oberflächenvorbereitung
<ol><li>Siliziumoxid-Wafer HINWEIS: Diese Oberfläche wurde für SMFS mit PEG und PNiPAM verwendet.<ol>
<li>Schneiden Sie einen Siliziumoxid-Wafer mit einem Diamantmesser in kleine Stücke.</li>
		<li>Die Siliziumoxid-Stücke separat in Mikrozentrifugenrohre geben und diese mit Ethanol füllen.</li>
		<li>Beschallen Sie die Siliziumoxid-Stücke für 10 min.</li>
		<li>Die Siliziumoxid-Stücke zweimal mit Ethanol abspülen und unter einem Stickstoffstrom sorgfältig trocknen. Verwenden Sie die Siliziumoxid-Stücke sofort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selbstmontierte Monoschicht aus hydrophoberm Alkanthiol auf Gold (SAM) HINWEIS: Diese Oberfläche wurde für SMFS mit PS verwendet. Weitere Informationen zu SAMs finden Sie in der Literatur39,49.<ol>
<li>Verwenden Sie einen goldbeschichteten Siliziumwafer (A [100], 5 nm Titan, 100 nm Gold), um die Schritte 4.1.1 – 4.1.4 auszuführen.</li>
		<li>Die Oberflächenstücke in einer 1-Dodecanthiol-Lösung (2 mM) für 18 h inkubieren.</li>
		<li>Spülen Sie die frisch zubereiteten SAMs zweimal in Ethanol.</li>
		<li>Trockene SAMs mit Stickstofffluss zur direkten Verwendung oder lagern Sie sie bis zu 4 Tage für die spätere Verwendung in Ethanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Datenerfassung
HINWEIS: Alle hier gezeigten Messungen wurden in Reinstwasser mit einem Cypher ES AFM unter Verwendung einer Heiz- und Kühlprobestufe zur Temperaturschwankungen durchgeführt. Im Allgemeinen können alle AFMs verwendet werden, die die Möglichkeit bieten, in Flüssigkeiten zu messen.
<ol><li>Setzen Sie den funktionalisierten AFM Auslegerchip in den AFM ein.</li>
	<li>Kleben Sie die vorbereitete Oberfläche in einen Probenhalter, der für die Messung in Flüssigkeiten geeignet ist (z. B. High Resolution Replicating Compound 101RF oder ein UV-härtender Klebstoff). HINWEIS: Diese Bindemittel sind hochinert und resistent gegen eine große Anzahl polarer Lösungsmittel. Die Beständigkeit des Klebstoffs gegen unpolare Lösungsmittel (z. B. Toluol oder Hexan) oder hohe Temperaturen sollte vor der Verwendung überprüft werden.</li>
	<li>Tauchen Sie den AFM Auslegerchip und die Sondenprobe in die Flüssigkeit ein, hier: Reinstwasser. HINWEIS: Ein Lösungsmitteltropfen (ca. 100 l) kann auf dem AFM-Auslegerchiphalter abgelagert werden. Die Abdeckung des AFM-Auslegerchips mit Lösungsmittel reduziert kapillare Kräfte, die sonst auf den AFM-Ausleger einwirken würden, wenn er sich der Probenoberfläche nähert, die durch die Luft-Lösungsmittel-Schnittstelle geht.</li>
	<li>Stellen Sie bei Bedarf die Temperatur ein und lassen Sie das System ausdemieren. HINWEIS: Temperaturänderungen können zu einer Umlenkung des AFM-Auslegers aufgrund eines bimetallischen Effekts für AFM-Ausleger mit einer reflektierenden Beschichtung wie Aluminium oder Gold führen. Die Ausgleichsbildung sollte von der Oberfläche (mehrere m) entfernt durchgeführt werden, bis keine weitere Änderung des Umlenksignals beobachtet wird (bis zu 15 min für MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Variieren Sie die Temperatur nach dem Zufallsprinzip, um alle Auswirkungen der Alterung der Funktionalisierung auszuschließen. Stellen Sie sicher, dass die aufgebrachten Temperaturen nicht zu einer irreversiblen Biegung des AFM-Auslegers führen. HINWEIS: Jegliche Temperatureffekte auf die Lösungsmitteleigenschaften (z. B. Verdunstung oder Viskositätsänderungen) können Ihre Experimente behindern. In den vorgestellten Beispielen wurde die Temperatur über einen Bereich von bis zu 40 K in Schritten von 10 K variiert, wobei Wasser als Lösungsmittel aufgenommen wurde (z.B. von 278 K bis 318 K).</li>
	<li>Nähern Sie sich der Oberfläche, um die InvOLS (inverse optische Hebelempfindlichkeit) zu bestimmen, indem Sie Kraftverlängerungskurven auf einer harten Oberfläche (z. B. Siliziumoxid) nehmen. Nehmen Sie dazu das Ablenksignal des Photodetektors (in V) vs. Piezoabstand und bestimmen Sie die Steigung des Teils, der den Einzug der AFM-Auslegerspitze in die darunter liegende Oberfläche (abstoßendes Regime) darstellt, mit einer linearen Funktion. Um Fehler zu reduzieren, nehmen Sie den Durchschnitt von mindestens fünf Werten, um den endgültigen InvOLS-Wert zu erhalten. Weitere Informationen finden Sie in der Literatur4,39. HINWEIS: Der InvOLS kann nur auf harten Oberflächen zuverlässig bestimmt werden. Bei Experimenten an weichen Oberflächen oder Schnittstellen stellen Sie sicher, dass Sie eine harte Oberfläche in der Nähe Ihrer weichen Oberflächen platzieren. Dann kann die InvOLS Kalibrierung vor oder nach Ihren Soft-Oberflächenexperimenten durchgeführt werden, ohne dass das AFM-Setup demontiert werden muss.</li>
	<li>Zur federkonstanten Bestimmung bewegen Sie den AFM-Ausleger auf eine Höhe, in der weder attraktive noch abstoßende Wechselwirkungen zwischen AFM-Auslegerspitze und Oberfläche (mehrere m) aufweisen. Zeichnen Sie dann ein thermisches Rauschenspektrum auf, in dem die Leistungsspektraldichte (PSD) vs. Frequenz aufgezeichnet wird. Die folgenden Schritte werden in der Regel durch automatisierte integrierte Funktionen in kommerzieller AFM-Software ausgeführt: Zunächst wird das erfasste thermische Rauschspektrum analysiert, indem eine Funktion an die PSD anpasst, z.B. ein einfacher harmonischer Oszillator (SHO). Die Passung erfolgt bis zum Minimum zwischen der ersten und zweiten Resonanz. Zweitens wird die Fläche unter dem angepassten Teil des PSD-Frequenz-Plots bestimmt, die die mittlere quadratische Verschiebung des AFM-Auslegers in vertikaler Richtung darstellt. Schließlich wird der Äquipartitionssatz verwendet, um die AFM-Auslegerkraftkonstante28,50zu erhalten. HINWEIS: Es sollte ein geeigneter Frequenzbereich verwendet werden, der den ersten Resonanzspitzen des AFM-Auslegers umfasst. Um ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, sollten mindestens 10 PSDs mit der höchstmöglichen Frequenzauflösung angesammelt werden.</li>
	<li>Starten Sie das Experiment. Zeichnen Sie Kraftkarten auf, indem Sie Kraftverlängerungskurven gitterartiver Weise (z. B. 10 x 10 Punkte für eine Fläche von 20 x 20m2) aufzeichnen, um lokale Oberflächeneffekte (z. B. Verunreinigungen, Verrenkungen) und durchschnittlichunterschiedliche unterschiedliche Oberflächenflächen zu vermeiden. HINWEIS: Typische Parameter sind eine Zuggeschwindigkeit von 1 m/s und eine Abtastrate von 5 kHz, um eine ausreichende Auflösung zu gewährleisten. Die Abtastrate sollte angepasst werden, wenn die Zuggeschwindigkeit variiert wird. Der Rückzugsabstand sollte an die Kontur- oder Desorptionslänge des gemessenen Polymers angepasst werden (ca. doppelt so lange wie erwartet).</li>
	<li>Verwenden und variieren Sie die Verweilzeit zur Oberfläche, damit das einzelne Polymer an der Oberfläche haften kann (typischerweise 0 – 5 s).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Bestimmung des InvOLS und der Federkonstante am Ende des Experiments, um die Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen. HINWEIS: Für eine starke Haftung zwischen Polymer und Oberfläche kann die Kalibrierung nach dem eigentlichen Experiment durchgeführt werden, um die Funktionalisierung zu erhalten.</li>
</ol>6. Datenauswertung
HINWEIS: Für die Datenauswertung wurde eine auf Igor Pro basierende, benutzerdefinierte Software für die folgenden Schritte verwendet.
