Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. og T.H. anerkjenner finansiering av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellence strategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, og gi HU 997/1-13 (prosjekt # 420798410). M.G. anerkjenner delvis støtte i rammen av LOEWE Project iNAPO av Hessen State Ministry of Higher Education, Research and the Arts. Vi takker Dr. Wolfgang Bronner og Dr. Agne Zukauskaite fra Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF for donasjon av høy kvalitets gullbelagte silisiumwafers.

MERK: Se figur 1 for en skjematisk oversikt.
1. Oppsett av reagens
MERK: Polymerene som brukes til denne protokollen er: maleimid-polyetylenglykol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), tiol-polyetylenglykol-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), tiol avsluttet poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) og tiol avsluttet polystyren (PS-SH, 1,3 mDa).
<ol><li>Forbered den veldefinerte og høye molarmassen PNiPAM-SH via atomoverføring radikal polymerisering, etterfulgt av konvertering og reduksjon av den funksjonelle sluttgruppen for innføring av en tiol moiety, som beskrevet i litteraturen18. Se figur 1 for detaljerte strukturer.</li>
	<li>For lagring av kjemikaliene, forberede mindre aliquots i et tørt hanskebokssystem med nitrogen atmosfære for å unngå eksponering for atmosfærisk oksygen og fuktighet. PEG og PNiPAM er hygroskopiske45,,46 og de funksjonelle endegruppene peg, PNiPAM og PS er kjent for å bli lett oksidert når de oppbevares ved omgivelsesforhold33,,47,48. Alle kjemikalier må lagres ved -20 °C.</li>
	<li>Bruk analytiske løsemidler eller høyere. Videre bruker du ultrarent vann til å skylle AFM cantilevers chips og glass fordi enkeltmolekyleksperimenter er svært følsomme for all forurensning.</li>
</ol>2. Oppsett av utstyr
MERK: Bruk pinsett og beger laget av rustfritt stål eller glass. Bruk inverterte pinsett for et trygt grep (f.eks. modell R3 SA har en lav fjærkonstant).
<ol><li>Forbered RCA (ultrarent vann, hydrogenperoksid og ammoniakk (5:1:1)) løsning for å rengjøre glass og pinsett.</li>
	<li>Sett fartøyene i et beger og fyll det med RCA til glass eller pinsett er fullt dekket.</li>
	<li>Varm opp begeret fra trinn 2,2 i 1 t ved 80 °C.</li>
	<li>Skyll karene deretter med ultrarent vann til ingen skarp lukt er konstaterbar lenger (minst tre ganger).</li>
	<li>Tørt glass og pinsett i en ovn (120 °C).</li>
</ol>3. Tips funksjonalisering
MERK: Alle trinn skal utføres i en røykhette for å unngå innånding av organiske damper. I tillegg er hansker, labfrakk og øyebeskyttelse nødvendig. Bruk nitril- eller latekshansker for hvert trinn for å unngå kontaminering. Bruk løsemiddelbestandige hansker når du bruker toluen. Alle trinn, med mindre annet er spesifisert, gjøres ved RT. Bruk ferskt utstyr og hansker for hvert trinn for å unngå mulig krysskontaminering.
<ol><li>Utfør overflateaktivering ved å bruke oksygenplasma på AFM cantilever chip MLCT-Bio-DC. MERK: Effektiviteten av plasmabehandlingen for ytterligere funksjonaliseringstrinn skalerer med oksygeninnholdet i plasmakammeret.<ol>
<li>Bruk nyrengjortpiner til å plassere AFM cantilever chips i et plasmakammer (40 kHz, 600 W).</li>
		<li>Bruk spesialmodifisert aktiveringsprogram: evakuering (0,1 mbar) – flom med oksygen til et trykk på: 0,2 mbar (4 min) – plasmaprosess (strøm: 40%, varighet: 2 min, prosesstrykk: 0,2 mbar).</li>
		<li>Ventiler kammeret og fortsett med trinn 3.2.2 umiddelbart for å forhindre adsorpsjon av forurensninger til AFM cantilever chips fra luft.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanization og PEGylation MERK: Timing er en kritisk parameter mellom trinnene. Forbered løsningene så friske som mulig i ventetiden. Maleimide grupper er underlagt hydrolyser i vandige medier og tioler lett bli oksidert til disulfider i løsning33,47 hindrer AFM tips funksjonalisering reaksjoner.<ol>
<li>Forbered en silane-PEG-mal oppløsning i toluen (1,25 mg/ml) i løsemiddelbestandige plast- eller glassrør og hell 6 ml av oppløsningen i flate Petri-retter, 3 ml hver. MERK: Hvis binding av flere probepolymerer observeres i SMFS-eksperimentet, kan blanding av silane-PEG-mal med ikke-funksjonell silane-PEG redusere antall forankringspunkter. For justering av passiviseringslaget PEG med forskjellige masser (dvs. konturlengder) kan brukes27.</li>
		<li>Inkuber AFM cantilever chips umiddelbart etter trinn 3.1.3 i silane-PEG-mal løsning (opptil 10 chips per Petri parabolen) for 3 t ved 60 °C35.</li>
		<li>Ta Petri retter ut av ovnen og la løsningen avkjøles i minst 10 min.</li>
		<li>Skyll hver AFM cantilever chip nøye. Reduser virkningen av kapillærkrefter på AFM cantilever når du passerer luftløsningsgrensesnittet, for eksempel ved å vippe disse sjetongene litt når de fordyper seg i løsningen.<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer, skyll tre ganger med toluen.</li>
			<li>For PNiPAM polymer, skyll en gang med toluen og to ganger med etanol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Velg minst to AFM cantilever chips som kontroll AFM cantilever chips, hoppe trinn 3.3 og skyll dem som følger for å øke polariteten av løsemiddel:<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer, skyll to ganger med etanol og en gang med ultrarent vann.</li>
			<li>For PNiPAM polymer, skyll to ganger med ultrarent vann. MERK: Kontroll av AFM cantilever-brikker har gått gjennom alle funksjonaliseringstrinn unntatt polymervedlegget (trinn 3.3). De tjener til å bevise rensligheten av funksjonaliseringsprosessen, AFM cantilever chip holder system, overflater og løsemidler som brukes for SMFS eksperimentet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kovalent polymer vedlegg MERK: Selv om AFM cantilever-spissen forventes å være fullstendig dekket med maleimidegrupper, er det bare noen få bindende steder for enkeltsondepolymeren, fordi maleimide gjennomgår hydrolyser i vann som fører til inaktive PEGs47. Disse inaktive PEGs fungerer som et passiviseringslag, som beskrevet ovenfor.<ol>
