Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. ו-T.H. מימון המימון של הגרמני הפורשיגומיימיתושיסםדרך (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch למות הגרמני הבינלאומי (DFG) im האדם הטוב ביותר דה בוננדס ו דר ללאנדר – EXC-2193/1 – 390951807, ו גרנט HU 997/1-13 (פרויקט 420798410). מ מכירה בתמיכה חלקית במסגרת פרויקט ה-"לואי" ב-Apo, על ידי משרד החינוך הגבוה של הסן, מחקר ואמנויות. אנו מודים ד ר וולפגנג ברונר וד ר. '. זוקאוסקריט ממכון פראונהופר ליישומי חיל-אוויר מוצק המדינה לתרומת מוצרי סיליקון באיכות גבוהה מצופה זהב.

המחברים מצהירים כי אין להם עניין פיננסי מתחרה.

SMFS מבוססי AFM הוא אחד הכלים העיקריים לחקירת אינטראקציות מולקולה אחת בפיסיקה פולימר. עבור ניסוי מולקולה בודדת אמיתית, המצורף הקוולנטי של פולימר המקדח לקצה הזיז AFM הוא חיוני.
עבודות קודמות רבות מבוססות על ניסויים ננו דיג, במיוחד עבור pnipam, איפה פולימרים הם נספחת על פני השטח ולאחר מכן נמתח על ידי בחירת אקראי מתוך המצע באמצעות קצה שלוחה afm30,31. הדבר עשוי לשנות את התוצאות ולהוביל לפענוח שגוי של התנהגות המולקולה הבודדת. שם, השפעות שיתופיות עשויים להשתלט על התוצאות משום שאינטראקציות עם פולימרים שכנים לא ניתן לכלול. זה יש השפעה גדולה על התוצאות, במיוחד עבור פולימרים להראות התנהגות שונה באופן משמעותי בכמויות גדולות לעומת מולקולות בודדות57,58.
פרוטוקול הפונקציונליזציה המוצג כאן הוא אמין וניתן להחילו בקלות על פולימרים שונים, ללא קשר לאורך המתאר שלהם, הידרופוביניטי או הפרעה הסטרומית של המונמרים. בנוסף, מסופק פסיבציה למניעת אינטראקציות לא רצויות בין הפולימר היחיד לבין קצה הזיז של AFM, כמו גם בין קצה הזיז של AFM לבין משטח הבסיס. יתר על כן, הערכה של עקומות כוח הארכה מראה אירועים מתיחה מוצג. שם, מוצע הליך לקביעת עקומות כוח מאסטר. זה מציע דרך טובה יותר לחשוף, למשל, השפעות טמפרטורה הקשורות בהתנהגות הארכת כוח. יתר על כן, ניתוח של מולקולה אחת desorption אירועים שמציעות מישורים כוח קבוע מסופק. גם, דרך פשוטה של תיקון ממצאים sinusoidal force אותות בעקומות כוח מאריך ניתנת אשר עלולה לפגוע אחרת בתוצאות של הניסוי.
בהשוואה לשטטר ואח '39, הליך הפונקציונליזציה המוצג כאן מצטמצם לשלושה שלבים במקום ארבע והחוסן של השגרה משופר. היתרון העיקרי של ביצוע הפינגיציה והסילניזציה בשלב אחד הוא לקבל תגובה מבוקרת יותר ולהגדיל את התשואה. יתר על כן, פתרונות פחות צריך להיות מוכנים שלבי שטיפה פחות נדרשים. פעולה זו מקטינה את המאמץ והזמן להכנה ומגבירה את היכולת הנוזלה. יתר על כן, העברת מנופים AFM תמיד הוא חלק קריטי של תהליך הפונקציונליזציה. העברה מפתרון אחד לשני תמיד מפעיל את הסיכון להשפיע מאוד על איכות הפונקציונליות בשל העברות באמצעות ממשק מים אוויר או לאבד AFM התלויה מנופים על ידי שימוש לא נאות של מלקחיים.
כדי להוכיח מצורף המתאים ביותר של פולימר אחד לקצה הזיז AFM התנאים השונים צריך להיות מתקיים. ראשית, השליטה מנוף AFM הם בעלי חשיבות משמעותית ויש להכין עבור כל הפונקציונליזציה. תהליך הפונקציונליזציה והתא הנוזלי לביצוע הניסויים נחשבים לנקיים בלבד, אם מספר קטן של עקומות כוח-מאריך מראים מתיחות או מישורים בניסוי השליטה (בדוגמאות המוצגות פחות מ -2%).
