Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. och T.H. erkänner finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands spetsforskningsstrategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, och bevilja HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. erkänner delvis stöd inom ramen för LOEWE-projektet iNAPO av Hessenstate Ministry of Higher Education, Research and the Arts. Vi tackar Dr Wolfgang Bronner och Dr Agne Zukauskaite från Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF för donation av högkvalitativa guldbelagda kisel rån.

SE Bild 1 för en schematisk översikt.
1. Reagens inställning
OBS: De polymerer som används för detta protokoll är: maleimid-polyetenglykol-trietoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), tia-polyetenglykol-tia (HS-PEG-SH, 35NkDa), thiol avslutade poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) och tiada avslutade polystyren (PS-SH, 1,3 mDa).
<ol><li>Förbered den väldefinierade och höga molar massan PNiPAM-SH via atom överföring radikal polymerisering, följt av omvandling och minskning av den funktionella slutgruppen för införandet av en tiaol moiety, som beskrivs i litteraturen18. Se figur 1 för detaljerade strukturer.</li>
	<li>För förvaring av kemikalier, förbered mindre alikvoter i ett torrhandsboxsystem med kväveatmosfär för att undvika exponering för atmosfäriskt syre och fukt. PEG och PNiPAM är hygroskopiska45,46 och funktionella slutgrupper av PEG, PNiPAM och PS är kända för att bli lätt oxideras när de lagras vid omgivande förhållanden33,47,48. Alla kemikalier måste förvaras vid -20 °C.</li>
	<li>Använd analytiska lösningsmedel eller högre. Dessutom, använd ultrarent vatten för att skölja AFM cantilevers chips och glas eftersom enstaka molekyl experiment är mycket känsliga för all kontaminering.</li>
</ol>2. Installation av utrustning
OBS: Använd pincett och bägare av rostfritt stål eller glas. Använd inverterade pincett för ett säkert grepp (t.ex. modell R3 SA med låg fjäderkonstant).
<ol><li>Förbered RCA-lösningen (ultrarent vatten, väteperoxid och ammoniak (5:1:1)) för att rengöra glas och pincett.</li>
	<li>Lägg kärlen i en bägare och fyll den med RCA tills glas eller pincett är helt täckta.</li>
	<li>Värm bägaren från steg 2.2 för 1 h vid 80 °C.</li>
	<li>Skölj kärlen därefter med ultrarent vatten tills ingen stickande lukt är fastställd längre (minst tre gånger).</li>
	<li>Torra glas och pincett i en ugn (120 °C).</li>
</ol>3. Tips funktionalisering
OBS: Alla steg bör utföras i en rökhuva för att undvika inandning av organiska ångor. Dessutom krävs handskar, labbrock och ögonskydd. Använd nitril- eller latexhandskar för varje steg för att undvika kontaminering. Använd lösningsmedelsresistenta handskar när du använder toluen. Alla steg, om inte annat anges, görs på RT. Använd färsk utrustning och handskar för varje steg för att undvika eventuell korskontaminering.
<ol><li>Utför ytaktivering genom att applicera syreplasma på AFM-cantilever-chippet MLCT-Bio-DC. OBS: Plasmabehandlingens effektivitet för ytterligare funktionaliseringssteg skalar med syrehalten i plasmakammaren.<ol>
<li>Använd nyrengjorda pincett för att placera AFM-kantileverchips i en plasmakammare (40 kHz, 600 W).</li>
		<li>Använd specialmodifierat aktiveringsprogram: evakuering (0,1 mbar) – översvämningar med syre till ett tryck på: 0,2 mbar (4 min) – plasmaprocess (effekt: 40%, varaktighet: 2 min, processtryck: 0,2 mbar).</li>
		<li>Ventilera kammaren och fortsätt med steg 3.2.2 omedelbart för att förhindra att föroreningar till AFM-cantileverchips luftas.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanisering och PEGylation Tidsinställning är en viktig parameter mellan stegen. Förbered lösningar så fräscha som möjligt under väntetiderna. Maleimide grupper är föremål för hydrolys i vattenhaltiga medier och tiols lätt bli oxideras till disulfids i lösning33,47 hindrar AFM spets funktionalisering reaktioner.<ol>
<li>Förbered en silane-PEG-mal lösning i toluen (1,25 mg/ml) i lösningsmedelsresistenta plast- eller glasrör och häll 6 ml av lösningen i platta Petri-rätter, 3 ml vardera. OBS: Om bindning av flera sondpolymerer observeras i SMFS-experimentet kan blandning av sillane-PEG-mal med icke-funktionell silane-PEG minska antalet förankringspunkter. För justering av passivationsskiktet PEG med olika massor (dvs. konturlängder) kan användas27.</li>
		<li>Inkubera AFM cantilever chips omedelbart efter steg 3.1.3 i silane-PEG-mal lösning (upp till 10 marker per Petri skålen) för 3 h vid 60 ° C35.</li>
		<li>Ta petriskålar ur ugnen och låt lösningen svalna i minst 10 min.</li>
		<li>Skölj varje AFM-cantilever-chip noggrant. Minska kapillärkrafternas inverkan på AFM-kantilevernnär du passerar gränssnittet mellan luftlösningsmedel, till exempel genom att luta dessa marker något när de doppar i lösningen.<ol>
<li>För PEG- och PS-polymerer, skölj tre gånger med toluen.</li>
			<li>För PNiPAM polymer, skölj en gång med toluen och två gånger med etanol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Välj minst två AFM-cantilever-chips som kontroll AFM-cantileverchips, hoppa över steg 3.3 och skölj dem enligt följande för att öka lösningsmedlets polaritet:<ol>
<li>För PEG- och PS-polymerer, skölj två gånger med etanol och en gång med ultrarent vatten.</li>
			<li>För PNiPAM-polymer, skölj två gånger med ultrarent vatten. OBS: Kontroll AFM cantilever chips har gått igenom alla funktionaliseringssteg utom polymertillsatsen (steg 3.3). De tjänar till att bevisa renligheten av funktionaliseringsprocessen, AFM cantilever chip innehavaren systemet, ytor och lösningsmedel som används för SMFS experimentet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kovalent polymerfastsättning OBS: Även om AFM cantilever spetsen förväntas vara helt täckt med maleimide grupper, det finns bara några bindande platser för den enda sond polymer, eftersom maleimide genomgår hydrolys i vatten som leder till inaktiva PEGs47. Dessa inaktiva pegs fungerar som ett passivationsskikt, enligt beskrivningen ovan.<ol>