<li>Inkuber AFM cantilever chips rett etter trinn 3.2.5 i en av følgende polymer løsninger i 3 ml Petri retter. Hvis den respektive polymeren ikke oppløses riktig, bruk et 40 °C-vannbad og rør oppløsningen godt. MERK: Da bruk av tiol avsluttet polymerer kan føre til dannelse av disulfidbindinger som hindrer reaksjonen med de maleimide gruppene av silane-PEG-mal, anbefales et reduksjonsmiddel, spesielt hvis trinn 3.3 påføres i vandige buffere for vannløselige polymerer33.<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer, bruk en konsentrasjon på 1,25 mg/ml i toluen i 1 t ved 60 °C.</li>
			<li>For PNiPAM polymerer, bruk en konsentrasjon på 1,25 mg/ml i etanol for 3 timer ved RT. MERK: Hvis binding av flere probepolymerer observeres i SMFS-eksperimentet, bør konsentrasjonen av polymeren reduseres.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Skyll forsiktig hver AFM cantilever chip.<ol>
<li>For PEG- og PS-polymerer skyller du to ganger med toluen, to ganger med etanol og en gang med ultrarent vann etter 10 minutter nedkjøling.</li>
			<li>For PNiPAM polymerer, skyll to ganger med etanol og to ganger med ultrarent vann.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Oppbevar hver AFM cantilever chip separat i en liten (1 ml) Petriskål fylt med ultrarent vann ved 4 °C til bruk i et eksperiment.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Overflateforberedelse
<ol><li>Silisiumoksid wafer MERK: Denne overflaten ble brukt til SMFS med PEG og PNiPAM.<ol>
<li>Skjær et silisiumoksid wafer i små biter ved hjelp av en diamantkniv.</li>
		<li>Sett silisiumoksidbitene separat i mikrocentrifugerør og fyll disse rørene med etanol.</li>
		<li>Sonicate silisiumoksid stykker i 10 min.</li>
		<li>Skyll silisiumoksidbitene med etanol to ganger og tørk dem forsiktig under en nitrogenstrøm. Bruk silikonoksidbitene umiddelbart.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selvmontert monolayer av hydrofobe alkane thiol på gull (SAM) MERK: Denne overflaten ble brukt til SMFS med PS. Se litteratur39,49 for mer informasjon om SAMs.<ol>
<li>Bruk en gullbelagt silisiumwafer (A [100], 5 nm titan, 100 nm gull) til å utføre trinn 4.1.1 – 4.1.4.</li>
		<li>Inkuber overflatebitene i en 1-dodekaniooppløsning (2 mM) i 18 timer.</li>
		<li>Skyll de nylagde SAM-ene i etanol to ganger.</li>
		<li>Tørre SAMs med nitrogenstrømning for direkte bruk eller oppbevar dem i etanol i opptil 4 dager for senere bruk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Datainnsamling
MERK: Alle målinger vist her ble utført i ultrarent vann med en Cypher ES AFM ved hjelp av et varme- og kjøleprøvestadium for temperaturvariasjon. Generelt kan alle AFMs som gir mulighet til å måle i væsker brukes.
<ol><li>Sett den funksjonaliserte AFM cantilever-brikken inn i AFM.</li>
	<li>Lim den tilberedte overflaten i en prøveholder som er egnet for måling i væsker (f.eks. høyoppløselig replikering stilbeting e10RF eller et UV herdbart klebemiddel). MERK: Disse bindingsmidlene er svært inerte og motstandsdyktige mot et stort antall polare løsemidler. Motstanden til limet mot ikke-polare løsemidler (f.eks. toluen eller heksan) eller høye temperaturer bør kontrolleres før bruk.</li>
	<li>Senk AFM cantilever-brikken og probeprøven i væsken, her: ultrarent vann. MERK: En løsningsmiddeldråpe (ca. 100 μL) kan deponeres på AFM cantilever-chipholderen. Dekker AFM cantilever chip med løsemiddel reduserer kapillær krefter, som ellers ville fungere på AFM cantilever når du nærmer prøveoverflaten passerer gjennom luftløsningsmiddelgrensesnittet.</li>
	<li>Juster om nødvendig temperaturen og la systemet likevekt. MERK: Temperaturendringer kan føre til avbøyning av AFM-cantilever på grunn av en bimetallisk effekt for AFM cantilevers med et reflekterende belegg som aluminium eller gull. Likevekt bør utføres bort fra overflaten (flere μm) inntil det ikke observeres ytterligere endring av nedbøyningssignalet (opptil 15 min for MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Varier temperaturen tilfeldig for å utelukke eventuelle effekter av aldring av funksjonaliseringen. Pass på at temperaturene som påføres ikke fører til en irreversibel bøyning av AFM cantilever. MERK: Eventuelle temperatureffekter på løsemiddelegenskaper (for eksempel fordampning eller endringer i viskositet) kan hemme eksperimentene dine. I de presenterte eksemplene var temperaturen variert over en rekkevidde på opptil 40 K i trinn på 10 K tar vann som løsemiddel (f.eks. fra 278 K til 318 K).</li>
	<li>Nærmer deg overflaten for å bestemme InvOLS (inverse optisk spakfølsomhet) ved å ta kraftforlengelseskurver på en hard overflate (for eksempel silisiumoksid). For dette, ta avbøyningssignalet til fotodetektoren (i V) vs piezoavstand og bestem skråningen av delen som representerer innrykk av AFM cantilever spissen inn i den underliggende overflaten (frastøtende regime) ved hjelp av en lineær funksjon. For å redusere feil, ta gjennomsnittet av minst fem verdier for å oppnå den endelige InvOLS-verdien. For ytterligere detaljer, se litteraturen4,39. MERK: InvOLS kan bare bestemmes pålitelig på harde overflater. I tilfelle eksperimenter på myke overflater eller grensesnitt sørger for at du plasserer en hard overflate nær myke overflater. Deretter kan InvOLS-kalibreringen gjøres før eller etter dine myke overflateeksperimenter uten behov for å demontere AFM-oppsettet.</li>