דפוס מתיחה ברורה ללא טיפות נוספות או מקסימה היא חיונית עבור מולקולה אחת נאותה מתיחה אירועים. בנוסף, התלות של כוח הקרע על שיעור טעינת כוח בקרע או תגובה גמישה מלאה של עקומת מתיחה צריך להיות מנותח על מנת להוציא בו desorption של פולימרים מרובים59,60. עבור יתד ו PNiPAM, 19% ו 42% של עקומות כוח הארכה שנלקחו במיקומים שונים של פני השטח הראו דפוס כזה מתיחה, בהתאמה. על מנת להשיג אירועים מתיחה, הפיזיסורזיה של הפולימר למשטח המתאים בבסיס חייב להיות חזק. אחרת, אירוע הדסורזיה הדומה לרמת הרמה הוא נצפה. זה אפילו יותר מכריע לזיהוי אירועי מתיחה בכוחות הגבוהים (עד 500 pN או יותר). כאשר הפיסיוספיחה החזקה הזאת לא מתקיים עבור כל עקומת כוח הארכה, התשואה של אירועים כאלה היא פחות מאשר לאירועים ברמה הטהורה כמו מישור. כחלופה, שמירה מאוד על קבוצות כגון catechols או כימוזיה בין משטח פולימרי לבין הבסיס ניתן להשתמש. עם זאת, זה דורש הקדמה של קבוצות פונקציונליות נוספת או אתרים מצמד ב פולימר61,62.
למעשה, המסה (כלומר, אורך המתאר) של הפולימר מספק טביעת אצבע רבת ערך. למרות שהמסה אינה יכולה להיות מתורגמת ישירות לאורך המתאר הנמדד מהסיבות הבאות, התפלגות האורך היא בעלת ערך רב להגדרת אירועי מולקולה בודדת. במקרה של פולימר PNiPAM עם פולידיסטיטיות נמוך (Ɖ = 1.28), מצאנו הבדלים משמעותיים בערכי ההרחבה עבור אירועי מתיחה שהושג (ובכך אורך הפולימר) בניסויים. סיבה אחת לכך יכולה להיות הנחישות של אורך הפולימר ואת ההתפלגות שלה. ב-size-הדרה כרומטוגרפיה (SEC), משקל יחסי של פולימר היעד נקבע בהשוואה עם תקנים כמו PS או פולי (מתיל מלית) (PMMA)63. המשקל היחסי המשוער צפוי לסטות מהמשקל המולקולרי המוחלט משום שרדיוס ההידרודינמי של פולימר היעד והתקן יכול להיות שונה באופן משמעותי. בנוסף, שכבת silane עשוי להיות oligomerized על ידי מים מלאכותי בטולואן במהלך תהליך הפונקציונליזציה. ההחזקה של oligomers כזה לקצה הזיז AFM מוביל שכבה גמישה יותר עם פחות נקודות עוגן64. כמו כן, נקודת ההחזקה של הפולימר לשכבת הסיליקון עשוי לא בהכרח להיות בפיסגה המובילה למעבר של ערכי אורך שאותרו29. בעוד מודל פולימרי כגון שרשרת התולעת כמו (wlc) או שרשרת גמיש בחופשיות (fjc) לא יכול לשכפל את התנהגות בהתאמה כוח הארכה עבור יתד או pnipam כראוי על טווח ההרחבה כולו18,29,41,65,66,,,כגון מודל פולימרי עשוי להיות בעל ערךעבור מערכותפולימרים וחלבונים אחרים686710
החיבור הקוולנטי של אחד מפולימר PS יחיד (עם אורך מתאר של יותר מ-1 μm) נחשב למוצלח בלבד, כאשר מספר ניכר של עקומות כוח-הארכה מראה רמה ארוכה של כוח מתמיד (איור 5). מישור הנובע מחוסר בינג פולימר בודד מוגדר על ידי טיפה חדה בודדת של כוח קבוע לקו הבסיס בשלוחה מסוימת, כפי שניתן באיור 5א. אם יותר פולימרים מחוברים לקצה הזיז AFM, מפל של מישורים נצפתה56 (איור 5ג). אורך הרמה (אורך desorption), הקשורים עם אורך מתאר פולימר51, יש להיות משמעותית יותר זמן מאשר כל שיא הדבקה עקב הדבקה ספציפית של afm הקצה למשטח הבסיס (כאן סביב 200 ננומטר). תכונות המופיעות אך ורק בעקומת הארכה של כוח אחת, לא אמורות להתפרש. בניסויים שהוצגו, לפחות 80 מתוך 100 עקומות הראו רמה ארוכה יותר מאשר 200 nm ב לפחות שני מפות כוח בשני כתמים שונים על פני השטח. יתר על כן, התפלגות של אורכי הספיחה, באמצעות מגרשים פיזור כגון נתון באיור 5B ו -5d, לגלות אם וכמה פולימרים רבים מאוגדים קצה הזיז afm. במקרה של נ. ב., התפלגות צרה של כוח הדסורזיה ואורך הנלקח מרמות עקומות של הארכת כוח שימשו כהוכחה להחזקה מוצלחת של הקשר הקוולנטי. הדבר הוכיח בסופו של דבר את ההצלחה של פרוטוקול הפונקציונליזציה. לכן, אנו ממליצים בחום להציג הפצות כאלה של כוח ואורך בפרסומים.
