Name: covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy
Uploaded: 2020-03-16T14:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

B.N.B. ve T.H. Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından finanse edilmektedir - EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807 ve hibe HU 997/1-13 (proje # 420798410). M.G., Hessen Eyaleti Yüksek Öğretim, Araştırma ve Sanat Bakanlığı tarafından yapılan LOEWE Projesi iNAPO çerçevesinde kısmi destek kabul ediyor. Biz Dr Wolfgang Bronner ve Dr Agne Zukauskaite Fraunhofer Enstitüsü Uygulamalı Katı Hal Fizik IAF yüksek kaliteli altın kaplı silikon gofret bağışı için teşekkür ederiz.

NOT: Şematik bir bakış için Şekil 1'e bakın.
1. Reaktif kurulumu
NOT: Bu protokol için kullanılan polimerler şunlardır: maleimide-polietilen glikol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), tiyol-polietilen glikol-tiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol terminated poli(N-izopropylarilamid) (PNiPAM-SH, 637 kDa) ve tiyol sonlandırılmış polistiren (PS-SH, 1.3 mDa).
<ol><li>Iyi tanımlanmış ve yüksek molar kitle PNiPAM-SH atom transferi radikal polimerizasyon yoluyla hazırlayın, dönüşüm ve bir tiol moiety giriş için fonksiyonel son grubun azaltılması takip, literatürde açıklandığı gibi18. Ayrıntılı yapılar için şekil 1'e bakın.</li>
	<li>Kimyasalların saklanması için, atmosferik oksijen ve neme maruz kalmamak için azot atmosferli kuru bir torpido kutusu sistemi içinde daha küçük aliquotlar hazırlayın. PEG ve PNiPAM higroskopik45,,46 ve PEG fonksiyonel son grupları, PNiPAM ve PS ortam koşullarında depolandığında kolayca okside olduğu bilinmektedir33,47,48. Tüm kimyasallar -20 °C'de depolanmalıdır.</li>
	<li>Analitik sınıf çözücüler veya daha yüksek kullanın. Ayrıca, afm kantilevers yongaları ve cam gereçleri durulamak için ultra saf su kullanın, çünkü tek molekül deneyleri tüm kontaminasyona karşı çok hassastır.</li>
</ol>2. Ekipman Kurulumu
NOT: Paslanmaz çelik veya camdan yapılmış cımbız ve gagalar kullanın. Güvenli bir tutuş için ters cımbız kullanın (örn. düşük yay sabitine sahip model R3 SA).
<ol><li>Temiz cam ve cımbız için RCA (ultrasaf su, hidrojen peroksit ve amonyon (5:1:1)) çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Bir kabına damarları koyun ve cam veya cımbız tamamen kaplı olana kadar RCA ile doldurun.</li>
	<li>Kabı adım 2.2'den 80 °C'de 1 saat e ısıtın.</li>
	<li>Damarları daha sonra ultra saf suyla durulayın, ta ki keskin bir koku artık kesinlenene kadar (en az üç kez).</li>
	<li>Fırında kuru cam eşyalar ve cımbız (120 °C).</li>
</ol>3. İpucu işlevselleştirme
NOT: Organik buharların solunmasını önlemek için tüm adımlar duman kaputunda yapılmalıdır. Ayrıca eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması gerekmektedir. Kontaminasyonu önlemek için her adımda nitril veya lateks eldiven kullanın. Tolüen kullanırken solvente dayanıklı eldivenler takın. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar RT'de yapılır.