	<li>For vårkonstant bestemmelse, flytt AFM cantilever til en høyde med verken attraktive eller frastøtende interaksjoner mellom AFM cantilever tips og overflate (flere μm). Deretter registrerer du et termisk støyspektrum der strømspektraltettheten (PSD) vs frekvens er plottet. Følgende trinn utføres vanligvis av automatiserte innebygde funksjoner i kommersiell AFM-programvare: For det første analyseres det oppkjøpte termiske støyspekteret ved å tilpasse en funksjon til PSD, for eksempel en enkel harmonisk oscillator (SHO). Passformen gjøres opp til minimum mellom første og andre resonans. For det andre bestemmes området under den monterte delen av PSD vs frekvensplottet som representerer gjennomsnittlig firkantet forskyvning av AFM-cantilever i vertikal retning. Til slutt brukes likeskilleteoremet til å få AFM cantilever force constant28,50. MERK: Et passende frekvensområde bør brukes bestående av den første resonanstoppen av AFM cantilever. For å få et tilfredsstillende signal-til-støy-forhold, bør minst 10 PSD-er akkumuleres med høyest mulig frekvensoppløsning.</li>
	<li>Start eksperimentet. Record force kart ved å ta force-extension kurver på en rutenett-lignende måte (f.eks 10 x 10 poeng for et område på 20 x 20 μm2) for å unngå lokale overflateeffekter (f.eks, urenheter, dislokasjoner) og til gjennomsnittlig ulike overflateområder. MERK: Typiske parametere er en trekkhastighet på 1 μm/s og en samplingsfrekvens på 5 kHz for å sikre tilstrekkelig oppløsning. Samplingsfrekvensen bør tilpasses når trekkhastigheten er variert. Trekkavstanden skal tilpasses konturen eller desorpsjonslengden til den målte polymeren (ca. dobbelt så lang).</li>
	<li>Bruk og varier dveletiden mot overflaten slik at enkeltpolymeren kan feste seg til overflaten (vanligvis 0 – 5 s).</li>
	<li>Gjenta bestemmelseav InvOLS og fjærkonstanten på slutten av eksperimentet for å kontrollere konsistensen og stabiliteten til systemet. MERK: For sterk vedheft mellom polymer og overflate kan kalibreringen gjøres etter selve eksperimentet for å bevare funksjonaliseringen.</li>
</ol>6. Dataevaluering
MERK: For dataevaluering ble en spesialskrevet programvare basert på Igor Pro brukt til å utføre følgende trinn.
<ol><li>Konverter det rå nedbøyningssignalet (i Volt) til kraftverdier (i Newtons) ved multiplikasjon med den registrerte InvOLS og den bestemte fjærkonstanten.</li>
	<li>Trekk nedbøyningen av AFM cantilever (etter multiplikasjon av det rå nedbøyningssignalet med InvOLS) fra avstanden drevet av piezoelementene i vertikal retning for å oppnå den sanne forlengelsen (spissoverflateavstand)4.</li>
	<li>Korriger kraftforlengelseskurvene som er oppnådd for drift ved å tilpasse en lineær funksjon til grunnlinjen etter den siste hendelsen og trekke det samme fra kraftforlengelseskurven. Den monterte delen skal representere en tilstrekkelig forlengelse fra overflaten der verken attraktive eller frastøtende interaksjoner observeres mellom AFM cantilever-spiss og underliggende overflate. Deretter settes opprinnelig plan for nullaksen. MERK: Ved målinger på svært reflekterende overflater som gull, kan det oppstå forstyrrelser. Disse skyldes delvis refleksjon av laserstrålen fra overflaten og fra baksiden av AFM cantilever. Så, de oppnådde force-forlengelse kurver kan vise en sinusoidal kraft signal artefakt langs vertikal forlengelse. Dette er en artefakt som hindrer de endelige kraftverdiene. For å fortsatt ta hensyn til disse kraftforlengelseskurvene, er en korreksjon mulig (figur 2).</li>
	<li>Hvis forstyrrelsene vises i kraftforlengelseskurvene, velger du en representativ kraftutvidelseskurve (tilbaketrekkingskurve) som ikke viser andre hendelser enn muligens en topp med uspesifikk vedhesjon og samme sinusiotale artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2A). MERK: Jevn ut den representative kraftforlengelseskurven for å oppnå det lave frekvensmønsteret til interferensen.</li>
	<li>Velg en kraftutvidelseskurve som skal korrigeres (Figur 2B).</li>
	<li>Overlegg begge kraftforlengelseskurver fra trinn 6.4. og 6,5. for å sikre at begge viser samme sinusiolale artefakt (dvs. amplitude og fase) (figur 2C).</li>
	<li>Trekk den (glatte) representative kraftforlengelseskurven fra kraftforlengelseskurven som skal korrigeres, noe som fører til en rett i stedet for en sinusoidal grunnlinje (figur 2D). MERK: Pass på at den uspesifikke vedhemingstoppen i den representative kurven er forskjellig fra enkeltmolekylhendelser som vises i kurvene som skal korrigeres. Faktisk er valget av den representative kurven avgjørende for en riktig korreksjon.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomisk interesse.

AFM-baserte SMFS er et av de viktigste verktøyene for å undersøke enkeltmolekylinteraksjoner i polymerfysikk. For et ekte enkeltmolekyleksperiment er kovalent tilknytning av sondepolymeren til en AFM-cantilever-spiss avgjørende.
Mange tidligere verk er basert på nanofiskeeksperimenter, spesielt for PNiPAM, hvor polymerer adsorseres på en overflate og deretter strekkes ved å tilfeldig plukke dem fra substratet ved hjelp av en AFM cantilever tips30,31. Dette kan endre resultatene og føre til feiltolkning av enkeltmolekylatferd. Der kan samarbeidseffekter dominere resultatene fordi interaksjoner med nærliggende polymerer ikke kan utelukkes. Dette har stor innvirkning på resultatene, spesielt for polymerer som viser betydelig forskjellig oppførsel i bulk sammenlignet med enkelt isolerte molekyler57,58.
Funksjonaliseringsprotokollen som presenteres her er pålitelig og kan lett brukes på forskjellige polymerer, uavhengig av konturlengde, hydrofobiitet eller den steriske hindringen av monomerene. I tillegg er det gitt en passivisering for å forhindre uønskede interaksjoner mellom enkeltprobepolymeren og AFM-cantilever-spissen, samt mellom AFM-cantilever-spissen og den underliggende overflaten. Videre vises evalueringen av kraftutvidelseskurver som viser strekkhendelser. Der foreslås det en prosedyre for fastsettelse av master force-extension kurver. Dette gir et bedre middel til å avsløre, for eksempel temperaturrelaterte effekter på kraftforlengelsesatferden. Videre er analysen av enkeltmolekyl desorpsjonhendelser med konstant kraftplatåer gitt. Også en enkel måte å korrigere sinusikotale kraftsignalartefakter i kraftforlengelseskurver er gitt som ellers kan svekke resultatene av eksperimentet.