הערכת עקומות כוח-מאריך באמצעות אלגוריתמים מוכללים המרכיבים מספר רב של פרמטרים שנקבעו מראש צריכים להתבצע בזהירות. הסיבות הן לדוגמה שקצב דגימה קבוע אינו מתאים לכל מהירות משיכה שהוחלה או שהחלקת אוטומטית של עקומות הרחבת הכוח עשויה להיות ממוצעת של פרטים חשובים. בדרך כלל הבנה נכונה של הליך ההערכה המתאים יכול למנוע שגיאות בהליך ההערכה, אשר יכול בתורו מאוד להשפיע על הממצאים הסופיים של הניסוי SMFS מבוסס AFM.
לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול פונקציונליזציה שהוא אמין וניתן להחילו בקלות על מגוון פולימרים. יתר על כן, הערכה נאותה של עקומות יחיד מולקולה כוח מאריך מוצג, המאפשר קביעת פרמטרים פיזיים כגון כוח מתיחה, כוח desorption ואורך desorption. הפרוטוקולים והנהלים המוצגים הם בעלי ערך לחקירת מערכות תגובה לגירויים ברמת המולקולה הבודדת.

מאז ההמצאה שלובשנות ה-80,מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) הפכה לאחת הטכניקות החשובות ביותר הדמיה במדעי הטבע שמציעות sub-nanometer רחב הרזולוציה מרחבית, sub-piconewton החלטה כוח האפשרות של מדידה בתנאי הממס השונים טמפרטורה2,3,4,5,6,7.
מלבד הדמיה8,9, afm משמש לבצע בודד מולקולה כוח ספקטרוסקופיית (smfs) נותן תובנה בין אינטראקציות דבק בין פולימר בודד משטחים, תכונות פיזיות של פולימרים יחיד ומנגנונים התגלגלות של חלבונים7,10,11,12,13,14,15,16. בניסוי ה-SMFS הרגיל, מובא קצה התנועה הפונקציונלי במגע עם משטח, כך שפולימר בתוך הזיז הפיזי של AFM לפני השטח הזה. על ידי החלפת קצה הזיז של AFM מפני השטח, שינוי בהטיה של הזיז ה-AFM מומר לכוח המוביל לעקומת כוח מאריך4. פרמטרים פיזיים כגון כוח מתיחה, כוח desorption ו desorption אורך יכול להיקבע תלוי פרמטרים שונים כגון מהירות משיכת, זמן להתעכב על פני השטח, כניסות עומק לתוך פני השטח, טמפרטורה, ממס17,18 ומשטחים שונים כמו מצעים מוצק, סרטים פולימריים או ליפיד bilayers19,20,21,22 יתר על כן, פולימר יכול להיות נחקר בכיוונים מרחביים שונים, ובכך לחקור את המאפיינים הפריקטיונאל של פולימר23,24,25,26.
החזקה הקוולנטי של הפולימר הנחקר לקצה הזיז של AFM הוא חיוני למחקרים כאלה. Thus, תשואה גבוהה של אירועים מולקולה אחת עם אחד ופולימר אותו מאוגד לקצה הזיז afm המונע כל הטיה של התוצאות בשל כיול של קבוע האביב של ה-afm זיז27,28, משתנה קבצים מצורפים29 או פולימרים שונים (עם אורכי מתאר שונים) כמו במקרה של ניסויים ננודיג30,31,32. כמו כן, ניתן למנוע באופן נרחב אינטראקציות עם פולימרים אחרים, כמו גם ממוצע אפקטים של18,28. עבור ההחזקה הקוולונה של פולימר לקצה הזיז של AFM, ניתן ליישם סוגים שונים של שינויים כימיים, שרבים מהם מסוכמים בספר על ידי הרמנסון33. אמין ו-thiol מבוססי מקשר תגובות, כמו גם כימיה לחץ לייצג את השיטות הנפוצות ביותר בשימוש הנפוץ ביותר של afm מקצהמ34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 להראות כיצד להשתמש 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) כימיה של הכימיה (edc)/nhs כדי לחבר חלבון לקצה הזיז afm. עם זאת, הקבוצות הפונקציונלי אמר נוטים לעבור crosslink, ובכך מובילה אובדן של פונקציונליות43,44. כמו כן, בקרבודידים מראים נטייה להידרוליזה מהירה בתמיסה43. מאלאימיד וקבוצות תיול הן בדרך כלל יציבות יותר ולא מציגות תגובות מקושרות. הפרוטוקול המוצג הוא אופטימיזציה של הפרוטוקולים שפורסמו בעבר שניתנו בהפניות35,39.