<li>Inkubera AFM cantilever chips direkt efter steg 3.2.5 i en av följande polymerlösningar i 3 ml Petri-rätter. Om respektive polymer inte löses upp ordentligt, använd ett 40 °C vattenbad och rör om lösningen väl. OBS: Eftersom användningen av tialer avslutade polymerer kan leda till bildandet av disulfidbindningar som hämmar reaktionen med maleimidgrupperna av silane-PEG-mal rekommenderas ett reducermedel, särskilt om steg 3.3 appliceras i vattenlösliga polymerer33.<ol>
<li>För PEG- och PS-polymerer ska du använda en koncentration på 1,25 mg/ml i toluen under 1 h vid 60 °C.</li>
			<li>För PNiPAM-polymerer, använd en koncentration på 1,25 mg/ml i etanol i 3 timmar vid RT. OBS: Om bindning av flera sondpolymerer observeras i SMFS-experimentet bör polymerens koncentration minskas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Skölj noggrant varje AFM-cantilever-chip.<ol>
<li>För PEG- och PS-polymerer, skölj två gånger med toluen, två gånger med etanol och en gång med ultrarent vatten efter en 10 min svalka.</li>
			<li>För PNiPAM-polymerer, skölj två gånger med etanol och två gånger med ultrarent vatten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Förvara varje AFM-cantilever-chip separat i en liten (1 ml) Petriskål fylld med ultrarent vatten vid 4 °C tills användning i ett experiment.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ytberedning
<ol><li>Kiseloxidrån OBS: Denna yta användes för SMFS med PEG och PNiPAM.<ol>
<li>Skär en kiseloxid rån i små bitar med hjälp av en diamantkniv.</li>
		<li>Lägg kiseloxidbitarna separat i mikrocentrifugrören och fyll dessa rör med etanol.</li>
		<li>Sonicate kiseloxid bitar i 10 min.</li>
		<li>Skölj kiseloxidbitarna med etanol två gånger och torka dem under ett kväveflöde noggrant. Använd silikonoxidbitarna omedelbart.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Självmonterade monolayer av hydrofoba alkane tia på guld (SAM) OBS: Denna yta användes för SMFS med PS. Se litteratur39,49 för mer information om SAMs.<ol>
<li>Använd ett guldbelagt silikonrån (A [100], 5 nm titan, 100 nm guld) för att utföra steg 4.1.1 – 4.1.4.</li>
		<li>Inkubera ytdelarna i en 1-dodekantioollösning (2 mM) i 18 timmar.</li>
		<li>Skölj de nyberedda SAMs i etanol två gånger.</li>
		<li>Torra SAMs med kväveflöde för direkt användning eller förvara dem i etanol i upp till 4 dagar för senare användning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Datainsamling
OBS: Alla mätningar som visas här utfördes i ultrarent vatten med en Cypher ES AFM med hjälp av en värme- och kylprovsfas för temperaturvariation. I allmänhet kan alla afms som ger möjlighet att mäta i vätskor användas.
<ol><li>Sätt in det funktionära AFM-cantilever-chippet i AFM.</li>
	<li>Limma den beredda ytan i en provhållare som är lämplig för mätning i vätskor (t.ex. högupplöst reningsgrad 101RF eller ett UV-härdbart lim). OBS: Dessa limningsmedel är mycket inert och resistenta mot ett stort antal polära lösningsmedel. Limmets motståndskraft mot icke-polära lösningsmedel (t.ex. toluen eller hexan) eller höga temperaturer bör kontrolleras före användning.</li>
	<li>Sänk ned AFM-cantilever-chippet och sondprovet i vätskan, här: ultrarent vatten. OBS: En lösningsmedelsdroppe (ca 100 μL) kan deponeras på AFM-kantileverschiphållaren. Att täcka AFM-cantilever-chippet med lösningsmedel minskar kapillärkrafter, som annars skulle fungera på AFM-kantilevernnär du närmar sig provytan som passerar genom gränssnittet mellan luftlösningsmedel.</li>
	<li>Justera vid behov temperaturen och låt systemet jämställas. OBS: Temperaturförändringar kan resultera i en deformation av AFM-cantilever på grund av en bimetallisk effekt för AFM-cantilevers med en reflekterande beläggning som aluminium eller guld. Jämvikt bör utföras bort från ytan (flera μm) tills ingen ytterligare ändring av avböjningssignalen observeras (upp till 15 min för MLCT-Bio-DC).</li>
	<li>Variera temperaturen slumpmässigt för att utesluta eventuella effekter av åldrandet av funktionaliseringen. Se till att de temperaturer som används inte leder till en irreversibel böjning av AFM-kantilever. OBS: Eventuella temperatureffekter på lösningsmedelsegenskaper (t.ex. avdunstning eller förändringar i viskositet) kan hämma dina experiment. I de presenterade exemplen varierades temperaturen över ett intervall på upp till 40 K i steg om 10 K med vatten som lösningsmedel (t.ex. från 278 K till 318 K).</li>
	<li>Närma dig ytan för att bestämma InvOLS (omvänd optisk spakkänslighet) genom att ta kraftförlängningskurvor på en hård yta (t.ex. kiseloxid). För detta, ta avböjningssignalen för fotodetektorn (i V) vs piezo avstånd och bestämma lutningen på den del som representerar indrag av AFM cantilever spets i den underliggande ytan (motbjudande regim) med hjälp av en linjär funktion. För att minska fel, ta genomsnittet av minst fem värden för att få det slutliga InvOLS-värdet. För ytterligare information, se litteraturen4,39. OBS: InvOLS kan endast beslutas på ett tillförlitligt sätt på hårda ytor. När det gäller experiment på mjuka ytor eller gränssnitt se till att du placerar en hård yta nära dina mjuka ytor. Sedan kan InvOLS-kalibreringen göras före eller efter dina mjuka ytexperiment utan att behöva demontera AFM-installationen.</li>