Sammenlignet med Stetter et al.39, er funksjonaliseringsprosedyren som presenteres her redusert til tre trinn i stedet for fire og robustheten i prosedyren forbedres. Den store fordelen med å utføre PEGylation og silanization i ett trinn er å ha en bedre kontrollert reaksjon og å øke utbyttet. Videre må færre løsninger være forberedt og det kreves færre sneringsskritt. Dette reduserer innsatsen og tiden for forberedelse og øker reproduserbarheten. Videre er flytting av AFM-cantilevers alltid en kritisk del av funksjonaliseringsprosessen. En overføring fra en løsning til den andre risikerer alltid å påvirke funksjonaliseringskvaliteten på grunn av overføringer gjennom luftvanngrensesnittet eller for å miste AFM-cantilevers ved feil bruk av pinsett.
For å bevise riktig kovalent vedlegg av en enkelt polymer til en AFM cantilever tips forskjellige forhold må oppfylles. For det første er kontroll-AFM-cantilevers av betydelig betydning og bør være forberedt på hver funksjonalisering. Tilpasningsprosessen og væskecellen for å utføre eksperimentene anses bare å være rene, hvis et lite antall kraftutvidelseskurver viser strekninger eller platåer i kontrolleksperimentet (i de presenterte eksemplene mindre enn 2%).
Et klart strekkmønster uten ytterligere dråper eller maxima er avgjørende for å ha riktige enkeltmolekylsstretchinghendelser. I tillegg bør avhengigheten av bruddkraft på kraftbelastningshastigheten ved brudd eller fullstendig elastisk respons fra strekkkurven analyseres for å utelukke samtidig desorpsjon av flere polymerer59,60. For PEG og PNiPAM viste 19 % og 42 % av kraftforlengelseskurvene som ble tatt i forskjellige posisjoner av overflaten, et slikt strekkmønster. For å oppnå strekkhendelser må kissisorpsjonen av polymeren til den respektive underliggende overflaten være sterk. Ellers observeres en platålignende desorpsjonshendelse. Dette er enda mer avgjørende for påvisning av strekkhendelser ved høye krefter (opptil 500 pN eller mer). Siden denne sterke fysisorpsjonen ikke oppfylles for hver kraftforlengelseskurve, er utbyttet av slike hendelser mindre enn for rene platålignende desorpsjonshendelser. Som et alternativ kan sterkt befølgegrupper som kategorikoler eller chemisorption mellom polymer og underliggende overflate brukes. Dette krever imidlertid innføring av ytterligere funksjonelle grupper eller koblingssteder vedpolymer61,62.
Faktisk gir massen (dvs. konturlengde) av polymeren et verdifullt fingeravtrykk. Selv om massen ikke direkte kan oversettes til den målte konturlengden av følgende grunner, er lengdefordelingen svært verdifull for å definere enkeltmolekylhendelser. I tilfelle av en PNiPAM polymer medƉ lav polydispersitet ( 1,28), fant vi betydelige forskjeller i forlengelsesverdiene for de oppnådde strekkhendelsene (og dermed i polymerlengden) i forsøkene. En grunn til dette kan være fastsettelse av polymerlengden og dens fordeling. I størrelse-eksklusjon kromatografi (SEC), bestemmes en relativ vekt av målpolymeren i forhold til standarder som PS eller poly (metylmetakrylat) (PMMA)63. Den antatte relative vekten forventes å avvike fra den absolutte molekylvekten fordi den hydrodynamiske radiusen til målpolymeren og standarden kan variere betydelig. I tillegg kan silane laget bli oligomerized av falskt vann i toluen under funksjonaliseringsprosessen. Vedlegget av slike oligomers til AFM cantilever tips fører til et mer fleksibelt lag med færre ankerpunkter64. Også festepunktet til polymeren til silisiumlaget kan ikke nødvendigvis være på toppen som fører til et skifte av de oppdagede lengdeverdiene29. Mens en polymermodell som ormlignende kjede (WLC) eller den fritt felles kjede (FJC) modellen ikke kan reprodusere den respektive kraftforlengelsesvirkemåten for PEG eller PNiPAM riktig over hele forlengelsesområdet18,,29,41,65,66, kan en slik polymermodell være verdifull for andre polymere og proteinsystemer10,15,67,68.68
Kovalent vedlegg av en enkelt PS polymer (med en konturlengde på mer enn 1 μm) anses bare å være vellykket, når et betydelig antall kraftforlengelseskurver viser et langt nok platå med konstant kraft (figur 5). Et platå som følge av desorbing en enkelt polymer er definert av en enkelt skarp dråpe av en konstant kraft til baseline ved en viss forlengelse, som gitt i figur 5A. Hvis flere polymerer er festet til AFM cantilever-spissen, observeres en kaskade av platåer56 (figur 5C). Platålengden (desorpsjonslengde), korrelerer med polymerkonturlengden51,må være betydelig lengre enn noen vedhefttopp på grunn av uspesifikk vedheft av AFM cantilever-spissen til den underliggende overflaten (her rundt 200 nm). Funksjoner som vises utelukkende i en enkelt kraftforlengelseskurve, bør ikke tolkes. I de presenterte eksperimentene viste minst 80 av 100 kurver et platå som varer lenger enn 200 nm i minst to kraftkart på to forskjellige steder på overflaten. Videre avslører fordelingen av desorpsjonslengder, ved hjelp av scatter-plott som gitt i figur 5B og 5D,om og hvor mange polymerer som er bundet til AFM cantilever-spissen. I tilfelle av PS fungerte en smal fordeling av desorpsjonskraft og lengde tatt fra platåer av kraftforlengelseskurvene som bevis på et vellykket kovalent vedlegg. Dette viste endelig suksessen til funksjonaliseringsprotokollen. Dermed anbefaler vi på det sterkeste å presentere slike kraft- og lengdefordelinger i publikasjoner.
Evaluering av kraftutvidelseskurver ved hjelp av innebygde algoritmer som utgjør mange forhåndsinnstilte parametere, bør gjøres med forsiktighet. Årsakene er for eksempel at en fast samplingsfrekvens ikke passer for hver brukt trekkhastighet, eller at en automatisert utjevning av kraftforlengelseskurvene kan gjennomsnittlig ut viktige detaljer. Vanligvis kan en riktig forståelse av den respektive evalueringsprosedyren forhindre feil i evalueringsprosedyren, noe som igjen kan påvirke de endelige funnene fra et AFM-basert SMFS-eksperiment sterkt.