כאן, פרוטוקול פונקציונליזציה אמין מוצג כי ניתן לכוונן בקלות למספר רב של פולימרים שונים, ללא קשר למאפיינים כגון אורך מתאר או הידרופוטביטי. שלושה פולימרים שונים נבחרו בדרך לדוגמה: פוליאתילן הידרופילי גליקול (פג) ו פולי (N-איזופסילאמיל) (Pniפם), כמו גם קלקר גבוה הידרופובי בכמויות (PS). על מנת לספק יכולת קשירה מובנית עם מולקולת מקשר מתאימה, שלושת הפולימרים נבחרו למציגים את הmoiety הטלצ'למית בתור קבוצת הסיום הפונקציונלית. מולקולת המקשר עצמה היא בדרך כלל פולימר מקוצר קצר עם שני אתרים פעילים, קבוצה silane בקצה אחד וקבוצה maleimide בקצה השני. הראשון מאפשר חיבור קוולנטי לקצה הזיז של afm והאחרון הוא תגובה מחייבת עם קבוצת תיול של פולימר גבוה המוני טוחנת המסה. יתר על כן, מולקולות לא פעיל של מקשר יתד לשמש כשכבת פסיבציה כדי למנוע אינטראקציות לא רצויות בין פולימר הבדיקה ואת קצה הזיז AFM, כמו גם בין קצה הזיז AFM ואת המשטח הבסיסי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המבוסס על מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית בודד הוא כלי אידיאלי לחקירת האינטראקציות בין פולימר בודד משטחים. עבור ניסוי מולקולה בודדת אמיתית, המצורף הקוולנטי של המולקולה בדיקה הוא חיוני כי רק אז יכול להיות מאות עקבות הארכה כוח עם אחד ואת אותה מולקולה אחת לקבל. עקבות רבים הם בתורו הכרחי כדי להוכיח כי מולקולה אחת לבד הוא נחקר. בנוסף, פסיבציה חיונית למניעת אינטראקציות לא רצויות בין מולקולת הגשושית היחידה לבין קצה הזיז של AFM, כמו גם בין קצה הזיז של AFM לבין המשטח המשמש כבסיס. פרוטוקול הפונקציונליזציה המוצג כאן הוא אמין וניתן להחילם בקלות על מגוון פולימרים. אירועים אופייניים מולקולה אחת (כלומר, מתיחות ומישורים) מזוהים בעקבות הארכת כוח. מאירועים אלה, פרמטרים פיזיים כגון כוח מתיחה, כוח desorption ואורך desorption ניתן להשיג. דבר זה חשוב במיוחד לחקירה המדויקת של מערכות תגובה לגירויים ברמת המולקולה הבודדת. כמו מערכות למופת פולי (אתילן גליקול) (פג), פולי (N-איזופסילאמיל) (pniפם) ו פוליסטירן (PS) הם נמתח ו desorbed מ-SiOx (עבור יתד ו pniפם) ומפני הידרופובי עצמית התאספו משטחי דופלקס (עבור PS) בסביבה ימית.

הדוגמאות הבאות מציגות תוצאות של מולקולה יחידה מתיחה והדסורזיה של פולימרים פג, PNiPAM ו PS. כל הטיפים הקשורים ל-AFM הינם פונקציונלי עם הפרוטוקול שניתן לעיל. פג ו PNiPAM נמדדו ב-SiOx עם וריאציה טמפרטורה. לדיון מפורט של עקומות מתיחה תלויות וכתוצאה מכך עבור יתד ו pnipam, לראות kolberg ואח '18 מוטיב כוח שונה שלוחה היא רמה של כוח קבוע (למשל, כאשר desorbing PS ממונאולאיירס התאספו עצמית של מתיל הופסק אלקאן תיולים על זהב (SAM) במים4,27,39,51)
דוגמה 1: מתיחה של יתד ו PNiPAM במים טמפרטורה תלוי התנהגות מתיחה במים נמדד באמצעות PNiPAM בודד ו-יתד פולימרים מאוגד לקצה הזיז AFM בקצה אחד הפיסיופיזיולוגיה על פני השטח SiOx בקצה השני. לאחר הכיול וניסויים בקרת נקי (פחות מ 2% של עקומות כוח-הארכה להראות אירועים מולקולה אחת), לפחות שתי מפות כוח נרשמו עבור כל זיז AFM. הניסוי התלוי בטמפרטורה בוצע על ידי הקלטת לפחות מפת כוח אחת בכל טמפרטורה. כאשר רק אירועים מתיחה מעטים הופיעו, שלוחה AFM בהתאמה נמחק ושלוחה AFM הבאה של השבב נלקח (בדרך כלל בסדר C, B, D ו-E של MLCT-ביו-DC). עבור הנתונים למופת של פג, אירוע מתיחה אחת נצפתה 95 מתוך 500 מנמדד כוח עקומות הארכה (19%). עבור PNiPAM, 252 מתוך 600 כוח הארכת עקומות הראה דפוס מתיחה (42%). להשוואה טובה יותר של עקומות כוח-הארכה, עקומת אב יחיד עבור כל טמפרטורה נוצר. למטרה זו, רק אלה עקומות עם אירוע מתיחה לפחות 500 pN, שם קונפורמציה תנודות ואפקטים ממס הם זניחים, נבחרו52. המספר הסופי של מתיחות נלקח בחשבון היה 3 ב 278 K, 7 ב 298 K ו 4 ב 318 K עבור פג ו 4 ב 278 K, 3 ב 298 k ו 3 ב 318 K עבור PNiPAM18.