<ol><li>Konvertieren Sie das rohe Ablenksignal (in Volt) in Kraftwerte (in Newtons) durch Multiplikation mit dem aufgezeichneten InvOLS und der ermittelten Federkonstante.</li>
	<li>Subtrahieren Sie die Umlenkung des AFM-Auslegers (nach Multiplikation des Rohverformungssignals mit dem InvOLS) von der von den Piezoelementen in vertikaler Richtung angetriebenen Entfernung, um die wahre Verlängerung (Spitzen-Oberflächenabstand) zu erhalten4.</li>
	<li>Korrigieren Sie die für das Driften erhaltenen Kraftverlängerungskurven, indem Sie eine lineare Funktion nach dem letzten Ereignis an die Basislinie anpassen und diese von der Kraftverlängerungskurve subtrahieren. Das einbauliche Teil sollte eine ausreichende Ausdehnung von der Oberfläche darstellen, bei der weder attraktive noch abstoßende Wechselwirkungen zwischen AFM-Auslegerspitze und darunter liegender Oberfläche beobachtet werden. Anschließend wird die Basislinie auf die Nullachse festgelegt. HINWEIS: Bei Messungen auf stark reflektierenden Oberflächen wie Gold können Interferenzen auftreten. Diese ergeben sich aus der partiellen Reflexion des Laserstrahls von der Oberfläche und von der Rückseite des AFM-Auslegers. So könnten die erhaltenen Kraftverlängerungskurven ein sinusförmiges Kraftsignalartefakt entlang der vertikalen Verlängerung zeigen. Dies ist ein Artefakt, das die endgültigen Kraftwerte behindert. Um diese Kraftverlängerungskurven noch zu berücksichtigen, ist eine Korrektur möglich (Abbildung 2).</li>
	<li>Wenn die Interferenzen in den Kraftverlängerungskurven angezeigt werden, wählen Sie eine repräsentative Kraftverlängerungskurve (Rückzugskurve) aus, die keine anderen Ereignisse als möglicherweise einen Spitzen der unspezifischen Haftung und das gleiche sinusförmige Artefakt (d. h. Amplitude und Phase) anzeigt (Abbildung 2A). HINWEIS: Glätten Sie die repräsentative Kraftverlängerungskurve, um das niederfrequente Muster der Interferenz zu erhalten.</li>
	<li>Wählen Sie eine zu korrigierende Kraftverlängerungskurve aus (Abbildung 2B).</li>
	<li>Überlagern Sie beide Kraftverlängerungskurven aus den Schritten 6.4. und 6.5. um sicherzustellen, dass beide das gleiche sinusförmige Artefakt (d. h. Amplitude und Phase) aufweisen (Abbildung 2C).</li>
	<li>Subtrahieren Sie die (geglättete) repräsentative Kraftverlängerungskurve von der zu korrigierenden Kraftverlängerungskurve, die zu einer geraden und nicht zu einer sinusförmigen Basislinie führt (Abbildung 2D). HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich der unspezifische Haftungsspitzen der repräsentativen Kurve von einzelnen Molekülereignissen unterscheidet, die in den zu korrigierenden Kurven auftreten. Tatsächlich ist die Auswahl der repräsentativen Kurve entscheidend für eine ordnungsgemäße Korrektur.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie kein konkurrierendes finanzielles Interesse haben.

AFM-basiertes SMFS ist eines der wichtigsten Werkzeuge zur Untersuchung von Wechselwirkungen einzelner Moleküle in der Polymerphysik. Für ein echtes Einzelmolekülexperiment ist eine kovalente Befestigung des Sondenpolymers an einer AFM-Auslegerspitze unerlässlich.
Viele frühere Arbeiten basieren auf Nanofischen-Experimenten, insbesondere für PNiPAM, bei denen Polymere auf eine Oberfläche adsorbiert und dann durch zufällige Entnahme aus dem Substrat mit einer AFM-Auslegerspitze30,31gedehnt werden. Dies könnte die Ergebnisse verändern und zu einer Fehlinterpretation des Verhaltens einzelner Moleküle führen. Dort könnten kooperative Effekte die Ergebnisse dominieren, da Wechselwirkungen mit benachbarten Polymeren nicht ausgeschlossen werden können. Dies hat einen großen Einfluss auf die Ergebnisse, insbesondere für Polymere, die deutlich unterschiedliches Verhalten in loser Schüttung im Vergleich zu einzelnen isolierten Molekülenzeigen 57,58.