Oppsummert presenterer vi en funksjonaliseringsprotokoll som er pålitelig og lett kan brukes på en rekke polymerer. Videre presenteres riktig evaluering av enkeltmolekylkraftforlengelseskurver, noe som tillater bestemmelse av fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde. De presenterte protokollene og prosedyrene er verdifulle for undersøkelse av stimuli-responsive systemer på enkeltmolekylnivå.

Siden oppfinnelsen på 1980-tallet1har atomkraftmikroskopet (AFM) blitt en av de viktigste bildeteknikkene i naturvitenskap med subnanometer romlig oppløsning, sub-piconewton kraftoppløsning og muligheten for måling i ulike løsemiddel- og temperaturforhold2,3,4,5,6,7.
Bortsett fra bildebehandling8,9, AFM brukes til å utføre enkelt molekyl kraft spektroskopi (SMFS) gir innsikt i klebende interaksjoner mellom en enkelt polymer og overflater, fysiske egenskaper av enkelt polymerer og utfoldende mekanismer av proteiner7,10,11,12,13,14,15,16. I et vanlig SMFS-eksperiment blir den funksjonaliserte cantilever-spissen brakt i kontakt med en overflate slik at polymeren ved AFM cantilever tipper fysisorber til denne overflaten. Ved å trekke Tilbake AFM cantilever spissen fra overflaten, en endring i nedbøyning av AFM cantilever konverteres til en kraft som fører til en kraft-forlengelse kurve4. Fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde kan bestemmes som avhengig av ulike parametere som trekkhastighet, botid på overflaten, innrykkdybde inn i overflaten, temperatur, løsningsmiddel17,18 og forskjellige overflater som faste underlag, polymerfilmer eller støttet lipidbilag19,,20,,21,,22. Videre kan en polymer undersøkes i forskjellige romlige retninger, og dermed undersøke friksjonsegenskapene til polymeren23,24,25,26.
En kovalent tilknytning av den undersøkte polymeren til en AFM cantilever tips er avgjørende for slike studier. Dermed forhindrer et høyt utbytte av enkeltmolekylhendelser med en og samme polymer bundet til en AFM cantilever tips noen skjevhet av resultatene på grunn av kalibrering av fjærkonstanten av AFM cantilever27,28, varierende festepunkter29 eller varierende polymerer (med forskjellige konturlengder) som i tilfelle nanofiskeeksperimenter30,31,32. Også interaksjoner med andre polymerer samt snitteffekter kan forebygges mye18,28. For kovalent vedlegg av en polymer til AFM cantilever tips, ulike typer kjemiske modifikasjoner kan brukes, hvorav mange er oppsummert i boken av Hermanson33. Amine og tiol-baserte koblingreaksjoner samt klikkkjemi representerer de mest brukte metodene i AFM cantilever tips funksjonalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 viser hvordan du bruker 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) / NHS kjemi for å feste et protein til en AFM cantilever tips. Men de nevnte funksjonelle gruppene har en tendens til å krysskoble, og dermed fører til tap av funksjonalitet43,44. Også karbodiimides viser en tendens til rask hydrolyser i løsning43. Maleimide og tiol grupper er generelt mer stabile og viser ikke krysskoblinger reaksjoner. Den presenterte protokollen er en optimalisering av tidligere publiserte protokoller gitt i referanser35,39.
Her presenteres en pålitelig funksjonaliseringsprotokoll som enkelt kan justeres til et stort antall forskjellige polymerer, uavhengig av egenskaper som konturlengde eller hydrofobiitet. Tre forskjellige polymerer ble valgt som eksempel: hydrofil polyetylenglykol (PEG) og poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) samt høy molar masse hydrofobe polystyren (PS). For å sikre en kovalent bindende evne med et passende linkermolekyl, ble de tre polymerene valgt for å ha en telechelsk tiol moiety som funksjonell sluttgruppe. Linkermolekylet i seg selv er vanligvis en kort PEG-polymer med to aktive steder, en silane-gruppe i den ene enden og en maleimidgruppe i den andre enden. Førstnevnte muliggjør et kovalent vedlegg til AFM cantilever-spissen og sistnevnte en bindende reaksjon med den tiolske gruppen av den funksjonaliserte høy molarmassepolymeren. Videre fungerer inaktive PEG linker molekyler som et passiviseringslag for å forhindre uønskede interaksjoner mellom sondepolymeren og AFM-cantilever-spissen, samt mellom AFM-kantileverspissen og den underliggende overflaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

Atomkraftmikroskopi (AFM)-basert enkeltmolekylkraftspektroskopi er et ideelt verktøy for å undersøke interaksjonene mellom en enkelt polymer og overflater. For et ekte enkeltmolekyleksperiment er kovalent tilknytning av sondemolekylet avgjørende fordi bare da kan hundrevis av kraftforlengelsesspor med ett og samme enkeltmolekyl oppnås. Mange spor er i sin tur nødvendig for å bevise at et enkelt molekyl alene er undersøkt. I tillegg er passivisering avgjørende for å forhindre uønskede interaksjoner mellom enkeltprobemolekylet og AFM cantilever-spissen, samt mellom AFM-cantilever-spissen og den underliggende overflaten. Funksjonaliseringsprotokollen som presenteres her er pålitelig og kan enkelt brukes på en rekke polymerer. Karakteristiske enkeltmolekylhendelser (dvs. strekninger og platåer) oppdages i kraftforlengelsessporene. Fra disse hendelsene kan fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde oppnås. Dette er spesielt viktig for den nøyaktige undersøkelsen av stimuli-responsive systemer på enkeltmolekylnivå. Som eksemplariske systemer poly(etylen glykol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) og polystyren (PS) er strukket og desorbed fra SiOx (for PEG og PNiPAM) og fra hydrofobe selvmonterte monolayer overflater (for PS) i vandig eskeidige omgivelser.

Eksemplene nedenfor viser resultater av enkeltmolekylsstrekking og desorpsjon av polymerene PEG, PNiPAM og PS. Alle AFM cantilever tips ble funksjonalisert med protokollen gitt ovenfor. PEG og PNiPAM ble målt på SiOx med temperaturvariasjon. For en detaljert diskusjon om de resulterende temperaturavhengige strekkkurvene for PEG og PNiPAM, se Kolberg et al.18 Et annet kraftforlengelsesmotiv er et platå med konstant kraft (f.eks. når de sorbing PS fra selvmonterte monolag av metyl avsluttet alkane thiols på gull (SAM) i vann4,,27,39,51).