	<li>För fjäderkonstant bestämning, flytta AFM-kantilevertill en höjd med varken attraktiva eller motbjudande interaktioner mellan AFM-cantileverspets och yta (flera μm). Registrera sedan ett termiskt brusspektrum där effektspektraldensiteten (PSD) vs frekvens ritas. Följande steg utförs vanligtvis av automatiserade inbyggda funktioner i kommersiell AFM-programvara: för det första analyseras det förvärvade värmebullerspektrumet genom att montera en funktion på PSD, t.ex. Passformen görs upp till ett minimum mellan den första och andra resonansen. För det andra bestäms området under den monterade delen av PSD vs frekvensområdet som representerar den genomsnittliga kvadratiska förskjutningen av AFM-cantilever i vertikal riktning. Slutligen används ekpartitionssatsen för att erhålla AFM-kantileverkraftkonstanten28,50. OBS: Ett lämpligt frekvensområde bör användas som omfattar den första resonanstoppen i AFM-kantilever. För att få ett tillfredsställande signal-brusförhållande bör minst 10 PSD-skivor ackumuleras med högsta möjliga frekvensupplösning.</li>
	<li>Starta experimentet. Diagram med kraftgenom att ta kraftförlängningskurvor på ett rutnätsliknande sätt (t.ex. 10 x 10 poäng för ett område på 20 x 20 μm2)för att undvika lokala yteffekter (t.ex. föroreningar, förskjutningar) och för att genomsnittliga olika ytområden. OBS: Typiska parametrar är en draghastighet på 1 μm/s och en provtagningshastighet på 5 kHz för att säkerställa tillräcklig upplösning. Provtagningshastigheten bör anpassas när draghastigheten varieras. Indragningsavståndet bör anpassas till den uppmätta polymerens kontur- eller desorptionslängd (ca. dubbelt så lång längd).</li>
	<li>Använd och variera uppehållstiden mot ytan så att den enda polymeren kan fastna på ytan (vanligtvis 0 – 5 s).</li>
	<li>Upprepa bestämningen av InvOLS och fjäderkonstanten i slutet av experimentet för att kontrollera systemets konsistens och stabilitet. OBS: För stark vidhäftning mellan polymer och yta kan kalibreringen göras efter det faktiska experimentet för att bevara funktionaliseringen.</li>
</ol>6. Utvärdering av uppgifter
För datautvärdering användes en specialskriven programvara baserad på Igor Pro för att utföra följande steg.
<ol><li>Konvertera den råa avböjningssignalen (i Volt) till kraftvärden (i Newtons) genom multiplikation med den inspelade InvOLS och den beslutsamma fjäderkonstanten.</li>
	<li>Subtrahera avböjningen av AFM-cantilever (efter multiplikation av den råa avböjningssignalen med InvOLS) från det avstånd som drivs av piezoelementen i vertikal riktning för att erhålla den verkliga förlängningen (spets-ytavstånd)4.</li>
	<li>Korrigera de kraftförlängningskurvor som erhålls för drift genom att montera en linjär funktion till baslinjen efter den senaste händelsen och subtrahera samma från kraftförlängningskurvan. Den monterade delen bör utgöra en tillräcklig förlängning från ytan där varken attraktiva eller motbjudande interaktioner observeras mellan AFM-kantileverspets och underliggande yta. Sedan ställs originalplanen in på nollaxeln. OBS: När det gäller mätningar på mycket reflekterande ytor som guld kan störningar förekomma. Dessa resulterar från partiell reflektion av laserstrålen från ytan och från baksidan av AFM cantilever. Så, den erhållna kraft-förlängning kurvor kan visa en sinusformad kraft signal artefakt längs den vertikala förlängningen. Detta är en artefakt som hämmar de slutliga kraftvärdena. För att fortfarande ta hänsyn till dessa kraftförlängningskurvor är en korrigering möjlig (figur 2).</li>
	<li>Om störningarna visas i kraftförlängningskurvorna väljer du en representativ force-extension-kurva (upprullningskurva) som inte visar några andra händelser än möjligen en topp med ospecifik vidhäftning och samma sinusoidala artefakt (dvs. amplitud och fas) (figur 2A). OBS: Jämna ut den representativa kraftförlängningskurvan för att erhålla störningens lågfrekvensmönster.</li>
	<li>Välj en kraftförlängningskurva som ska korrigeras (bild 2B).</li>
	<li>Överlägg båda kraftförlängningskurvorna från steg 6.4. och 6,5. för att se till att båda visar samma sinusoidala artefakt (dvs. amplitud och fas) (bild 2C).</li>
	<li>Subtrahera den (utjämnade) representativa kraftförlängningskurvan från kraftförlängningskurvan som ska korrigeras, vilket leder till en rak snarare än en bihåleformad baslinje(figur 2D). OBS: Se till att den ospecifika vidhäftningstoppen för den representativa kurvan skiljer sig från alla enstaka molekylhändelser som visas i kurvorna som ska korrigeras. Valet av representativ kurva är i själva verket avgörande för en korrekt korrigering.</li>
</ol>

Författarna förklarar att de inte har något konkurrerande ekonomiskt intresse.

AFM-baserade SMFS är ett av de viktigaste verktygen för att undersöka interaktioner med enmolekyler inom polymerfysik. För en sann enda molekyl experiment, kovalent fastsättning av sonden polymer till en AFM cantilever spets är viktigt.
Många tidigare verk är baserade på nanofiske experiment, särskilt för PNiPAM, där polymerer adsorberas på en yta och sedan sträcks genom att slumpmässigt plocka dem från substratet med hjälp av en AFM cantilever spets30,31. Detta kan förändra resultaten och leda till feltolkning av den enda molekylen beteende. Där kan kooperativa effekter dominera resultaten eftersom interaktioner med angränsande polymerer inte kan uteslutas. Detta har en stor inverkan på resultaten, särskilt för polymerer som visar betydligt annorlunda beteende i bulk jämfört med enstaka isolerade molekyler57,58.
Funktionsprotokollet som presenteras här är tillförlitligt och kan enkelt appliceras på olika polymerer, oavsett deras konturlängd, hydroforbicitet eller monomerernas sterichinder. Dessutom tillhandahålls en passivation för att förhindra oönskade interaktioner mellan den enda sondpolymeren och AFM-kantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan. Dessutom visas utvärderingen av force-extension-kurvor som visar stretchinghändelser. Där föreslås ett förfarande för bestämning av huvudkraftförlängningskurvor. Detta ger ett bättre sätt att avslöja, t.ex. Dessutom tillhandahålls analys av enstaka molekyldesorptionhändelser med konstanta kraftplatåer. Dessutom ges ett enkelt sätt att korrigera sinusoidala kraftsignalartefakter i kraft-förlängningskurvor som annars kan försämra experimentets resultat.