Das hier vorgestellte Funktionalisierungsprotokoll ist zuverlässig und kann unabhängig von ihrer Konturlänge, Hydrophobizität oder der serischen Behinderung der Monomere problemlos auf verschiedene Polymere angewendet werden. Zusätzlich wird eine Passivierung angeboten, um unerwünschte Wechselwirkungen zwischen dem Single-Sondenpolymer und der AFM-Auslegerspitze sowie zwischen der AFM-Auslegerspitze und der darunter liegenden Oberfläche zu verhindern. Darüber hinaus wird die Auswertung von Kraftverlängerungskurven mit Dehnungsereignissen angezeigt. Dort wird ein Verfahren zur Bestimmung von Hauptkraftverlängerungskurven vorgeschlagen. Dies bietet eine bessere Möglichkeit, z.B. temperaturbedingte Effekte auf das Kraftverlängerungsverhalten zu offenbaren. Darüber hinaus wird die Analyse von Einzelmolekül-Desorptionsereignissen mit konstanten Kraftplateaus durchgeführt. Außerdem wird eine einfache Möglichkeit zur Korrektur sinusförmiger Kraftsignalartefakte in Kraftverlängerungskurven gegeben, die andernfalls die Ergebnisse des Experiments beeinträchtigen könnte.
Im Vergleich zu Stetter et al.39wird das hier vorgestellte Funktionalisierungsverfahren auf drei statt vier Stufen reduziert und die Robustheit des Verfahrens verbessert. Der Hauptvorteil der PEGylation und Silanisierung in einem Schritt besteht darin, eine besser kontrollierte Reaktion zu haben und den Ertrag zu erhöhen. Darüber hinaus müssen weniger Lösungen vorbereitet und weniger Spülschritte erforderlich sein. Dies reduziert den Aufwand und die Zeit für die Vorbereitung und erhöht die Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist das Verschieben von AFM-Auslegern immer ein kritischer Teil des Funktionalisierungsprozesses. Ein Transfer von einer Lösung zur anderen birgt immer die Gefahr, dass die Funktionalisierungsqualität durch Übertragungen über die Luft-Wasser-Schnittstelle oder durch den Verlust von AFM-Auslegern durch unsachgemäßen Einsatz einer Pinzette stark beeinflusst wird.
Um die korrekte kovalente Befestigung eines einzelnen Polymers an einer AFM Auslegerspitze nachzuweisen, müssen unterschiedliche Bedingungen erfüllt sein. Erstens sind AFM-Freischwinger von erheblicher Bedeutung und sollten auf jede Funktionalisierung vorbereitet werden. Der Funktionalisierungsprozess und die Fluidzelle für die Durchführung der Experimente gelten nur dann als sauber, wenn eine kleine Anzahl von Kraftverlängerungskurven Dehnungen oder Plateaus im Kontrollexperiment aufweisen (in den vorgestellten Beispielen weniger als 2 %).
Ein klares Dehnungsmuster ohne weitere Tropfen oder Maxima ist wichtig für die richtigen einzelnen Moleküldehnungsereignisse. Zusätzlich sollte die Abhängigkeit der Bruchkraft von der Kraftbelastungsrate bei Bruch oder die vollständige elastische Reaktion der Dehnungskurve analysiert werden, um die gleichzeitige Desorption mehrerer Polymere59,60auszuschließen. Bei PEG und PNiPAM zeigten 19 % bzw. 42 % der Kraftverlängerungskurven, die an verschiedenen Positionen der Oberfläche aufgenommen wurden, ein solches Dehnungsmuster. Um Dehnungsereignisse zu erhalten, muss die Physik des Polymers zur jeweiligen darunter liegenden Oberfläche stark sein. Andernfalls wird ein Plateau-ähnliches Desorptionsereignis beobachtet. Dies ist umso entscheidender für die Detektion von Dehnungsereignissen bei hohen Kräften (bis zu 500 pN oder mehr). Da diese starke Physisorption nicht für jede Kraftverlängerungskurve erfüllt wird, ist die Ausbeute solcher Ereignisse geringer als bei reinen Plateau-ähnlichen Desorptionsereignissen. Als Alternative können stark haftende Gruppen wie Katecholen oder Chemisorption zwischen Polymer und zugrunde liegender Oberfläche verwendet werden. Dies erfordert jedoch die Einführung weiterer funktioneller Gruppen oder Kopplungsstellen am Polymer61,62.
Tatsächlich liefert die Masse (d.h. die Konturlänge) des Polymers einen wertvollen Fingerabdruck. Obwohl die Masse aus folgenden Gründen nicht direkt in die gemessene Konturlänge übersetzt werden kann, ist die Längenverteilung sehr wertvoll, um Einzelmolekülereignisse zu definieren. Bei einem PNiPAM-Polymer mit geringer Polydispersität(n = 1,28) fanden wir in den Experimenten signifikante Unterschiede in den Erweiterungswerten für die erhaltenen Dehnungsereignisse (und damit in der Polymerlänge). Ein Grund dafür könnte die Bestimmung der Polymerlänge und ihrer Verteilung sein. In der Größenausschlusschromatographie (SEC) wird ein relatives Gewicht des Zielpolymers im Vergleich zu Normen wie PS oder Poly (Methylmethacrylat) (PMMA)63bestimmt. Es wird erwartet, dass das angenommene relative Gewicht vom absoluten Molekulargewicht abweicht, da sich der hydrodynamische Radius des Zielpolymers und des Standards erheblich unterscheiden kann. Zusätzlich kann die Silanschicht während des Funktionalisierungsprozesses durch falsches Wasser in Toluol oligomerisiert werden. Die Befestigung solcher Oligomere an der AFM-Auslegerspitze führt zu einer flexibleren Schicht mit weniger Ankerpunkten64. Auch der Befestigungspunkt des Polymers an der Siliziumschicht ist möglicherweise nicht unbedingt an der Spitze, was zu einer Verschiebung der erfassten Längenwerte29führt. Während ein Polymermodell wie die Wurmkette (WLC) oder das Modell der frei verkandenkettigen Kette (FJC) das jeweilige Kraftverlängerungsverhalten für PEG oder PNiPAM nicht über den gesamten Erweiterungsbereich18,29,41,65,66richtig reproduzieren kann, könnte ein solches Polymermodell für andere Polymer- und Proteinsysteme10,15,67,68.