Eksempel 1: Strekking av PEG og PNiPAM i vann Den temperaturavhengige strekkatferden i vann ble målt ved hjelp av enkelt PNiPAM og PEG polymerer som er kovalent bundet til en AFM cantilever-spiss i den ene enden og physisorbed på en SiOx overflate i den andre enden. Etter kalibrerings- og ren kontrolleksperimenter (mindre enn 2% av kraftforlengelseskurvene viser enkeltmolekylhendelser), ble minst to kraftkart registrert for hver AFM cantilever. Det temperaturavhengige eksperimentet ble utført ved å registrere minst ett kraftkart ved hver temperatur. Når bare få strekkhendelser dukket opp, ble den respektive AFM cantilever kassert og neste AFM cantilever av brikken ble tatt (vanligvis i rekkefølgen C, B, D og E av MLCT-Bio-DC). For de eksemplariske dataene til PEG ble det observert en enkelt strekkhendelse i 95 av 500 målte kraftforlengelseskurver (19 %). For PNiPAM viste 252 av 600 kraftforlengelseskurver et strekkmønster (42 %). For en bedre sammenligning av kraftforlengelseskurvene ble det generert en enkelt hovedkurve for hver temperatur. For dette formålet ble bare de kurvene med en strekkhendelse til minst 500 pN, hvor konformasjonssvingninger og løsemiddeleffekter er ubetydelige, valgt52. Det endelige antall strekninger tatt i betraktning var 3 på 278 K, 7 på 298 K og 4 ved 318 K for PEG og 4 på 278 K, 3 på 298 K og 3 på 318 K for PNiPAM18.
Fremgangsmåten for generering av hovedkurver er gitt i figur 3. De valgte kraftforlengelseskurvene (figur 3A) skaleres til en lengde L0 (forlengelse med en kraft på 500 pN), se figur 3B. Vedhefttoppen viser en stor variasjon av uspesifikk vedheft mellom overflaten og AFM-cantilever-spissen, men påvirker ikke polymerstrekkingens oppførsel. Etter sammenslåing av de omskalerte kraftforlengelseskurvene er de i gjennomsnitt med en binominell utjevning som presentert i figur 3C. For dette konvolerer et gaussisk filter dataene med normaliserte koeffisienter avledet fra Pascals trekant på et nivå som tilsvarer utjevningsparameteren 2053. Til slutt oppnås en masterkurve for hver temperatur som angitt i figur 3D. Zoom-in viser området der temperatureffekten på kraftforlengelsesvirkemåten er mest uttalt.
En sammenligning av temperaturvirkemåten til PEG (A) og PNiPAM (B) finnes i figur 4. For PEG ble det observert en reduksjon av strekkkraften med økende temperatur. En økning på ca. 5 % av omskalert forlengelse ved 100 pN ble observert ved økning av temperaturen fra 278 til 318 K. For PNiPAM kan et motsatt temperaturavhengig skifte avsløres. En reduksjon på ca. 1 % av omskalert forlengelse ved 100 pN ble observert da temperaturen ble økt fra 278 til 328 K. I tillegg kunne den strekkfrie energien oppnås fra kraftforlengelsesmasterkurvene ved å bestemme området under kurven for en gitt kraftverdi. Dette kan brukes til å trekke ut energiske og entropiske bidrag av den strekkfrie energien ved hjelp av molekylærdynamikk (MD) simuleringer18.
Eksempel 2: Desorps jon av PS fra en SAM-overflate i vann Desorps' desorps fra en SAM-overflate i vann kan brukes til å bestemme desorpsjonskraften og lengden og dermed kvantifisere hydrofobe interaksjonen. Etter kalibrering ble minst to kraftkart registrert på to forskjellige steder på overflaten. Når polymervedlegget var vellykket, viste kraftforlengelseskurvene platåer av konstant kraft, som karakteristisk egenskap, se figur 5A og figur 5C. Platålignende desorpsjon observeres når dynamikken i probede bindinger er mye raskere enn trekkhastigheten til AFM cantilever-spissen (kvasi-likevekt). Desorpsjonskrefter av platålignende kraftforlengelseskurver gir direkte vedhendefrie energier ved å integrere kraftforlengelsessporet54. De har blitt brukt til å bestemme elektrostatiske, dispersive og hydrofobe interaksjoner samt friksjonsegenskaper av enkeltpolymerer på overflater i flytende miljø2,,4,,23,,51,,54,55.
Hvert platå med konstant kraft ble utstyrt med en sigmoidal kurve for å bestemme desorpsjonskraft og desorpsjonslengde, som deretter ble plottet i histogrammer. Histogrammene var utstyrt med en gaussisk for å trekke ut maksimal verdi og standardavvik. For en bedre oversikt ble desorpsjonskraften og lengdeverdiene vist sammen i et scatter-plott, som angitt i figur 5B og figur 5D.
For polystyren på SAM i vann tilsvarer de bestemte desorpsjonskreftene tidligere oppnådde verdier19,23. Som desorpsjonslengden korrelerer med polymerkonturlengden51,kan desorpsjonslengdefordelingen brukes som et bevis på den kovalente bindingen av den respektive polymeren til AFM cantilever-spissen via sin funksjonelle sluttgruppe. Dermed fungerer desorpsjonslengden som et fingeravtrykk.
For mer enn én polymer festet til AFM cantilever spissen, kan kaskader av platåer (diskrete trinn) observeres i kraftforlengelseskurvene56. Hvert platå representerer desorpsjon en polymer ved en annen forlengelse. Eksperimentet gitt i figur 5C og figur 5D viste et typisk tilfelle av to polymerer festet til AFM cantilever tips samtidig. Ved å montere det endelige bruddet, kunne det bli funnet en bimodal fordeling for desorpsjonslengden, mens desorpsjonskraften viste en smal fordeling. I dette tilfellet kan den mindre desorpsjonslengden bli funnet i 90% av kraftforlengelseskurvene, enten som et enkelt platå eller som et ekstra platå på lengre platå, som gitt i figur 5C. Den høyere desorpsjonslengden ble funnet i 37% av de oppnådde kraftforlengelseskurvene. Dermed kan desorpsjonslengdefordelingen brukes til å bestemme antall forskjellige polymerer festet til AFM cantilever-spissen. Generelt er en smal fordeling av desorpsjonslengdeverdiene en god indikasjon på at en og samme enkelt polymer ble undersøkt i de oppnådde kraftforlengelseskurvene. Samtidig kan en superposisjon av de respektive krefter-utvidelsen brukes til å avgjøre om en og samme enkelt polymer er målt.