ההליך ליצירת עקומות בסיס מוענק באיור 3. עקומות כוח הארכה שנבחרו (איור 3A) הם מחדש לאורך L0 (סיומת בכוח של 500 pN), ראה איור 3ב. שיא הדבקה מראה וריאציה גדולה של הדבקה לא ספציפית בין המשטח לבין קצה הזיז AFM, אך אינו משפיע על התנהגות מתיחה פולימר. לאחר המיזוג של עקומות הרחבת הכוח המושנות מחדש, הן מאוגות על-ידי החלקה בינאומרית כפי שהוצגה באיור 3ג. בשביל זה, מסנן גאוסיאני מחבר את הנתונים עם מקדמים מנורמל שמקורם במשולש של פסקל ברמה שווה לפרמטר ההחלקה 2053. לבסוף, עקומת מאסטר מושגת עבור כל טמפרטורה כפי שניתן באיור 3D. הזום מציג את הטווח שבו אפקט הטמפרטורה בהתנהגות הרחבת הכוח מבוטא ביותר.
השוואה של התנהגות הטמפרטורה של פג (A) ו PNiPAM (ב) ניתן למצוא באיור 4. עבור יתד ירידה של כוח מתיחה עם הטמפרטורה הגוברת נצפתה. גידול של כ 5% הארכה מחדש ב 100 pN נצפתה בעת הגדלת הטמפרטורה מ 278 אל 318 K. עבור PNiPAM, משמרת מנוגדת לטמפרטורה תלויה יכול להתגלות. ירידה של כ 1% של הארכה בקנה מידה של 100 pN נצפתה כאשר הטמפרטורה הוגדלה מ 278 ל 328 K. בנוסף, אנרגיה מתיחה חופשית ניתן להשיג מן עקומות כוח הארכת מאסטר על ידי קביעת האזור תחת העקומה עבור כל ערך כוח נתון. ניתן להשתמש באפשרות זו להפקת תרומות אנרגטיות ואנמיות של אנרגיה חופשית מתיחה בעזרת דינמיקה מולקולרית (MD) סימולציות18.
דוגמה 2: הדיסורזיה של PS ממשטח סם במים הספיחה של PS מ-משטח SAM במים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכוח והאורך הדסורבי ובכך לכמת את האינטראקציה ההידרופובי. לאחר הכיול, לפחות שתי מפות כוח נרשמו בשני כתמים שונים של פני השטח. כאשר הקובץ המצורף פולימר הצליח, עקומות כוח מאריך הראה מישורים של כוח מתמיד, כמו תכונה אופיינית, ראה איור 5A ו- איור 5ג. כאשר הדינמיקה של איגרות החוב הנחקר מהירה הרבה יותר מקצב המשיכה של קצה הזיז המדומה AFM (שיווי משקל). כוחות desorption כמו מאריך כוח הארכת עקומות ישירות לספק אנרגיות ללא הדבקה על ידי שילוב כוח הארכה מעקב54. הם שימשו כדי לקבוע אינטראקציות אלקטרוסטטית, מפזרים והידרופובי, כמו גם מאפייני חיכוך של פולימרים יחיד על משטחים בסביבה נוזלית2,4,23,51,54,55.
כל רמה של כוח קבוע היה מצויד בעיקול הסיגולי כדי לקבוע את כוח הדסורזיה ואת אורך desorption אשר לאחר מכן הותוו ב היסטגרמות. ההיסטגרמות הותאמו באמצעות גאוס כדי לחלץ את הערך המירבי ואת סטיית התקן. לקבלת סקירה טובה יותר, ערכי העוצמה והאורך של הפונקציה מוצגים יחד בתוך מגרש פיזור, כפי שניתן באיור 5ב ואיור 5ד.
לפוליסטירן על סם במים, כוחות הביטחון הנחושים מקבילים לערכים המתקבלים בעבר19,23. כמו אורך desorption התואם את אורך מתאר פולימרים51, התפלגות האורך desorption ניתן להשתמש כהוכחה של הכריכה הקוולנטי של פולימר בהתאמה לקצה הזיז afm באמצעות הקבוצה הפונקציונלית שלה לסיים. לפיכך, אורך הספיחה משמש כטביעת אצבע.
עבור יותר פולימר אחד מוצמד קצה הזיז AFM, מפלי מישורים (שלבים בדידים) ניתן להבחין בעקומות כוח מאריך56. כל רמה מייצגת את הספיחה של פולימר בשלוחה שונה. הניסוי שניתן באיור 5ג ואיור 5D הראו מקרה אופייני של שני פולימרים המחוברים לקצה הזיז afm באותו זמן. על-ידי התאמת הקרע הסופי, ניתן למצוא התפלגות דו-מודאלית עבור אורך הספיחה, בעוד שכוח הספיחה הראה התפלגות צרה. במקרה זה, את האורך הקטן ביותר ניתן למצוא ב 90% של עקומות כוח מאריך, או כרמה אחת או כרמה נוספת במישור הארוך יותר, כפי שניתן באיור 5ג. אורך הדסורזיה גבוה יותר נמצא ב-37% מהעקומות המתקבלות מהארכת כוח. לפיכך, ניתן להשתמש בהתפלגות באורך הקצר כדי לקבוע את מספר הפולימרים השונים המחוברים לקצה הזיז AFM. באופן כללי, התפלגות צרה של ערכי האורך הקצר הוא אינדיקציה טובה כי אחד ואותו פולימר בודד נחקר בעקומות כוח מאריך השיגה. במקביל, ניתן להשתמש במיקום הסופרפוזיציה של השלוחה המתאימה, כדי להחליט האם אחד מהפולימר היחיד נמדד.