Jämfört med Stetter et al.39reduceras det funktionaliseringsförfarande som presenteras här till tre steg i stället för fyra och procedurens robusthet förbättras. Den stora fördelen med att utföra PEGylation och silanisering i ett steg är att få en bättre kontrollerad reaktion och att öka avkastningen. Dessutom behöver färre lösningar förberedas och färre sköljsteg krävs. Detta minskar ansträngningen och tiden för beredning och ökar reproducerbarheten. Dessutom är flytta AFM cantilevers alltid en viktig del av funktionaliseringsprocessen. En överföring från en lösning till den andra riskerar alltid att starkt påverka funktionaliseringskvaliteten på grund av överföringar via luftvattengränssnittet eller att förlora AFM-cantilevers genom felaktig användning av pincett.
För att bevisa korrekt kovalent fastsättning av en enda polymer till en AFM-kantileverspets måste olika villkor uppfyllas. För det första är kontroll AFM-kantileverav av stor betydelse och bör förberedas för varje funktionalisering. Funktionaliseringsprocessen och vätskecellen för att utföra experimenten anses endast vara rena, om ett litet antal kraftförlängningskurvor visar sträckor eller platåer i kontrollexperimentet (i de presenterade exemplen mindre än 2 %).
Ett tydligt stretchingmönster utan ytterligare droppar eller maxima är viktigt för att ha rätt enda molekyl stretching händelser. Dessutom bör beroendet av bristningkraft på kraftbelastningshastigheten vid bristning eller det fullständiga elastiska svaret från sträckningskurvan analyseras för att utesluta samtidig desorption av flera polymerer59,60. För PEG och PNiPAM visade 19% och 42% av kraftförlängningskurvorna som togs på olika positioner på ytan ett sådant stretchingmönster. För att få stretching händelser, physisorption av polymeren till respektive underliggande yta måste vara stark. Annars observeras en platåliknande desorptionhändelse. Detta är ännu mer avgörande för att upptäcka stretching händelser vid höga krafter (upp till 500 pN eller mer). Eftersom denna starka fysisorption inte uppfylls för varje kraft-förlängning kurva, avkastningen av sådana händelser är mindre än för ren platå-liknande desorption händelser. Som ett alternativ kan starkt hålla grupper som katekol eller chemisorption mellan polymer och underliggande yta användas. Detta kräver dock att ytterligare funktionella grupper eller kopplingsplatser införs vid polymeren61,,62.
Polymerens massa (dvs. konturlängd) ger ett värdefullt fingeravtryck. Även om massan inte direkt kan översättas till den uppmätta konturlängden av följande skäl, är längdfördelningen mycket värdefull för att definiera händelser med en molekyl. När det gäller en PNiPAM-polymer med låg polydispersity (中= 1,28) fann vi betydande skillnader i förlängningsvärdena för de erhållna stretchinghändelserna (och därmed i polymerlängden) i experimenten. En anledning till detta kan vara bestämningen av polymerlängden och dess fördelning. I storlek-uteslutning kromatografi (SEK), en relativ vikt av målet polymerbestäms i jämförelse med standarder som PS eller poly (metyl metakrylat) (PMMA)63. Den förmodade relativa vikten förväntas avvika från den absoluta molekylvikten eftersom målpolymerens hydrodynamiska radie och standarden kan skilja sig avsevärt. Dessutom kan silane skiktet oligomerized av falska vatten i toluen under funktionaliseringsprocessen. Fastsättningen av sådana oligomers till AFM-kantileverspetsen leder till ett mer flexibelt lager med färre ankarpunkter64. Polymerens fästpunkt till silikonskiktet kanske inte nödvändigtvis ligger i spetsen som leder till en förskjutning av de upptäckta längdvärdena29. Medan en polymermodell som maskliknande kedja (WLC) eller den fritt ledade kedjan (FJC) modellen inte kan återge respektive force-extension beteende för PEG eller PNiPAM ordentligt över hela förlängningsområdet18,29,4141,65,66, en sådan polymer modell kan vara värdefullt för andra polymera och proteinsystem10,15,,67,68.
Kovalent fastsättning av en enda PS-polymer (med en konturlängd på mer än 1 μm) anses endast vara framgångsrik, när ett stort antal kraftförlängningskurvor visar en tillräckligt lång platå med konstant kraft (figur 5). En platå som härrör från desorbing en enda polymer definieras av en enda skarp droppe av en konstant kraft till baslinjen vid en viss förlängning, som anges i figur 5A. Om fler polymerer är fästa vid AFM-kantileverspetsen observeras en kaskad av platåer56 (figur 5C). Platånlängd (desorptionslängd), korrelerad med polymerkonturlängden51, måste vara betydligt längre än någon vidhäftningstopp på grund av ospecifik vidhäftning av AFM-cantileverspetsen till den underliggande ytan (här omkring 200 nm). Funktioner som endast visas i en enda kraftförlängningskurva bör inte tolkas. I de presenterade experimenten visade minst 80 av 100 kurvor en platå längre än 200 nm i minst två kraftkartor på två olika platser på ytan. Dessutom visar fördelningen av desorptionslängder, med hjälp av spridningsområden som anges i figur 5B och 5D,om och hur många polymerer som är bundna till AFM-kantileverspetsen. När det gäller PS fungerade en smal fördelning av desorptionskraft och längd som tagits från platåer i kraftförlängningskurvorna som bevis på ett framgångsrikt kovalent fastsättning. Detta bevisade slutligen framgången av functionalizationprotokollet. Därför rekommenderar vi starkt att presentera sådana kraft- och längdfördelningar i publikationer.
Utvärdering av kraftförlängningskurvor med inbyggda algoritmer som utgör många förinställda parametrar bör göras varsamt. Skäl en fast provtagningshastighet är till exempel inte lämplig för varje tillämpad draghastighet eller att en automatisk utjämning av kraftförlängningskurvorna kan vara i genomsnitt viktiga detaljer. Vanligtvis en korrekt förståelse av respektive utvärderingsförfarande kan förhindra fel i utvärderingsförfarandet, som i sin tur starkt kan påverka de slutliga resultaten av en AFM-baserade SMFS experiment.