Etter å ha bevist kovalent binding av en enkelt PS polymer, kan ytterligere eksperimenter med denne PS polymer utføres varierende substrat (solid overflate samt polymerfilmer), løsemiddelforhold, temperatur, trekkehastighet eller botid.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over tipsfunksjonaliseringsprosessen. Inkluderer kjemisk modifisering av AFM cantilever tips etter (1) plasmaaktivering (2) silanization / PEGylation og (3) polymer vedlegg. I tillegg vises de detaljerte kjemiske strukturene til polymerene som brukes, nemlig PEG, PNiPAM og PS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Figur 2: Eliminering av forstyrrelser i kraftforlengelseskurver. (A)Finn en kraftforlengelseskurve som viser en sinusoidal kraftsignalartefakt langs utvidelsen, men som ikke har noen enkelt molekylstrekkhendelse. (B) Velg en kraftforlengelseskurvemed en enkelt molekylhendelse, som skal korrigeres fra den sinusikale artefakten. (C) Overlegg kurvene for å kontrollere om de sinusikale artefaktene i kurvene virkelig samsvarer. (D) Ved å trekke kraftforlengelseskurven (A) fra (B) oppnås en kraftforlengelseskurve med en rett grunnlinje. Selv om vedhemingstoppen ikke kan brukes til videre analyse, er kraftforlengelseskurven nå korrigert for artefakten som fører til mye mer nøyaktige kraftverdier i regionen av enkeltmolekylhendelsen (her: > 0,2 μm forlengelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Figur 3: Fastsettelse av masterkurver fra kraftforlengelseskurver av PEG ved 298 K. (A) Eksperimentelle data på 298 K, ved hjelp av 7 kraftforlengelseskurver. Etter omkalking til en lengde L0 med en kraft på 500 pN (B), kan kraftforlengelseskurvene slås sammen og i gjennomsnitt ved binominell utjevning som får en hovedkurve (C). De omskalerte kurvene gis som prikker mens hovedkurven vises som en heldekkende linje. Til slutt kan de oppnådde masterkurvene for ulike temperaturer sammenlignes (D). Zoom-in indikerer området der temperatureffekten på kraftforlengelsesvirkemåten er mest uttalt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Figur 4: Sammenligning av temperaturavhengige hovedkurver av PNiPAM og PEG. For PEG observeres det en økning av omskalert forlengelse ved 100 pN (mellomkraftområde) ved økning av temperaturen (A),mens for PNiPAM avsløres et motsatt temperaturavhengig skifte (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Figur 5: Analyse av kraftforlengelseskurver av PS på SAM i vann. (A) Eksemplarisk kraftforlengelseskurve (blå) med sigmoidal passform på platået (lilla). I tillegg markerer pilene den bestemte kraften (rød) og lengden (grønn) på platået. Desorpsjonskraften og desorpsjonslengdeverdiene oppnådd av sigmoidal passer vises i en scatter-tomt, og de resulterende histogrammene er utstyrt med en gaussisk. (B) De bestemte gjennomsnittlige verdiene for desorpsjonskraft og desorpsjonslengde er (112 ± 6) pN og (659 ± 7) nm, hvor 93 % av kraftforlengelseskurvene viser slike enkeltplatåhendelser. (C) Eksemplarisk kraftforlengelseskurve (blå) for to polymerer festet til AFM cantilever-spissen samtidig. Her viser desorpsjonskraften en unimodal fordeling med en gjennomsnittlig kraftverdi på (117 ± 5) pN, mens en bimodal fordeling kan finnes for desorpsjonslengden som fører til gjennomsnittlige lengdeverdier på (656 ± 9) nm og (1050 ± 16) nm. (D) 90% av de samplede kraftforlengelseskurvene viser bare enkeltplatåhendelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Kovalent vedlegg av sondemolekyler til atomkraftmikroskopi (AFM) cantilever tips er en viktig teknikk for undersøkelse av deres fysiske egenskaper. Dette gjør at vi kan bestemme strekkkraften, desorpsjonskraften og lengden på polymerer via AFM-basert enkeltmolekylkraftspektroskopi med høy reproduserbarhet.

Kovalent vedlegg av enkeltmolekyler for AFM-basert Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Enkelt molekyl kraft spektroskopi gjør oss i stand til å måle fysiske parametere som beskriver de mekaniske og selvklebende egenskapene til polymerer. Når du bruker AFM-basert kraftspektroskopi til å studere enkeltmolekyler, er det viktig å ha en pålitelig og effektiv protokoll for å binde disse molekylene kovalent til en AFM-kantileverspiss. Denne protokollen kan vedtas til mange forskjellige polymerer uavhengig av konturlengden eller hydrofobiiteten.Alle trinn bør utføres i en røykhette for å unngå innånding av organiske damper. I tillegg kreves løsemiddelbestandig glass, laboratoriefrakk og øyebeskyttelse. Bruk først nyrengjorte pinsett til å plassere AFM cantilever chips i plasmakammeret.Start plasmakammerets overflateaktiveringsprogram ved å velge start og deretter ja. Kontroller at plasmaprosessen fungerer som den skal. En plasmaprosess med høyt oksygeninnhold viser en lyseblå farge.Mens overflateaktiveringsprogrammet utfører, oppløs silane-PEG-mal i toluen for å oppnå en konsentrasjon på 1,25 milligram per milliliter. Legg tre milliliter av løsningen i en flat petriskål. Etter at plasmaprosessen er fullført, ventiler plasmakammeret ved å velge bekreft og deretter lufting.Fortsett umiddelbart til neste trinn for å forhindre absorpsjon av forurensninger. Legg sjetongene i petriskålen og inkuber sjetongene i tre timer ved 60 grader Celsius. Fjern petriskålen fra ovnen og la den avkjøles i minst 10 minutter.Skyll deretter sponene. For PEG- eller polystyrenbinding må du skylle sponene med toluen tre ganger. For polynipambinding skal chips skylles en gang med toluen og to ganger med etanol.For å redusere virkningen av kapillære krefter på AFM-cantileveren, vipp sjetongene litt ved skylling. AFM cantilever chips må skylles riktig for å fjerne overflødige fysiske polymerer som kan påvirke eksperimentet. Skylling bør utføres nøye for å forhindre skade på AFM-kantilevers.Til slutt, forberede minst to chips for å tjene som kontroller som ikke vil gjennomgå kovalent polymer vedlegg. For kontroller versus PEG og polystyren chips, skyll to ganger med etanol og en gang med vann. For kontroller versus polynipam chips, skyll to ganger med vann.For å utføre kovalent vedlegg av PEG eller polystyren, klargjør tre milliliter polymeroppløsning i toluen med en konsentrasjon på 1,25 milligram per milliliter. Tilsett løsningen og chips til en petriskål og inkuber chips på 60 grader Celsius i en time. Etter inkubasjon med PEG eller polystyren, la sjetongene avkjøles i 10 minutter.Skyll potetgullene to ganger med