לאחר הוכחת מחייב קוולנטי של מפולימר יחיד PS, ניסויים נוספים עם זה מפולימר PS ניתן לבצע מצע משתנה (משטח מלא, כמו גם סרטים פולימריים), תנאי ממס, טמפרטורה, משיכת מהירות או לשכון זמן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> איור 1: מבט סכימטי של תהליך הפונקציונליות של העצה. כולל את השינוי הכימי של קצה הזיז AFM לאחר (1) פלזמה הפעלה (2) silanization/הפיציה ו (3) החזקה פולימר. בנוסף, מבנים כימיים מפורטים של פולימרים המשמשים, כלומר פג, PNiPAM ו-PS מוצגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> איור 2: חיסול הפרעות בעקומות כוח-הארכה. (א) למצוא את עקומת כוח מאריך מראה sinusoidal כוח האות לאורך השלוחה אבל ללא מולקולה יחידה מתיחה אירוע. (ב) לבחור עקומת כוח הארכה עם אירוע מולקולה אחת, אשר תוקנה מן החפץ sinusoidal. (ג) להטיל על העקומות כדי לשלוט אם הממצאים הsinusoidal של עקומות באמת להתאים. (ד) על-ידי חיסור עקומת הרחבת הכוח (A) מ (ב) עקומת כוח-הארכה עם קו בסיס ישר מושגת. למרות השיא הדבקה לא יכול לשמש ניתוח נוסף, עקומת כוח הארכה מתוקנת כעת עבור החפץ המוביל ערכי כוח מדויקים הרבה יותר באזור של אירוע המולקולה היחידה (כאן: > 0.2 יקרומטר של סיומת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> איור 3: קביעת עקומות בסיס מן הארכת כוח עקומות של פג ב 298 K. (א) מידע ניסיוני ב-298 K, באמצעות 7 עקומות כוח מאריך. לאחר שינוי קנה מידה לאורך L0 בכוח של 500 pN (ב), עקומות כוח-הארכה ניתן למזג וממוצעים על ידי החלקה binominal השגת עקומת הראשי (C). העקומות הניתנות לשינוי קנה מידה מוצגות כנקודות כאשר עקומת הבסיס מוצגת כקו מלא. לבסוף, את עקומות המאסטר שהושגו עבור טמפרטורות שונות ניתן להשוות (D). הזום מציין את הטווח שבו אפקט הטמפרטורה בהתנהגות הרחבת הכוח מבוטא ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> איור 4: השוואה בין עקומות המאסטר תלויי הטמפרטורה של PNiPAM ו-פג. עבור פג עלייה של הארכה מחדש ב 100 pN (באמצעכוח טווח) הוא נצפתה בעת הגדלת הטמפרטורה (א), ואילו עבור PNiPAM הפוכה הטמפרטורה תלוי המעבר נחשף (ב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> איור 5: ניתוח עקומות כוח מאריך של PS על SAM במים. (א) הרחבת כוח המופת (כחול) עם התאמה מרבית של המישור (הארגמן). בנוסף, החיצים לסמן את הכוח הנחוש (אדום) ואורך (ירוק) של המישור. הכוח הדסורבי וערכי האורך הנתונים המתקבלים בהתאם לערכים מוצגים בהתוויה של פיזור וכתוצאה מכך היסטורגרמות שהתקבלו מצוידים בגאוסיאנית. (ב) הממוצע הנחוש של כוח הדסורזיה וערכי אורך הדסורזיה הם (112 ± 6) pN ו (659 ± 7) nm, שבו 93% של עקומות כוח מאריך להראות כזה אירועים ברמה אחת. (ג) עיקול כוח מופתי (כחול) לשני פולימרים המחוברים לקצה הזיז afm באותו זמן. כאן, הכוח desorption מראה התפלגות unimodal עם ערך כוח ממוצע של (117 ± 5) pN, בעוד התפלגות דו-אופנית ניתן למצוא עבור האורך desorption המוביל ערכי אורך ממוצע של (656 ± 9) nm ו (1050 ± 16) nm. (ד) 90% מהעיקולים של הרחבת הכוח שנדגמו מציגים רק אירועי רמה בודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