Sammanfattningsvis presenterar vi ett funktionsiseringsprotokoll som är tillförlitligt och lätt kan appliceras på en mängd olika polymerer. Dessutom presenteras en korrekt utvärdering av enmolekylkraftförlängningskurvor, vilket gör det möjligt att bestämma fysiska parametrar som sträckkraft, desorptionskraft och desorptionslängd. De presenterade protokollen och procedurerna är värdefulla för undersökning av stimuli-responsiva system på enmolekylnivå.

Sedan dess uppfinning på 1980-talet1, atomkraft mikroskop (AFM) har blivit en av de viktigaste bildteknikerna inom naturvetenskap med subnanometer rumslig upplösning, sub-piconewton kraftupplösning och möjligheten att mäta i olika lösningsmedel och temperaturförhållanden2,3,44,5,6,7.
Förutom bildframställning8,9, används AFM för att utföra enmolekylkraftspektroskopi (SMFS) som ger insikt i självhäftande interaktioner mellan en enda polymer och ytor, fysiska egenskaper hos enskilda polymerer och utfällningsmekanismer för proteiner7,,10,,11,12,13,1414,15,16. I ett vanligt SMFS-experiment kommer den funktionäriserade cantileverspetsen i kontakt med en yta så att polymeren vid AFM-cantileverspetsen physisorbs till denna yta. Genom att dra tillbaka AFM-cantileverspetsen från ytan omvandlas en ändring av avböjningen av AFM-cantilever till en kraft som leder till en kraftförlängningskurva4. Fysiska parametrar såsom sträckkraft, desorptionskraft och desorptionslängd kan bestämmas beroende på olika parametrar såsom draghastighet, uppehållstid på ytan, indragsdjup i ytan, temperatur, lösningsmedel17,,18 och olika ytor som substrat, polymerfilmer eller stödda lipidbilayers19,20,,21,22. Dessutom kan en polymer undersökas i olika rumsliga riktningar, vilket undersöker friktionsegenskaperna hos polymeren23,24,25,26.
En kovalent fastsättning av den undersökta polymeren till en AFM-kantileverspets är nödvändig för sådana studier. Således förhindrar en hög avkastning av enstaka molekyl händelser med en och samma polymer bunden till en AFM cantilever spets någon bias av resultaten på grund av kalibrering av fjäderkonstanten av AFM cantilever27,28, varierande fästpunkter29 eller varierande polymerer (med olika konturer längder) såsom i fallet med nanofiske experiment30,31,32. Också, interaktioner med andra polymerer samt i genomsnitt effekter kan allmänt förebyggas18,28. För kovalent fastsättning av en polymer till AFM cantilever spets, olika typer av kemiska modifieringar kan tillämpas, varav många sammanfattas i boken av Hermanson33. Amin och thiol-baserade länka reaktioner samt klicka kemi representerar de vanligaste metoderna i AFM cantilever spets funktionalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42.36 Becke et al.40 visar hur man använder 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/NHS kemi för att fästa ett protein på en AFM-cantilever spets. Men dessa funktionella grupper tenderar att crosslink, vilket leder till en förlust av funktionalitet43,44. Dessutom visar karbodiimider en tendens att snabb hydrolys i lösning43. Maleimide och thiol grupper är i allmänhet mer stabila och visar inte crosslinking reaktioner. Det presenterade protokollet är en optimering av de tidigare publicerade protokollen som anges i referenserna35,39.
Här presenteras ett tillförlitligt funktionaliseringsprotokoll som enkelt kan anpassas till ett stort antal olika polymerer, oavsett egenskaper som konturlängd eller hydroforbicitet. Tre olika polymerer valdes som exempel: hydrofil polyetenglykol (PEG)Noch poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) samt hög mola massa hydrofoba polystyren (PS). För att ge en kovalent bindningsförmåga med en lämplig länkningsmolekyl valdes de tre polymererna ut för att ha en telechelic thiol moiety som funktionell slutgrupp. Länkermolekylen i sig är vanligtvis en kort PEG-polymer med två aktiva platser, en silanegrupp i ena änden och en maleimidegrupp i andra änden. Den förstnämnda möjliggör en kovalent fastsättning till AFM-kantileverspetsen och den senare en bindande reaktion med tiagruppen av den funktionella masspolymeren med hög molar. Dessutom fungerar inaktiva PEG-länkarmolekyler som ett passivationsskikt för att förhindra oönskade interaktioner mellan sondpolymeren och AFM-cantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-baserad enda molekyl kraft spektroskopi är ett idealiskt verktyg för att undersöka interaktioner mellan en enda polymer och ytor. För en sann enda molekyl experiment, kovalent fastsättning av sonden molekylen är viktigt eftersom först då kan hundratals kraft-förlängning spår med en och samma enda molekyl erhållas. Många spår är i sin tur nödvändiga för att bevisa att en enda molekyl ensam är sonderade. Dessutom är passivation avgörande för att förhindra oönskade interaktioner mellan den enda sondmolekylen och AFM-cantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan. Funktionsprotokollet som presenteras här är tillförlitligt och kan enkelt appliceras på en mängd olika polymerer. Karakteristiska enstaka molekylhändelser (dvs. sträckor och platåer) detekteras i kraftförlängningsspåren. Från dessa händelser kan fysiska parametrar som stretchingkraft, desorptionskraft och desorptionslängd erhållas. Detta är särskilt viktigt för den exakta undersökningen av stimuli-responsiva system på enmolekylnivå. Som exemplariska system poly(etenglykol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) och polystyren (PS) sträcks och desorbed från SiOx (för PEG och PNiPAM) och från hydrofoba självmonterade monoytor (för PS) i vattenmiljö.N

Följande exempel visar resultat av enkel molekyl stretching och desorption av polymererna PEG, PNiPAM och PS. Alla AFM cantilever tips funktionellas med protokollet ovan. PEG och PNiPAM mättes på SiOx med temperaturvariation. För en detaljerad diskussion om de resulterande temperaturberoende sträckkurvorna för PEG och PNiPAM, se Kolberg et al.18 Ett annat kraftförlängningsmotiv är en platå med konstant kraft (t.ex. när desorbing PS från självmonterade monolayers av metyl avslutade alkane tioler på guld (SAM) i vatten4,27,39,51).