toluen, to ganger med etanol, og en gang med vann. For å utføre kovalent vedlegg av polynipam, forberede tre milliliter polymer løsning i etanol i en konsentrasjon på 1,25 milligram per milliliter. Tilsett løsningen og sjetongene i en petriskål og inkuber sjetongene ved romtemperatur i tre timer.Etter inkubasjon med polynipam, skyll potetgullene to ganger med etanol og to ganger med vann. For å lagre chips til bruk i et eksperiment, plasser hver chip separat i en en en milliliter Petriskål fylt med vann. Hold Petri-rettene på fire grader Celsius.Først setter du den funksjonaliserte AFM-kantileverbrikken inn i en sjetongholder. Lim den tilberedte overflaten inn i en prøveholder som er egnet for målinger i væske. Bruk en pipette til å senke brikken i vann.Monter prøveoverflaten i AFM. Senk prøveoverflaten ned i vann. Koble sjetongholderen til AFM.Deretter nærmer brikken til prøveoverflaten. Bruk miljøpanelet til å stille inn måltemperaturen og slå på modusen og tilbakemeldingsradioknappene. La deretter systemet likevekt i ca 15 minutter.For å ta en kraftforlengelseskurve, nærmer du AFM-kantileverspissen til overflaten og velger enkelt kraft. Den resulterende kurven viser nedbøyningen mot piezo-avstanden med tilnærmingen til overflaten vist i rødt og tilbaketrekkingen vist i blått. Utvid den delen av kurven som representerer innrykk av AFM-kantilnustespissen inn i den underliggende overflaten.Hvis du vil utføre en lineær tilpasning, angir du markørene på enten tilnærmingen eller tilbaketrekkingskurven og velger oppdater INVOLS fra kontekstmenyen. Den resulterende verdien for den inverse optiske spakens følsomhetsverdi vises i panelet øverst til venstre. Etter å ha gjentatt denne prosedyren minst fem ganger, beregne et gjennomsnitt for omvendt optisk spak følsomhet og angi gjennomsnittet i panelet.Plasser AFM-kantileveren i en høyde på ca. 100 mikrometer over overflaten ved å velge flytt for å forhåndsinnføre. For å få et tilfredsstillende signal-til-støy-forhold for det termiske støyspekteret, sett snittantallet til minst 10 og velg høyest mulig frekvensoppløsning. Deretter registrerer du det termiske støyspekteret ved å velge fange opp termiske data.For å passe det termiske støyspekteret med en enkel harmonisk oscillatorfunksjon, utvid den delen av kurven som representerer den første resonanstoppen. Velg deretter initialiser passform. Til slutt kan du finjustere passformen ved hjelp av knappen for egnet termisk data.Den respektive kraftkonstanten vises i panelet. Angi parameterne for eksperimentet for å begynne å samle inn dataene. Sett trekkhastigheten til ett mikrometer per sekund og tving avtrekkeren til ett nanonewton.Nærmer AFM cantilever spissen til overflaten og velg enkelt kraft for å registrere en enkelt kurve og avgjøre om parametrene må justeres som beskrevet i manuskriptet. Velg F-kart fra hovedpanelet. Hvis du vil ha et kraftkart med 100 kurver, setter du antall kraftpunkter og kraftlinjer til 10.Begynn å registrere kraftkartet ved å velge gjør F-kart. Ta kraftforlengelseskurver på en rutenettlignende måte for å unngå lokale overflateeffekter og til gjennomsnittlige forskjellige overflateområder. Etter eksperimentet gjentar du bestemmelse av den inverse optiske spakens følsomhet og fjærkonstant for å kontrollere konsistensen og stabiliteten til systemet.Enkelt polynipam og PEG polymerer var kovalent bundet til en AFM cantilever tips i den ene enden og fysisorbert på silisiumdioksid overflaten i den andre enden. For å måle temperaturavhengig strekkatferd ble det identifisert en klar enkeltmolekylsstrekkingshendelse etterfulgt av et endelig maksimum på slutten av den respektive kraftforlengelseskurven. Deretter ble det generert en enkelt hovedkurve for hver temperatur.For PEG ble det observert en reduksjon av strekkkraften med økende temperatur. For polynipam ble den motsatte trenden observert. Desorpsjonen av polystyren fra en SAM-overflate i vann kan brukes til å bestemme desorpsjonskraften og lengden.Når polymervedlegget var vellykket, viste kraftforlengelseskurvene platåer med konstant kraft. Hvert platå ble utstyrt med en sigmoidal kurve for å bestemme desorpsjonskraften og avsorpsjonslengden. De observerte desorpsjonskreftene tilsvarte tidligere oppnådde verdier.Når mer enn én polymer festet til AFM cantilever spissen, kaskader av platåer ble observert i kraft forlengelse kurver. Med to polymerer festet, ble det funnet en bimodal fordeling for desorpsjonslengden mens desorpsjonskraften viste en smal fordeling. En funksjonalisert AFM cantilever tips kan brukes til å kvantifisere kraftresponsen til enkeltmolekyler i et flytende miljø og med ytre stimuli.Bruk av rent utstyr, løsemidler, AFM cantilever tips, og gjentatt skylling er svært viktig for å nå et høyt nivå av renslighet som bør bekreftes før de beskrevne kontrollerte eksperimenter. De presenterte protokollene og prosedyrene banet vei for bedre forståelse av stimuli responsive polymersystemer. Resultatene kan sammenlignes direkte med molekylære dynamiske simuleringer.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaksjon på reversibelt Immobilize små molekyler eller flerkomponent Profiler for Biosensor Applications

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Covalent Binding av BMP-2 på overflater Bruke en Self-montert med ett lag Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Aktivering Molekyler, Ioner, og faste partikler med Acoustic Kavitasjon

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Innsikt i de Samhandling av aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Bruke Single-Molecule Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektrokjemiske impedans spektroskopi som et verktøy for elektrokjemiske Rate konstant estimering

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Syntese av informasjonsbærende Peptoids og deres sekvens-regissertdynamiske covalent selvmontering

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

En femtoliter droplet array for massivt parallell proteinsyntese fra enkelt DNA molekyler

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Selvmontering av hybrid lipidmembraner dopet med hydrofobe organiske molekyler ved vann-/luftgrensesnittet

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomkraftmikroskopi kombinert med infrarød spektroskopi som et verktøy for å sondere enkeltbakteriekjemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...