ספקטרוסקופיית כוח מולקולה אחת מאפשרת לנו למדוד פרמטרים פיזיקליים המתארים את התכונות המכאניות וההיבקותיות של פולימרים. בעת שימוש בספקטרוסקופיית כוח מבוססת AFM לחקר מולקולות בודדות, חיוני שיהיה פרוטוקול אמין ויעיל לקשירת מולקולות אלה באופן קוולנטי לקצה cantilever AFM. פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ פולימרים רבים ושונים ללא קשר לאורך קווי המתאר או הידרופוביות.כל השלבים צריכים להתבצע ברדס אדים כדי למנוע שאיפה של אדים אורגניים. בנוסף, זכוכית עמידה בפני ממסים, חלוק מעבדה והגנה על העיניים נדרשים. ראשית להשתמש פינצטה נוקה טרי למקם שבבי cantilever AFM בתא הפלזמה.הפעל את תוכנית ההפעלה של משטח תא הפלזמה על-ידי בחירה באפשרות התחל ולאחר מכן כן. ודא שתהליך הפלזמה פועל כראוי. תהליך פלזמה עם תכולת חמצן גבוהה מראה צבע כחול בהיר.בעוד תוכנית הפעלת פני השטח מתבצעת, להמיס סילאן-PEG-mal בטולואן כדי לקבל ריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מניחים שלושה מיליליטר של הפתרון בצלחת פטרי שטוחה. לאחר השלמת תהליך הפלזמה, לאוורר את תא הפלזמה על ידי בחירת לאשר ולאחר מכן אוורור.המשך מיד לשלב הבא על מנת למנוע ספיגת מזהמים. מניחים את הצ'יפס בצלחת פטרי ו דגירה את הצ'יפס במשך שלוש שעות ב 60 מעלות צלזיוס. מוציאים את צלחת פטרי מהתנור ומאפשרים לה להתקרר לפחות 10 דקות.לאחר מכן, שטפו את הצ'יפס. עבור PEG או קשירה פוליסטירן, לשטוף את השבבים עם toluene שלוש פעמים. עבור כריכת פוליניפאם, יש לשטוף שבבים פעם אחת עםטולואן ופעמיים עם אתנול.כדי להפחית את ההשפעה של כוחות נימי על cantilever AFM, להטות את השבבים מעט בעת שטיפה. שבבי ה-AFM צריכים להיות שטיפה כראוי כדי להסיר כל עודף של פולימרים פיזיים אשר עשוי להשפיע על הניסוי. יש לבצע שטיפה בזהירות כדי למנוע כל נזק ל- AFM cantilevers.לבסוף, הכינו לפחות שני שבבים שישמשו כפקדים שלא יעברו חיבור פולימרי קווולנטי. לפקדים לעומת שבבי PEG ופוליסטירן, יש לשטוף פעמיים באתנול ופעם במים. לפקדים לעומת שבבי פוליניפאם, יש לשטוף פעמיים במים.כדי לבצע התקשרות קוואלנטית של PEG או פוליסטירן, להכין שלושה מיליליטר של פתרון פולימר בטולואן בריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מוסיפים את הפתרון ואת הצ'יפס לצלחת פטרי ו דגירה את הצ'יפס ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה עם PEG או פוליסטירן, אפשרו לשבבים להתקרר במשך 10 דקות.שוטפים את השבבים פעמיים עםטולואן, פעמיים עם אתנול, ופעם אחת עם מים. כדי לבצע התקשרות קוולנטית של פוליניפאם, להכין שלושה מיליליטר של פתרון פולימר באתנול בריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מוסיפים את הפתרון ואת הצ'יפס לצלחת פטרי ומדרבן את הצ'יפס בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות.לאחר הדגירה עם פוליניפאם, לשטוף את השבבים פעמיים עם אתנול ופעמיים עם מים. כדי לאחסן את השבבים עד לשימוש בניסוי, מניחים כל שבב בנפרד בצלחת פטרי מיליליטר אחת מלאה במים. שמור את מנות פטרי בארבע מעלות צלזיוס.ראשית, הכנס את שבב ה-AFM הפונקציונלי למחזיק שבבים. הדבק את המשטח המוכן למחזיק מדגם המתאים למדידות בנוזל. השתמש פיפטה לטבול את השבב במים.תן את משטח הדגימה לתוך ה-AFM. לטבול את פני השטח מדגם במים. חבר את מחזיק השבבים ל- AFM.ואז להתקרב השבב למשטח המדגם. השתמש בלוח הסביבתי כדי להגדיר את טמפרטורת היעד ולהחליף את המצב ואת לחצני האפשרויות של המשוב. לאחר מכן תן למערכת לצייד במשך כ -15 דקות.כדי לקחת עקומת הארכת כוח, התקרב לקצה ה- AFM אל פני השטח ובחר כוח יחיד. העקומה המתקבלת מציגה את ההטיה כנגד מרחק הפיזו כאשר הגישה לפני השטח מוצגת באדום והנסיגה מוצגת בכחול. הרחב את חלק העקומה המייצג את הכניסה של קצה ה- CANTILEVER של AFM לתוך המשטח שמתוחיו.לביצוע התאמה ליניארית, הגדר סמנים בגישה או בעקומות הנסיגה ובחר עדכן את INVOLS מהתפריט תלוי ההקשר. הערך המתקבל עבור ערך הרגישות האופטית ההופכית של הידית מופיע בחלונית בפינה השמאלית העליונה. לאחר חזרה על הליך זה לפחות חמש פעמים, לחשב ממוצע עבור רגישות מנוף אופטי הפוכה להזין את הממוצע בלוח.