Exempel 1: Stretching av PEG och PNiPAM i vatten Den temperaturberoende stretching beteende i vatten mättes med hjälp av enda PNiPAM och PEG polymerer kovalent bunden till en AFM cantilever spets i ena änden och physisorbed på en SiOx yta i andra änden. Efter kalibreringoch ren kontroll experiment (mindre än 2% av kraft-förlängning kurvor visar enda molekyl händelser), minst två kraft kartor spelades in för varje AFM cantilever. Det temperaturberoende experimentet utfördes genom att registrera minst en kraftkarta vid varje temperatur. När endast ett fåtal stretching händelser dök upp, respektive AFM cantilever kasserades och nästa AFM cantilever av chipet togs (vanligtvis i ordningen C, B, D och E av MLCT-Bio-DC). För PEG:s exemplariska data observerades en enda stretchinghändelse i 95 av 500 uppmätta kraftförlängningskurvor (19 %). För PNiPAM visade 252 av 600 force-extension kurvor ett stretchingmönster (42%). För en bättre jämförelse av kraftförlängningskurvorna genererades en enda huvudkurva för varje temperatur. För detta ändamål valdes endast de kurvor med en stretchinghändelse till minst 500 pN, där konformationsfluktuationer och lösningsmedelseffekter är försumbara,52. Det slutliga antalet sträckor som beaktades var 3 på 278 K, 7 på 298 K och 4 på 318 K för PEG och 4 på 278 K, 3 på 298 K och 3 på 318 K för PNiPAM18.
Proceduren för att generera huvudkurvor anges i figur 3. De valda kraftförlängningskurvorna(figur 3A)skalas om till en längd L0 (förlängning med en kraft av 500 pN), se figur 3B. Vidhäftningstoppen visar en stor variation av ospecifik vidhäftning mellan ytan och AFM-cantileverspetsen, men påverkar inte polymerstretchingbeteendet. Efter sammanslagningen av de omskalade kraftförlängningskurvorna beräknas de i genomsnitt av en binominalutjämning enligt figur 3C. För detta, en Gaussian filter veck data med normaliserade koefficienter som härrör från Pascals triangel på en nivå som motsvarar utjämning parameter2053. Slutligen erhålls en huvudkurva för varje temperatur som anges i figur 3D. Zoom-in visar det område där temperatureffekten på force-extension-beteendet är mest uttalad.
En jämförelse av temperaturen beteende PEG (A) och PNiPAM (B) finns i figur 4. För PEG observerades en minskning av sträckkraften med ökande temperatur. En ökning med cirka 5% av omskalad förlängning vid 100 pN observerades när temperaturen ökade från 278 till 318 K. För PNiPAM kan en motsatt temperaturberoende förskjutning avslöjas. En minskning med cirka 1% av omskalad förlängning vid 100 pN observerades när temperaturen höjdes från 278 till 328 K. Dessutom kunde den stretchingfria energin erhållas från kraftförlängningshuvudkurvorna genom att bestämma området under kurvan för ett givet kraftvärde. Detta skulle kunna användas för att extrahera energiska och entropiska bidrag av stretching fri energi med hjälp av molekylär dynamik (MD) simuleringar18.
Exempel 2: Desorption av PS från en SAM-yta i vatten Desorptionen av PS från en SAM-yta i vatten kan användas för att bestämma desorptionskraften och längden och därmed kvantifiera den hydrofoba interaktionen. Efter kalibrering en inspelades minst två kraftkartor på två olika platser på ytan. När polymertillsatsen lyckades visade kraftförlängningskurvorna platåer av konstant kraft, som karakteristiskt drag, figur 5A och figur 5C. Platåliknande desorption observeras när dynamiken i de sonderade bindningarna är mycket snabbare än draghastigheten för AFM-cantileverspetsen (kvasijämvikt). Desorption krafter platå-liknande kraft-förlängning kurvor direkt ger vidhäftning fri energi genom att integrera kraft-förlängning spår54. De har använts för att bestämma elektrostatiska, dispersiva och hydrofoba interaktioner samt friktionsegenskaper hos enskilda polymerer på ytor i flytande miljö2,4,23,51,54,55.
Varje platå av konstant kraft var utrustad med en sigmoidal kurva för att bestämma desorption kraft och desorption längd, som sedan ritades i histogram. Histogrammen var försedda med en Gaussian för att extrahera det maximala värdet och standardavvikelsen. För en bättre översikt visades desorptionskraft och längdvärden tillsammans i ett scatter-diagram, enligt figur 5B och figur 5D.
För polystyren på SAM i vatten motsvarar de bestämda desorptionskrafterna tidigare erhållna värden19,23. Eftersom desorptionslängden korrelerar med polymerkonturlängden51kan desorptionslängdsfördelningen användas som ett bevis på den kovalenta bindningen av respektive polymer till AFM-kantileverspetsen via sin funktionella ändgrupp. Således fungerar desorptionslängden som ett fingeravtryck.
För mer än en polymer fäst vid AFM-kantileverspetsen kan kaskader av platåer (diskreta steg) observeras i kraftförlängningskurvorna56. Varje platå representerar desorption av en polymer vid en annan förlängning. Experimentet som gavs i figur 5C och figur 5D visade ett typiskt fall av två polymerer knutna till AFM-kantileverspetsen samtidigt. Genom att montera den slutliga bristningen kunde en bimodal fördelning hittas för desorptionslängden, medan desorptionskraften visade en smal fördelning. I detta fall kunde den mindre desorptionslängden hittas i 90% av kraftförlängningskurvorna, antingen som en enda platå eller som en extra platå på den längre platån, enligt figur 5C. Den högre desorptionslängden hittades i 37% av de erhållna kraftförlängningskurvorna. Fördelningen av desorptionslängd kan således användas för att bestämma antalet olika polymerer som är fästa vid AFM-kantileverspetsen. I allmänhet är en smal fördelning av desorptionslängdsvärdena en bra indikation på att en och samma enda polymer undersöktes i de erhållna kraftförlängningskurvorna. Samtidigt kan en superposition av respektive krafter-förlängning användas för att avgöra om en och samma enda polymer har mätts.