Die kovalente Befestigung eines einzelnen PS-Polymers (mit einer Konturlänge von mehr als 1 m) gilt nur dann als erfolgreich, wenn eine beträchtliche Anzahl von Kraftverlängerungskurven ein lang genug Plateau konstanter Kraft aufweisen (Abbildung 5). Ein Plateau, das durch das Desorieren eines einzelnen Polymers entsteht, wird durch einen einzigen scharfen Fall einer konstanten Kraft zur Basislinie bei einer bestimmten Ausdehnung definiert, wie in Abbildung 5Aangegeben. Wenn mehr Polymere an der AFM-Auslegerspitze befestigt sind, wird eine Kaskade von Plateaus beobachtet56 (Abbildung 5C). Die Plateaulänge (Desorptionslänge), die mit der Polymerkonturlänge51korreliert, muss aufgrund der unspezifischen Haftung der AFM-Auslegerspitze an der darunter liegenden Oberfläche (hier ca. 200 nm) deutlich länger sein als jede Haftspitze. Features, die nur in einer einzigen Kraftverlängerungskurve angezeigt werden, sollten nicht interpretiert werden. In den vorgestellten Experimenten zeigten mindestens 80 von 100 Kurven ein Plateau von mehr als 200 nm in mindestens zwei Kraftkarten an zwei verschiedenen Stellen auf der Oberfläche. Darüber hinaus zeigt die Verteilung der Desorptionslängen unter Verwendung von Streudiagrammen, wie sie in Abbildung 5B und 5Dangegeben sind, ob und wie viele Polymere an die AFM-Auslegerspitze gebunden sind. Im Falle von PS diente eine enge Verteilung der Desorptionskraft und Länge, die von Denebenen der Kraftverlängerungskurven entnommen wurde, als Beweis für eine erfolgreiche kovalente Befestigung. Dies bewies schließlich den Erfolg des Funktionalisierungsprotokolls. Daher empfehlen wir dringend, solche Kraft- und Längenverteilungen in Publikationen darzustellen.
Die Auswertung von Kraftverlängerungskurven mithilfe integrierter Algorithmen, die viele voreingestellte Parameter umfassen, sollte mit Vorsicht erfolgen. Gründe sind beispielsweise, dass eine feste Abtastrate nicht für jede angewendete Zuggeschwindigkeit geeignet ist oder dass eine automatisierte Glättung der Kraftverlängerungskurven wichtige Details austeilen könnte. In der Regel kann ein richtiges Verständnis des jeweiligen Bewertungsverfahrens Fehler im Bewertungsverfahren verhindern, was wiederum die endgültigen Ergebnisse eines AFM-basierten SMFS-Experiments stark beeinflussen kann.
Zusammenfassend stellen wir ein Funktionalisierungsprotokoll vor, das zuverlässig ist und leicht auf eine Vielzahl von Polymeren angewendet werden kann. Darüber hinaus wird eine ordnungsgemäße Bewertung von Kraftverlängerungskurven mit einzelnen Molekülen dargestellt, die die Bestimmung physikalischer Parameter wie Dehnungskraft, Desorptionskraft und Desorptionslänge ermöglicht. Die vorgestellten Protokolle und Verfahren sind wertvoll für die Untersuchung von Reizen-responsiven Systemen auf der Ebene einzelner Moleküle.

Seit seiner Erfindung in den 1980er Jahren1hat sich das Atomkraftmikroskop (AFM) zu einem der wichtigsten bildgebenden Verfahren in der Naturwissenschaft entwickelt, mit subnanometer räumlicher Auflösung, Sub-Piconewton-Kraftauflösung und der Möglichkeit, unter verschiedenen Lösungsmittel- und Temperaturbedingungen2,3,4,5,6,7zu messen.,
Neben der Bildgebung8,9wird AFM zur Durchführung der Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS) verwendet, die Einblicke in Klebstoffwechselwirkungen zwischen einem einzelnen Polymer und Oberflächen, physikalische Eigenschaften einzelner Polymere und Entfaltungsmechanismen von Proteinen7,10,11,12,13,14,15,16. In einem regelmäßigen SMFS-Experiment wird die funktionalisierte Auslegerspitze mit einer Oberfläche in Berührung gebracht, so dass das Polymer an der AFM-Auslegerspitze auf diese Oberfläche einsteigt. Durch Das Einziehen der AFM-Auslegerspitze von der Oberfläche wird eine Änderung der Durchbiegung des AFM-Auslegers in eine Kraft umgewandelt, die zu einer Kraftverlängerungskurve4führt. Physikalische Parameter wie Dehnkraft, Desorptionskraft und Desorptionslänge können abhängig von verschiedenen Parametern wie Zuggeschwindigkeit, Verweilzeit an der Oberfläche, Einzugstiefe in die Oberfläche, Temperatur, Lösungsmittel17,18 und verschiedene Oberflächen wie feste Substrate, Polymerfolien oder unterstützte Lipid-Doppelschichten19,20,21,22bestimmt werden. Darüber hinaus kann ein Polymer in verschiedene räumliche Richtungen untersucht werden, wodurch die Reibungseigenschaften des Polymers23,24,25,26untersucht werden.
Eine kovalente Befestigung des untersuchten Polymers an einer AFM-Auslegerspitze ist für solche Studien unerlässlich. So verhindert eine hohe Ausbeute an Einzelmolekülereignissen mit ein und demselben Polymer, die an eine AFM-Auslegerspitze gebunden sind, jede Verzerrung der Ergebnisse aufgrund der Kalibrierung der Federkonstante des AFM-Auslegers27,28, unterschiedliche Nanbaupunkte29 oder unterschiedliche Polymere (mit unterschiedlichen Konturlängen) wie im Falle von Nanofischen30,31,32. Auch Wechselwirkungen mit anderen Polymeren sowie Mittelungseffekte können weithin verhindert werden18,28. Für die kovalente Befestigung eines Polymers an der AFM-Auslegerspitze können verschiedene Arten chemischer Modifikationen angewendet werden, von denen viele im Buch von Hermanson33zusammengefasst sind. Amin- und Thiol-basierte Verknüpfungsreaktionen sowie Klickchemie stellen die am häufigsten verwendeten Methoden in AFM Auslegerspitze Funktionalisierung34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 zeigen, wie man 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS-Chemie verwendet, um ein Protein an eine AFM-Auslegerspitze zu heften. Jedoch, die genannten funktionellen Gruppen neigen dazu, Vernetzen, was zu einem Verlust der Funktionalität43,44. Auch Carbodiimide zeigen eine Tendenz zur schnellen Hydrolyse in Lösung43. Maleimid- und Thiolgruppen sind in der Regel stabiler und zeigen keine vernetzungen Reaktionen. Das vorgestellte Protokoll ist eine Optimierung der zuvor veröffentlichten Protokolle in den Referenzen35,39.