מקם את ה- AFM בגובה של כ- 100 מיקרומטר מעל פני השטח על-ידי בחירת מעבר לפעולה מוקדמת. כדי לקבל יחס אות לרעש משביע רצון עבור ספקטרום הרעש התרמי, הגדר את הספירה הממוצעת ל- 10 לפחות ובחר את רזולוציית התדר הגבוהה ביותר האפשרית. לאחר מכן, רשום את ספקטרום הרעש התרמי על-ידי בחירת לכידת נתונים תרמיים.כדי להתאים את ספקטרום הרעש התרמי עם פונקציית מתנד הרמונית פשוטה, הרחב את החלק של העקומה המייצג את שיא תהודה הראשון. לאחר מכן בחר אתחל התאמה. לבסוף, מקד את לחצן התאם באמצעות לחצן התאם נתונים תרמיים.קבוע הכוח המתאים יופיע בלוח. כדי להתחיל לאסוף את הנתונים, הגדר את הפרמטרים עבור הניסוי. הגדר מהירות משיכה למיקרומטר אחד לשנייה וכוח הדק לננו-ננוטון אחד.התקרבו לקצה ה-AFM אל פני השטח ובחרו כוח אחד כדי לתעד עקומה אחת ולקבוע אם יש להתאים את הפרמטרים כמתואר בכתב היד. בחרו 'מפת F' מהחלונית הראשית. כדי להשיג מפת כוח עם 100 עקומות, הגדר את מספר נקודות הכוח וכפה קווים ל- 10.התחל להקליט את מפת הכוח על-ידי בחירה באפשרות בצע מפת F. קח עקומות הארכת כוח בצורה דמוית רשת כדי למנוע אפקטים משטח מקומיים כדי ממוצע שטחים שונים. לאחר הניסוי, חזור על קביעת הרגישות האופטית ההופכית של המנוף וקבוע האביב כדי לבדוק את העקביות ואת יציבות המערכת.פולימרים פוליאפם ו- PEG יחידים היו קשורים באופן קוולנטי לקצה מתכלה AFM בקצה אחד ו physisorbed על פני השטח דו תחמוצת הסיליקון בקצה השני. כדי למדוד התנהגות מתיחה תלוית טמפרטורה, זוהה אירוע מתיחה ברור של מולקולה אחת ואחריו מקסימום סופי בסוף עקומת הארכת הכוח המתאימה. ואז נוצרה עקומת מאסטר אחת לכל טמפרטורה.עבור PEG, ירידה של כוח מתיחה נצפתה עם עליית הטמפרטורה. עבור פוליניפאם, המגמה ההפוכה נצפתה. ניתן להשתמש בהרס של פוליסטירן מפני השטח של SAM במים כדי לקבוע את כוח ההתפלה ואת האורך.כאשר חיבור הפולימר הצליח, עקומות הרחבת הכוח הראו מישורים של כוח מתמיד. כל רמה צוידה בעקומה סיגמואידית כדי לקבוע את כוח ההתפלה ואורך ההתפלה. כוחות ההתפלה שנצפו תואמים לערכים שהושגו בעבר.כאשר יותר מפולימר אחד מחובר קצה cantilever AFM, מפלים של מישורים נצפו עקומות הרחבת כוח. עם שני פולימרים מחוברים, התפלגות דו-מודאלית נמצאה לאורך ההתפלה בעוד כוח ההתפלה הראה התפלגות צרה. קצה מתפקוד AFM cantilever יכול לשמש לכימות תגובת הכוח של מולקולות בודדות בסביבה נוזלית עם גירויים חיצוניים.השימוש בציוד נקי, ממיסים, טיפים ל-AFM ושטיפת מידע חוזרת ונשנית חשוב מאוד להגיע לרמה גבוהה של ניקיון שיש לאשר לפני הניסויים המבוקרים המתוארים. הפרוטוקולים והנהלים שהוצגו סללו את הדרך להבנה טובה יותר של מערכות פולימר מגיבות גירויים. ניתן להשוות את התוצאות ישירות לסימולציות דינמיות מולקולריות.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

הכנה של חלקיקי סיליקה באמצעות חומצה קטליזה בסיוע מיקרוגל

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

הפעלת מולקולות, יונים, וחלקיקים מוצקים עם אקוסטית Cavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה ככלי הערכה מתמדת קצב אלקטרוכימי

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

סינתזה של מידע-מיסב פטואידים והרכבה עצמית בימוי דינמי

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

הרכבה עצמית של קרום שומנים היברידי מסוממים עם מולקולות אורגניות הידרופוביות בממשק מים/אוויר

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...