Efter att ha visat kovalent bindning av en enda PS-polymer kan ytterligare experiment med denna PS-polymer utföras varierande substrat (fast yta samt polymerfilmer), lösningsmedelsförhållanden, temperatur, draghastighet eller uppehållstid.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Bild 1: Schematisk översikt över spetsfunktionaliseringsprocessen. Inkluderar kemisk modifiering av AFM-kantileverspetsen efter (1) plasmaaktivering (2) silanisering/PEGylation och (3) polymertillsats. Dessutom visas de detaljerade kemiska strukturerna hos de polymerer som används, nämligen PEG, PNiPAM och PS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Figur 2: Eliminering av störningar i kraftförlängningskurvor. (A) Hitta en kraft-förlängning kurva som visar en sinusformad kraft signal artefakt längs förlängningen men har ingen enda molekyl stretching händelse. (B)Välj en kraftförlängningskurva med en enda molekylhändelse, som ska korrigeras från den sinusformade artefakten. (C)Överlagra kurvorna för att kontrollera om de sinusformade artefakterna i kurvorna verkligen matchar. (D)Genom att subtrahera kraftförlängningskurvan(A)från(B)erhålls en kraftförlängningskurva med en rak baslinje. Även om vidhäftningstoppen inte kan användas för vidare analys korrigeras kraftförlängningskurvan nu för artefakten som leder till mycket mer exakta kraftvärden i regionen av den enda molekylhändelsen (här: > 0,2 μm förlängning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Figur 3: Bestämning av huvudkurvor från force-extension-kurvor av PEG vid 298 K. (A)Experimentella data vid 298 K, med hjälp av 7 kraftförlängningskurvor. Efter omskalning till en längd L0 med en kraft på 500 pN (B)kan kraftförlängningskurvorna slås samman och i genomsnitt beräknas genom tvånominell utjämning som får en huvudkurva (C). De omskalade kurvorna anges som punkter medan huvudkurvan visas som en solid linje. Slutligen kan de erhållna huvudkurvorna för olika temperaturer jämföras(D). Zoom-in anger det område där temperatureffekten på force-extension-beteendet är mest uttalad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Figur 4: Jämförelse av de temperaturberoende huvudkurvorna i PNiPAM och PEG. För PEG observeras en ökning av omskalad förlängning vid 100 pN (mellankraftsintervall) när temperaturen höjs(A),medan en motsatt temperaturberoende förskjutning för PNiPAM avslöjas (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Figur 5: Analys av kraftförlängningskurvor av PS på SAM i vatten. (A)Exemplarisk force-extension kurva (blå) med en sigmoidal passform av platån (lila). Dessutom markerar pilarna den bestämda kraften (röd) och längden (grön) av platån. Desorptionskraft- och desorptionslängdsvärden som erhålls av sigmoidalanfall visas i ett spridningsområde och de resulterande histogrammen är utrustade med en Gaussian. b)De fastställda genomsnittliga desorptionskraft- och desorptionslängdsvärdena är (112 ± 6) pN och (659 ± 7) nm, varvid 93 % av kraftförlängningskurvorna uppvisar sådana enstaka platåhändelser. c)Exemplarisk force-extension kurva (blå) för två polymerer som är fästa vid AFM-kantileverspetsen samtidigt. Här visar desorptionskraften en unimodal fördelning med ett genomsnittligt kraftvärde på (117 ± 5) pN, medan en bimodal fördelning kan hittas för desorptionslängden som leder till genomsnittliga längdvärden på (656 ± 9) nm och (1050 ± 16) nm. (D)90 % av de samplade kraftförlängningskurvorna uppvisar endast enstaka platåhändelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Kovalent fastsättning av sondmolekyler till atomkraftsmikroskopi (AFM) cantilever tips är en viktig teknik för att undersöka deras fysiska egenskaper. Detta gör det möjligt för oss att bestämma stretching kraft, desorption kraft och längd polymerer via AFM-baserade enda molekyl kraft spektroskopi med hög reproducerbarhet.

Kovalent fastsättning av enstaka molekyler för AFM-baserad force spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Enmolekyl kraft spektroskopi gör det möjligt för oss att mäta fysiska parametrar som beskriver mekaniska och självhäftande egenskaper av polymerer. När du använder AFM-baserad kraftspektroskopi för att studera enstaka molekyler är det viktigt att ha ett tillförlitligt och effektivt protokoll för att binda dessa molekyler kovalent till en AFM cantilever spets. Detta protokoll kan antas till många olika polymerer oberoende av konturlängd eller hydrofobiskhet.Alla steg bör utföras i en rökhuva för att undvika inandning av organiska ångor. Dessutom krävs lösningsmedelsbeständigt glas, labblack och ögonskydd. Använd först nyrengjord pincett för att placera AFM cantilever chips i plasmakammaren.Starta aktiveringsprogrammet för plasmakammarens yta genom att välja start och sedan ja. Verifiera att plasmaprocessen fungerar som den ska. En plasmaprocess med hög syrehalt visar en ljusblå färg.Medan ytan aktiveringsprogrammet är verkställande, lösa silan-PEG-mal i toluen för att få en koncentration på 1,25 milligram per milliliter. Placera tre milliliter av lösningen i en platt Petriskål. När plasmaprocessen är klar, ventilera plasmakammaren genom att välja bekräfta och sedan avluftning.Fortsätt omedelbart till nästa steg för att förhindra absorption av föroreningar. Placera chipsen i petriskålen och inkubera chipsen i tre timmar vid 60 grader Celsius. Ta ut Petri-skålen ur ugnen och låt den svalna i minst 10 minuter.Därefter sköljer du chipsen. För PEG eller polystyrenbindning, skölj spånorna med toluen tre gånger. För polynipambindning ska chips sköljas en gång med toluen och två gånger med etanol.För att minska effekten av kapillärkrafter på AFM cantilever, luta marker något vid sköljning. AFM cantilever chips måste sköljas ordentligt för att ta bort eventuella överskott av fysiska polymerer som kan påverka experimentet. Sköljning ska utföras noggrant för att förhindra eventuella skador på AFM-kantilvers.Slutligen, förbereda minst två marker för att fungera som kontroller som inte kommer att genomgå kovalent polymer fastsättning. För kontroller kontra PEG och polystyren chips, skölj två gånger med etanol och en gång med vatten. För kontroller kontra polynipamchips, skölj två gånger med vatten.För att utföra kovalent fastsättning av PEG eller polystyren, förbereda tre milliliter polymerlösning i toluen vid en koncentration av 1,25 milligram per milliliter. Tillsätt lösningen och chipsen i en petriskål och inkubera chipsen i 60 grader Celsius i en timme. Efter