Hier wird ein zuverlässiges Funktionalisierungsprotokoll vorgestellt, das unabhängig von Eigenschaften wie Konturlänge oder Hydrophobizität einfach an eine große Anzahl unterschiedlicher Polymere angepasst werden kann. Drei verschiedene Polymere wurden beispielsweise ausgewählt: hydrophiles Polyethylenglykol (PEG) und Poly(N-Isopropylacrylamid) (PNiPAM) sowie hochmolares hydrophobes Polystyrol (PS).N Um eine kovalente Bindungsfähigkeit mit einem geeigneten Linkermolekül zu gewährleisten, wurden die drei Polymere für eine telechelische Thiol-Moiety als funktionelle Endgruppe ausgewählt. Das Linkermolekül selbst ist typischerweise ein kurzes PEG-Polymer mit zwei aktiven Stellen, einer Silangruppe an einem Ende und einer Maleimidgruppe am anderen Ende. Erstere ermöglicht eine kovalente Befestigung an der AFM-Auslegerspitze und letztere eine Bindungsreaktion mit der Thiolgruppe des funktionalisierten Hochmolmassenpolymers. Darüber hinaus dienen inaktive PEG-Linkermoleküle als Passivierungsschicht, um unerwünschte Wechselwirkungen zwischen dem Sondenpolymer und der AFM-Auslegerspitze sowie zwischen der AFM-Auslegerspitze und der darunter liegenden Oberfläche zu verhindern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

Die AFM-basierte Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (Atomic Force Micro Skopie) ist ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen Polymer und Oberflächen. Für ein echtes Einzelmolekülexperiment ist eine kovalente Anhaftung des Sondenmoleküls unerlässlich, da nur dann Hunderte von Kraftverlängerungsspuren mit ein und demselben einzelnen Molekül erhalten werden können. Viele Spuren sind wiederum notwendig, um zu beweisen, dass ein einzelnes Molekül allein untersucht wird. Darüber hinaus ist die Passivierung entscheidend, um unerwünschte Wechselwirkungen zwischen dem einzelnen Sondenmolekül und der AFM-Auslegerspitze sowie zwischen der AFM-Auslegerspitze und der darunter liegenden Oberfläche zu verhindern. Das hier vorgestellte Funktionalisierungsprotokoll ist zuverlässig und kann leicht auf eine Vielzahl von Polymeren angewendet werden. Charakteristische Einzelmolekülereignisse (d.h. Dehnungen und Plateaus) werden in den Kraftverlängerungsspuren nachgewiesen. Aus diesen Ereignissen können physikalische Parameter wie Dehnungskraft, Desorptionskraft und Desorptionslänge erhalten werden. Dies ist besonders wichtig für die genaue Untersuchung von Reizen-responsiven Systemen auf der Ebene des einzelnen Moleküls. Als beispielhafte Systeme werden Poly(Ethylenglykol) (PEG), Poly(N-Isopropylacrylamid) (PNiPAM) und Polystyrol (PS) von SiOx (für PEG und PNiPAM) und von hydrophoben selbstmontierten Monolayeroberflächen (für PS) in wässriger Umgebung gestreckt und desorbed.N

Die folgenden Beispiele zeigen Ergebnisse der Einzelnenmoleküldehnung und Desorption der Polymere PEG, PNiPAM und PS. Alle AFM Auslegerspitzen wurden mit dem oben angegebenen Protokoll funktionalisiert. PEG und PNiPAM wurden auf SiOx mit Temperaturschwankungen gemessen. Für eine detaillierte Diskussion der resultierenden temperaturabhängigen Dehnungskurven für PEG und PNiPAM siehe Kolberg et al.18 Ein anderes Kraftverlängerungsmotiv ist ein Plateau konstanter Kraft (z.B. beim Desorbing von PS aus selbst zusammengesetzten Monolayern von methylenbeendetem Alkanthiol auf Gold (SAM) in Wasser4,27,39,51).
Beispiel 1: Dehnen von PEG und PNiPAM in Wasser Das temperaturabhängige Dehnverhalten im Wasser wurde mit einzelnen PNiPAM- und PEG-Polymeren gemessen, die kovalent an eine AFM-Auslegerspitze an einem Ende gebunden und am anderen Ende auf einer SiOx-Oberfläche mit Einem Physikbeet verbunden waren. Nach den Kalibrierungs- und Clean-Control-Experimenten (weniger als 2% der Kraftverlängerungskurven zeigen einzelne Molekülereignisse) wurden für jeden AFM-Ausleger mindestens zwei Kraftkarten aufgezeichnet. Das temperaturabhängige Experiment wurde durchgeführt, indem mindestens eine Kraftkarte bei jeder Temperatur aufgezeichnet wurde. Wenn nur wenige Dehnungsereignisse auftauchten, wurde der jeweilige AFM-Ausleger verworfen und der nächste AFM-Ausleger des Chips genommen (in der Regel in der Reihenfolge C, B, D und E von MLCT-Bio-DC). Für die beispielhaften Daten von PEG wurde in 95 von 500 gemessenen Kraftverlängerungskurven (19%) ein einziges Dehnungsereignis beobachtet. Für PNiPAM zeigten 252 von 600 Kraftverlängerungskurven ein Dehnungsmuster (42%). Für einen besseren Vergleich der Kraftverlängerungskurven wurde für jede Temperatur eine einzige Masterkurve erzeugt. Zu diesem Zweck wurden nur die Kurven mit einem Dehnungsereignis auf mindestens 500 pN gewählt, bei denen Konformationsschwankungen und Lösungsmitteleffekte vernachlässigbar sind,52ausgewählt. Die letzte Anzahl der berücksichtigten Strecken war 3 bei 278 K, 7 bei 298 K und 4 bei 318 K für PEG und 4 bei 278 K, 3 bei 298 K und 3 bei 318 K für PNiPAM18.
Das Verfahren zum Generieren von Masterkurven ist in Abbildung 3angegeben. Die gewählten Kraftverlängerungskurven (Abbildung 3A) werden auf eine Länge L0 (Verlängerung mit einer Kraft von 500 pN) neu skaliert, siehe Abbildung 3B. Die Haftspitze zeigt eine große Variation der unspezifischen Haftung zwischen der Oberfläche und der AFM-Auslegerspitze, beeinflusst aber nicht das Polymerdehnungsverhalten. Nach dem Zusammenführen der neu skalierten Kraftverlängerungskurven werden sie durch eine binominale Glättung gemittelt, wie in Abbildung 3Cdargestellt. Dazu gallt ein Gauß-Filter die Daten mit normalisierten Koeffizienten, die aus Pascals Dreieck abgeleitet werden, auf einer Ebene, die dem Glättungsparameter 2053entspricht. Schließlich wird für jede Temperatur eine Masterkurve erhalten, wie in Abbildung 3Dangegeben. Das Zoom-In zeigt den Bereich, in dem der Temperatureffekt auf das Kraftverlängerungsverhalten am ausgeprägtesten ist.
Einen Vergleich des Temperaturverhaltens von PEG (A) und PNiPAM (B) finden Sie in Abbildung 4. Für PEG wurde eine Abnahme der Dehnkraft mit steigender Temperatur beobachtet. Bei einer Temperaturerhöhung von 278 auf 318 K wurde ein Anstieg der neu skalierten Verlängerung um ca. 5 % bei 100 pN beobachtet. Für PNiPAM könnte eine entgegengesetzte temperaturabhängige Verschiebung aufgedeckt werden. Bei einer Temperaturerhöhung von 278 auf 328 K wurde eine Abnahme der neu skalierten Verlängerung um ca. 1% der neu skalierten Verlängerung bei 100 pN beobachtet. Zusätzlich konnte die dehnfreie Energie aus den Kraftverlängerungs-Masterkurven gewonnen werden, indem die Fläche unter der Kurve für einen bestimmten Kraftwert bestimmt wurde. Dies könnte zur Extraktion energetischer und entropischer Beiträge der dehnenden freien Energie mit Hilfe von Molekulardynamiksimulationen (MD)18verwendet werden.
Beispiel 2: Desorption von PS von einer SAM-Oberfläche in Wasser Die Desorption von PS von einer SAM-Oberfläche im Wasser könnte verwendet werden, um die Desorptionskraft und -länge zu bestimmen und damit die hydrophobe Wechselwirkung zu quantifizieren. Nach der Kalibrierung wurden mindestens zwei Kraftkarten an zwei verschiedenen Stellen der Oberfläche aufgezeichnet. Wenn die Polymerbefestigung erfolgreich war, zeigten die Kraftverlängerungskurven Plateaus mit konstanter Kraft als charakteristisches Merkmal, siehe Abbildung 5A und Abbildung 5C. Plateauartige Desorption wird beobachtet, wenn die Dynamik der sonnierten Bindungen viel schneller ist als die Zugrate der AFM-Auslegerspitze (Quasi-Gleichgewicht). Desorptionskräfte plateauähnlicher Kraftverlängerungskurven sorgen direkt für Haftungsfreie Energien durch Integration der Kraftverlängerungsspur54. Sie wurden verwendet, um elektrostatische, dispersive und hydrophobe Wechselwirkungen sowie Reibungseigenschaften einzelner Polymere auf Oberflächen inflüssigerUmgebung 2,4,23,51,54,55zu bestimmen.
Jedes Plateau konstanter Kraft wurde mit einer sigmoidalen Kurve versehen, um die Desorptionskraft und desorptionslänge zu bestimmen, die dann in Histogrammen geplottet wurden. Die Histogramme wurden mit einem Gaußian ausgestattet, um den Maximalwert und die Standardabweichung zu extrahieren. Für eine bessere Übersicht wurden die Desorptionskraft- und Längenwerte in einem Streudiagramm zusammen angezeigt, wie in Abbildung 5B und Abbildung 5Dangegeben.
Für Polystyrol auf SAM in Wasser entsprechen die ermittelten Desorptionskräfte den zuvor ermittelten Werten19,23. Da die Desorptionslänge mit der Polymerkonturlänge51korreliert, kann die Desorptionslängenverteilung als Beweis für die kovalente Bindung des jeweiligen Polymers an die AFM-Auslegerspitze über ihre funktionelle Endgruppe verwendet werden. Somit dient die Desorptionslänge als Fingerabdruck.
Bei mehr als einem Polymer, das an der AFM-Auslegerspitze befestigt ist, können Kaskaden von Plateaus (diskrete Schritte) in den Kraftverlängerungskurven56beobachtet werden. Jedes Plateau stellt die Desorption eines Polymers in einer anderen Ausdehnung dar. Das in Abbildung 5C und Abbildung 5D angegebene Experiment zeigte einen typischen Fall von zwei Polymeren, die gleichzeitig an der AFM-Auslegerspitze befestigt waren. Durch die Anpassung des endgültigen Bruchs konnte eine bimodale Verteilung für die Desorptionslänge gefunden werden, während die Desorptionskraft eine enge Verteilung zeigte. In diesem Fall konnte die kleinere Desorptionslänge in 90 % der Kraftverlängerungskurven gefunden werden, entweder als einzelnes Plateau oder als zusätzliches Plateau auf dem längeren Plateau, wie in Abbildung 5Cangegeben. Die höhere Desorptionslänge wurde in 37% der erhaltenen Kraftverlängerungskurven gefunden. So könnte die Verteilung der Desorptionslänge verwendet werden, um die Anzahl der verschiedenen Polymere zu bestimmen, die an der AFM-Auslegerspitze befestigt sind. Im Allgemeinen ist eine enge Verteilung der Desorptionslängenwerte ein guter Hinweis darauf, dass ein und dasselbe einzelne Polymer in den erhaltenen Kraftverlängerungskurven untersucht wurde. Gleichzeitig kann eine Überlagerung der jeweiligen Kräfteverlängerung verwendet werden, um zu entscheiden, ob ein und dasselbe einzelne Polymer gemessen wurde.
Nach dem Nachweis der kovalenten Bindung eines einzelnen PS-Polymers können weitere Experimente mit diesem PS-Polymer unterschiedliche Substrat (feste Oberfläche sowie Polymerfolien), Lösungsmittelbedingungen, Temperatur, Zuggeschwindigkeit oder Verweilzeit durchgeführt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht des Tip-Funktionalisierungsprozesses. Beinhaltet die chemische Modifikation der AFM Auslegerspitze nach (1) Plasmaaktivierung (2) Silanisation/PEGylation und (3) Polymeraufsatz. Zusätzlich werden die detaillierten chemischen Strukturen der verwendeten Polymere, nämlich PEG, PNiPAM und PS, dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Abbildung 2: Beseitigung von Interferenzen in Kraftverlängerungskurven. (A) Finden Sie eine Kraftverlängerungskurve, die ein sinusförmiges Kraftsignalartefakt entlang der Verlängerung zeigt, aber kein einzelnes Moleküldehnungsereignis hat. (B) Wählen Sie eine Kraftverlängerungskurve mit einem einzelnen Molekülereignis, das aus dem sinusförmigen Artefakt korrigiert werden soll. (C) Überlagern Sie die Kurven, um zu steuern, ob die sinusförmigen Artefakte der Kurven wirklich übereinstimmen. (D) Durch Subtrahieren der Kraftverlängerungskurve (A) von (B) wird eine Kraftverlängerungskurve mit einer geraden Basislinie erreicht. Obwohl der Haftspitzenpunkt nicht für weitere Analysen verwendet werden kann, wird die Kraftverlängerungskurve nun für das Artefakt korrigiert, was zu viel genaueren Kraftwerten im Bereich des Einzelmolekülereignisses führt (hier: > 0,2 m Erweiterung). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Abbildung 3: Bestimmung von Masterkurven aus Kraftverlängerungskurven von PEG bei 298 K. (A) Experimentelle Daten bei 298 K mit 7 Kraftverlängerungskurven. Nach der Neuskalierung auf eine Länge L0 bei einer Kraft von 500 pN (B) können die Kraftverlängerungskurven zusammengeführt und durch binominale Glättung gemittelt werden, um eine Masterkurve (C) zu erhalten. Die neu skalierten Kurven werden als Punkte angegeben, während die Masterkurve als durchgezogene Linie angezeigt wird. Schließlich können die erhaltenen Masterkurven für unterschiedliche Temperaturen verglichen werden (D). Das Zoom-In gibt den Bereich an, in dem der Temperatureffekt auf das Kraftverlängerungsverhalten am ausgeprägtesten ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Abbildung 4: Vergleich der temperaturabhängigen Masterkurven von PNiPAM und PEG. Für PEG wird bei der Erhöhung der Temperatur (A) eine Erhöhung der neu skalierten Verlängerung bei 100 pN (Mittelkraftbereich) beobachtet, während für PNiPAM eine entgegengesetzte temperaturabhängige