inkubation med PEG eller polystyren, låt spånorna svalna i 10 minuter.Skölj spånorna två gånger med toluen, två gånger med etanol, och en gång med vatten. För att utföra kovalent fastsättning av polynipam, förbereda tre milliliter av polymerlösning i etanol vid en koncentration av 1,25 milligram per milliliter. Tillsätt lösningen och chipsen i en petriskål och inkubera chipsen i rumstemperatur i tre timmar.Efter inkubation med polynipam, skölj flisen två gånger med etanol och två gånger med vatten. För att lagra chipsen tills de används i ett experiment, placera varje chip separat i en milliliter Petri-skål fylld med vatten. Håll Petri-rätterna vid fyra grader Celsius.För det första, sätt in det funktionaliserade AFM-cantilever-chipet i en spånhållare. Limma in den förberedda ytan i en provhållare som är lämplig för mätningar i vätska. Använd en pipett för att sänka ner chipet i vatten.Montera provytan i AFM. Sänk ned provytan i vatten. Anslut flishållaren till AFM.Närma dig sedan chipet till provytan. Använd miljöpanelen för att ställa in måltemperaturen och växla läge och återkopplingsradioknapparna till på. Låt sedan systemet jämvikt i ca 15 minuter.För att ta en kraft förlängningskurva, närma sig AFM cantilever spets till ytan och välj enda kraft. Den resulterande kurvan visar avböjningen mot piezoavståndet med inflygningen mot ytan som visas i rött och upprullningen som visas i blått. Expandera den del av kurvan som representerar indraget av AFM cantilever spets i den underliggande ytan.Om du vill utföra en linjär passform ställer du in markörer på antingen inflygnings- eller infällningskurvan och väljer uppdatering INVOLS från snabbmenyn. Det resulterande värdet för det omvända optiska spakens känslighetsvärde visas i panelen längst upp till vänster. Efter att ha upprepat denna procedur minst fem gånger, beräkna ett genomsnitt för omvänd optiska spaken känslighet och ange medelvärdet i panelen.Placera AFM cantilever på en höjd av cirka 100 mikrometer ovanför ytan genom att välja flytta till pre-engagera. För att få en tillfredsställande signal-brusförhållande för det termiska brusspektrumet, ställ in genomsnittsräkningen till minst 10 och välj högsta möjliga frekvensupplösning. Därefter registrera termisk brus spektrum genom att välja fånga termiska data.För att passa det termiska brusspektrumet med en enkel harmonisk oscillatorfunktion, expandera den del av kurvan som representerar den första resonanstoppen. Välj sedan initiera passform. Slutligen förfina passformen genom att använda knappen för termiska data för passform.Respektive kraftkonstant kommer att visas i panelen. Om du vill börja samla in data ställer du in parametrarna för experimentet. Ställ in draghastighet till en mikrometer per sekund och tvinga utlösa till en nanonewton.Närma sig AFM cantilever spets till ytan och välj enda kraft för att spela in en enda kurva och avgöra om parametrarna måste justeras enligt beskrivningen i manuskriptet. Välj F-karta på huvudpanelen. För att få en kraftkarta med 100 kurvor, ställ in antalet kraftpunkter och kraftlinjer till 10.Börja spela in kraftkartan genom att välja do F-kartan. Ta kraft förlängningskurvor i ett rutnät-liknande sätt för att undvika alla lokala yteffekter och att genomsnittet olika ytområden. Efter experimentet, upprepa bestämningen av den omvända optiska spakens känslighet och fjäderkonstanten för att kontrollera konsistensen och stabiliteten i systemet.Enda polynipam och PEG polymerer var kovalent bunden till en AFM cantilever spets i ena änden och physisorbed på kisel dioxid ytan i andra änden. För att mäta temperaturberoende stretching beteende identifierades en tydlig single-molecule stretching händelse följt av en slutlig maximal i slutet av respektive kraft förlängning kurvan. Då genererades en enda masterkurva för varje temperatur.För PEG observerades en minskning av sträckningskraften med ökande temperatur. För polynipam observerades den motsatta trenden. Desorption av polystyren från en SAM yta i vatten kan användas för att bestämma desorption kraft och längd.När polymertillsatsen lyckades visade kraftutökningskurvorna platåer av konstant kraft. Varje platå var försedd med en sigmoidal kurva för att bestämma desorptionskraften och desorptionslängden. De observerade desorptionskrafterna motsvarade tidigare erhållna värden.När mer än en polymer fäst vid AFM cantilever spets, kaskader av platåer observerades i kraft förlängning kurvor. Med två polymerer bifogas, en bimodal fördelning hittades för desorption längd medan desorption kraft visade en smal fördelning. En funktionaliserad AFM cantilever spets kan användas för att kvantifiera kraft svar av enstaka molekyler i en flytande miljö och med yttre stimuli.Användningen av ren utrustning, lösningsmedel, AFM cantilever tips, och upprepade sköljning är mycket viktigt att nå en hög nivå av renlighet som bör bekräftas före de beskrivna kontrollerade experiment. De presenterade protokollen och förfarandena banade väg för bättre förståelse av stimuli responsiva polymersystem. Resultaten kan jämföras direkt med molekylära dynamiska simuleringar.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Mikroflödes On-chip Capture-cykloadditionsreaktion att reversibelt Immobilisera små molekyler eller flerkomponent Strukturer för Biosensor Applications

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent Bindning av BMP-2 på ytorna med en själv monterade monolager Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Aktivera molekyler, joner, och fasta partiklar med Acoustic Kavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Insikter Interaktioner av aminosyror och peptider med oorganiska material med hjälp av enda molekyl Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektroimpedansspektroskopi som ett verktyg för elektrokemisk hastighet konstant uppskattning

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Syntes av informationsbärande peptoider och deras Sekvensregisserade Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

En Femtoliter Droplet Array för massivt parallell proteinsyntes från single DNA-molekyler

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Självmontering av Hybrid Lipidmembran dopade med hydrofoba organiska molekyler vid Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force mikroskopi kombinerat med infraröd spektroskopi som verktyg för att sondera en bakteriekemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...