Verschiebung (B) aufgedeckt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Abbildung 5: Analyse der Kraftverlängerungskurven von PS auf SAM in Wasser. (A) Beispielhafte Kraftverlängerungskurve (blau) mit einer sigmoidalen Passform des Plateaus (lila). Zusätzlich markieren die Pfeile die festgelegte Kraft (rot) und Länge (grün) des Plateaus. Die desorptionskraft- und Desorptionslängenwerte, die durch sigmoidale Passungen erhalten werden, werden in einem Streudiagramm angezeigt und die resultierenden Histogramme mit einem Gaußschen versehen. (B) Die ermittelten durchschnittlichen Desorptionskraft- und Desorptionslängenwerte liegen bei (112 x 6) pN und (659 x 7) nm, wobei 93% der Kraftverlängerungskurven solche einzelnen Plateauereignisse aufweisen. (C) Beispielhafte Kraftverlängerungskurve (blau) für zwei Polymere, die gleichzeitig an der AFM-Auslegerspitze befestigt sind. Hier zeigt die Desorptionskraft eine unimodale Verteilung mit einem durchschnittlichen Kraftwert von (117 x 5) pN, während eine bimodale Verteilung für die Desorptionslänge gefunden werden kann, die zu durchschnittlichen Längenwerten von (656 x 9) nm und (1050 x 16) nm führt. (D) 90 % der gesampelten Kraftverlängerungskurven zeigen nur einzelne Plateauereignisse an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Die kovalente Befestigung von Sondenmolekülen an aatomaren Kraftmikroskopie(AFM)-Auslegerspitzen ist eine wesentliche Technik für die Untersuchung ihrer physikalischen Eigenschaften. So können wir die Dehnkraft, Desorptionskraft und Länge von Polymeren über die AFM-basierte Einzelmolekülkraftspektroskopie mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmen.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Die Einzelmolekülkraftspektroskopie ermöglicht es uns, physikalische Parameter zu messen, die die mechanischen und klebenden Eigenschaften von Polymeren beschreiben. Bei der Verwendung der AFM-basierten Kraftspektroskopie zur Untersuchung einzelner Moleküle ist es wichtig, ein zuverlässiges und effizientes Protokoll zu haben, um diese Moleküle kovalent an eine AFM-Auslegerspitze zu binden. Dieses Protokoll kann unabhängig von der Konturlänge oder Hydrophobizität auf viele verschiedene Polymere übernommen werden.Alle Schritte sollten in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden, um das Einatmen organischer Dämpfe zu vermeiden. Zusätzlich sind lösungsmittelbeständiges Glas, Laborlack und Augenschutz erforderlich. Verwenden Sie zunächst frisch gereinigte Pinzette, um AFM Auslegerchips in die Plasmakammer zu legen.Starten Sie das Plasmakammer-Oberflächenaktivierungsprogramm, indem Sie Start und dann ja auswählen. Stellen Sie sicher, dass der Plasmaprozess ordnungsgemäß funktioniert. Ein Plasmaprozess mit hohem Sauerstoffgehalt zeigt eine hellblaue Farbe.Während das Oberflächenaktivierungsprogramm ausgeführt wird, lösen Sie Silan-PEG-mal in Toluen auf, um eine Konzentration von 1,25 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Legen Sie drei Milliliter der Lösung in eine flache Petrischale. Nachdem der Plasmaprozess abgeschlossen ist, belüften Sie die Plasmakammer, indem Sie bestätigen und dann entlüften.Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, um die Absorption von Verunreinigungen zu verhindern. Legen Sie die Chips in die Petrischale und bebrüten Sie die Chips für drei Stunden bei 60 Grad Celsius. Entfernen Sie die Petrischale aus dem Ofen und lassen Sie sie mindestens 10 Minuten abkühlen.Als nächstes spülen Sie die Chips. Für PEG- oder Polystyrolbindung die Chips dreimal mit Toluus abspülen. Bei Polynipambindung sollten Chips einmal mit Toluin und zweimal mit Ethanol vorspült werden.Um den Aufprall von Kapillarkräften auf den AFM-Ausleger zu reduzieren, neigen Sie die Chips beim Spülen leicht. Die AFM Auslegerchips müssen richtig gespült werden, um einen Überschuss an physikalischen Polymeren zu entfernen, die das Experiment beeinflussen können. Das Spülen sollte sorgfältig durchgeführt werden, um Schäden an den AFM-Auslegern zu vermeiden.Schließlich bereiten Sie mindestens zwei Chips als Steuerungen, die nicht kovalentpolymer aufbringen. Für Kontrollen im Vergleich zu PEG- und Polystyrol-Chips zweimal mit Ethanol und einmal mit Wasser abspülen. Für Kontrollen im Vergleich zu Polynipam-Chips zweimal mit Wasser abspülen.Um eine kovalente Befestigung von PEG oder Polystyrol durchzuführen, bereiten Sie drei Milliliter Polymerlösung in Toluole in einer Konzentration von 1,25 Milligramm pro Milliliter vor. Fügen Sie die Lösung und die Chips zu einer Petrischale hinzu und brüten Sie die Chips bei 60 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Inkubation mit PEG oder Polystyrol die Chips 10 Minuten abkühlen lassen.Spülen Sie die Chips zweimal mit Toluin, zweimal mit Ethanol und einmal mit Wasser. Um eine kovalente Befestigung von Polynipam durchzuführen, bereiten Sie drei Milliliter Polymerlösung in Ethanol in einer Konzentration von 1,25 Milligramm pro Milliliter vor. Fügen Sie die Lösung und die Chips zu einer Petrischale hinzu und brüten Sie die Chips bei Raumtemperatur für drei Stunden.Nach der Inkubation mit Polynipam die Chips zweimal mit Ethanol und zweimal mit Wasser abspülen. Um die Chips bis zum Einsatz in einem Experiment zu lagern, legen Sie jeden Chip separat in eine mit Wasser gefüllte Petrischale mit einem Milliliter. Halten Sie die Petri-Gerichte bei vier Grad Celsius.Legen Sie zunächst den funktionalisierten AFM Auslegerchip in einen Chiphalter ein. Kleben Sie die vorbereitete Oberfläche in einen Probenhalter, der für Messungen in Flüssigkeit geeignet ist. Verwenden Sie eine Pipette, um den Chip in Wasser einzutauchen.Montieren Sie die Probenoberfläche in den AFM. Tauchen Sie die Probenoberfläche in Wasser ein. Schließen Sie den Chiphalter an den AFM an.Dann nähern Sie sich dem Chip an die Probenoberfläche. Verwenden Sie das Umgebungspanel, um die Zieltemperatur einzustellen und den Modus und die Feedback-Optionsfelder auf einzuschalten. Dann lassen Sie das System für etwa 15 Minuten ausstehen.Um eine Kraftverlängerungskurve zu nehmen, nähern Sie sich der AFM-Auslegerspitze an die Oberfläche und wählen Sie eine einzelne Kraft aus. Die resultierende Kurve zeigt die Ablenkung gegen den Piezoabstand mit der Annäherung an die rot dargestellte Oberfläche und die in Blau dargestellte Retraktion an. Erweitern Sie den Teil der Kurve, der den Einzug der AFM-Auslegerspitze darstellt, in die darunter liegende Oberfläche.Um eine lineare Anpassung durchzuführen, legen Sie die Cursor entweder auf den Ansatz oder die Rückzugskurve fest, und wählen Sie INVOLS aktualisieren aus dem Kontextmenü aus. Der resultierende Wert für den inversen optischen Hebelempfindlichkeitswert wird im Bedienfeld oben links angezeigt. Nachdem Sie dieses Verfahren mindestens fünfmal wiederholt haben, berechnen Sie einen Durchschnitt für die inverse optische Hebelempfindlichkeit und geben Sie den Durchschnitt in das Panel ein.Positionieren Sie den AFM-Ausleger in einer Höhe von ca. 100 Mikrometern über der Oberfläche, indem Sie Move zum Pre-Engage auswählen. Um ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis für das thermische Rauschspektrum zu erhalten, stellen Sie die Mittelungszahl auf mindestens 10 ein und wählen Sie die höchstmögliche Frequenzauflösung. Zeichnen Sie als Nächstes das thermische Rauschspektrum auf, indem Sie Wärmedaten erfassen auswählen.Um das thermische Rauschspektrum mit einer einfachen harmonischen Oszillatorfunktion anzupassen, erweitern Sie den Teil der Kurve, der die erste Resonanzspitze darstellt. Wählen Sie dann Initialisierungsanpassung aus. Verfeinern Sie schließlich die Passung mithilfe der Schaltfläche "Thermische Daten anpassen".Die entsprechende Kraftkonstante wird im Panel angezeigt. Um mit dem Sammeln der Daten zu beginnen, legen Sie die Parameter für das Experiment fest. Legen Sie die Zuggeschwindigkeit auf ein Mikrometer pro Sekunde fest und erzwingen Sie den Trigger auf einen Nanonewton.Nähern Sie sich der AFM-Auslegerspitze an die Oberfläche, und wählen Sie eine einzelne Kraft aus, um eine einzelne Kurve aufzuzeichnen und zu bestimmen, ob die Parameter wie im Manuskript beschrieben angepasst werden müssen. Wählen Sie F-Karte aus dem Master-Panel aus. Um eine Kraftkarte mit 100 Kurven zu erhalten, legen Sie die Anzahl der Kraftpunkte und Kraftlinien auf 10 fest.Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Kraftkarte, indem Sie do F map auswählen. Nehmen Sie Die Kraftverlängerungskurven gitterartiver, um lokale Oberflächeneffekte zu vermeiden und unterschiedliche Flächen zu durchschnittlich zu nutzen. Wiederholen Sie nach dem Experiment die Bestimmung der inversen optischen Hebelempfindlichkeit und der Federkonstante, um die Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen.Einzelne Polynipam- und PEG-Polymere wurden an einem Ende kovalent an eine AFM-Auslegerspitze gebunden und am anderen Ende auf der Siliziumdioxidoberfläche bebaut. Um das temperaturabhängige Dehnungsverhalten zu messen, wurde ein klares Einzelmolekül-Dehnungsereignis gefolgt von einem endgültigen Maximum am Ende der jeweiligen Kraftverlängerungskurve identifiziert. Dann wurde für jede Temperatur eine einzige Masterkurve erzeugt.Bei PEG wurde eine Abnahme der Dehnkraft bei steigender Temperatur beobachtet. Bei Polynipam wurde der gegenteilige Trend beobachtet. Die Desorption von Polystyrol von einer SAM-Oberfläche in Wasser kann verwendet werden, um die Desorptionskraft und Länge zu bestimmen.Wenn die Polymeraufsatzwarmung erfolgreich war, zeigten die Kraftverlängerungskurven Plateaus mit konstanter Kraft. Jedes Plateau wurde mit einer sigmoidalen Kurve ausgestattet, um die Desorptionskraft und desorptionslänge zu bestimmen. Die beobachteten Desorptionskräfte entsprachen zuvor ermittelten Werten.Wenn mehr als ein Polymer an der AFM-Auslegerspitze befestigt war, wurden Kaskaden von Plateaus in den Kraftverlängerungskurven beobachtet. Bei zwei angeschlossenen Polymeren wurde eine bimodale Verteilung für die Desorptionslänge gefunden, während die Desorptionskraft eine enge Verteilung zeigte. Eine funktionalisierte AFM-Auslegerspitze kann verwendet werden, um die Kraftreaktion einzelner Moleküle in einer flüssigen Umgebung und mit externen Reizen zu quantifizieren.Die Verwendung von sauberen Geräten, Lösungsmitteln, AFM-Auslegerspitzen und wiederholter Spülung ist sehr wichtig, um ein hohes Maß an Sauberkeit zu erreichen, das vor den beschriebenen kontrollierten Experimenten bestätigt werden sollte. Die vorgestellten Protokolle und Verfahren ebneten den Weg für ein besseres Verständnis von stimulierend reagierenden Polymersystemen. Die Ergebnisse können direkt mit molekulardynamischen Simulationen verglichen werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Mikrofluidik-On-Chip-Capture-Cycloaddition reversibel Unbeweglichkeitseffekt kleine Moleküle oder Mehrkomponenten-Strukturen für Biosensor-Anwendungen

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Forschung

Chemie

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Die kovalente Bindung von BMP-2 auf Oberflächen mit einem selbstorganisierten Monoschicht-Ansatz

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Herstellung von Silica-Nanopartikeln durch Mikrowellen-unterstützte Säure-Katalyse

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Aktivieren Moleküle, Ionen und Feststoffpartikeln mit Acoustic Cavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektrochemische Impedanz Spektroskopie als Instrument zur elektrochemischen Rate Konstanten Schätzung

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Selbstmontage von Hybrid-Lipidmembranen, dotiert mit hydrophoben organischen Molekülen an der Wasser-Luft-Schnittstelle

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Rasterkraftmikroskopie kombiniert mit Infrarotspektroskopie als Werkzeug zur Untersuchung der Chemie einzelner Bakterien

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...