<ol><li>AFM cantilever çipMLCT-Bio-DC oksijen plazma uygulayarak yüzey aktivasyonu gerçekleştirin. NOT: Daha fazla işlevselleştirme adımları için plazma tedavisinin etkinliği plazma odasındaki oksijen içeriği ile ölçeklenir.<ol>
<li>AFM kantilever yongalarını plazma haznesine (40 kHz, 600 W) yerleştirmek için taze temizlenmiş cımbız kullanın.</li>
		<li>Özel modifiye aktivasyon programı kullanın: tahliye (0.1 mbar) – bir basınç oksijen ile sel: 0.2 mbar (4 dk) - plazma süreci (güç: 40%, süre: 2 dk, proses basıncı: 0.2 mbar).</li>
		<li>Havadan AFM cantilever yongaları kirletici maddelerin herhangi bir adsorpsiyon önlemek için hemen adım 3.2.2 ile havalandırma ve devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanizasyon ve PEGiletion NOT: Zamanlama adımları arasında kritik bir parametredir. Bekleme süresince mümkün olduğunca taze çözümler hazırlayın. Maleimid grupları sulu ortamda hidrolize maruz kalır ve tiyollerçözeltisi 33,,47 afm uç fonksiyonelleştirme reaksiyonlarını engelleyen disülfürlere kolayca oksitlenirler.<ol>
<li>Çözücüye dayanıklı plastik veya cam tüplerde tolüen (1,25 mg/mL) bir silane-PEG-mal çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin 6 mL'ini düz Petri kaplarında, her biri 3 mL dökün. NOT: SMFS deneyinde birden fazla probu polimerin infatif edilmesi gözlenirse, silane-PEG-mal ile fonksiyonel olmayan silane-PEG'in karıştırılması bağlantı noktalarının sayısını azaltabilir. Farklı kütleler (yani, kontur uzunlukları) ile passivation tabakası PEG ayarlama içinkullanılabilir 27.</li>
		<li>AFM cantilever yongalarını silane-PEG-mal çözeltisi (Petri kabı başına 10 fiş) 3 saat boyunca 60 °C35'te3.1.3 adımdan hemen sonra inkübe edin.</li>
		<li>Petri tabaklarını fırından alın ve çözeltinin en az 10 dakika soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Her AFM cantilever yongası dikkatle durula. Örneğin, çözeltiye daldırırken bu yongaları hafifçe yatırarak, hava-çözücü arayüzünü geçerken kılcal kuvvetlerin AFM kantili üzerindeki etkisini azaltın.<ol>
<li>PEG ve PS polimerleri için toluen ile üç kez durulayın.</li>
			<li>PNiPAM polimeri için bir kez tolüen ve iki kez etanol ile durula.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kontrol AFM cantilever yongaları olarak en az iki AFM cantilever yongaları seçin, adım atlayarak 3.3 ve çözücü polaritesini artırmak için aşağıdaki gibi durulayın:<ol>
<li>PEG ve PS polimerleri için, etanol ile iki kez ve ultra saf su ile bir kez durulayın.</li>
			<li>PNiPAM polimeri için ultra saf suyla iki kez durulayın. NOT: Kontrol AFM cantilever yongaları polimer eki (adım 3.3) hariç tüm işlevselleştirme adımlarından geçmiştir. İşlevselleştirme işleminin temizliğini, AFM cantilever talaş tutucu sistemini, Yüzeyleri ve SMFS deneyi için kullanılan çözücüleri kanıtlamaya hizmet ederler.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kovalent polimer eki NOT: AFM kantilever ucu tamamen maleimid grupları ile kaplı olması bekleniyor olsa da, tek prob polimer için sadece birkaç bağlayıcı siteleri vardır, maleimid inaktif PEGs giden suda hidroliz uğrar çünkü47. Bu inaktif PEGs bir pasif tabaka olarak hareket, yukarıda açıklandığı gibi.<ol>
<li>3 mL Petri kaplarında aşağıdaki polimer çözeltilerinden birinde 3.2.5 adımdan sonra doğrudan inkütürün AFM cantilever yongaları. İlgili polimer düzgün bir şekilde çözülmezse, 40 °C'lik bir su banyosu kullanın ve çözeltiyi iyice karıştırın. NOT: Tiyol sonlandırılmış polimerlerin kullanımı silane-PEG-mal maleimid grupları ile reaksiyonu engelleyen disülfür bağlarının oluşumuna yol açabileceğinden, özellikle suda çözünen polimerler için sulu tamponlarda 3.3 adım uygulanıyorsa bir azaltıcı ajan önerilir33.<ol>
<li>PEG ve PS polimerleri için 60 °C'de 1 saat tolüen de 1,25 mg/mL konsantrasyon kullanın.</li>
			<li>PNiPAM polimerleri için RT'de 3 saat boyunca etanolde 1.25 mg/mL konsantrasyon kullanın. NOT: SMFS deneyinde birden fazla probu polimerinin bağlanması gözlenirse, polimerkonsantrasyonu azaltılmalıdır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her AFM cantilever yongası dikkatle durula.<ol>
<li>PEG ve PS polimerleri için toluen ile iki kez, etanol ile iki kez ve 10 dakika soğuduktan sonra bir kez ultra saf su ile durulayın.</li>
			<li>PNiPAM polimerler için, etanol ile iki kez, ultra saf su ile iki kez durulayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her AFM cantilever yongası, bir deneyde kullanıma kadar ultra saf su yla dolu küçük (1 mL) petri kabında 4 °C'de ayrı ayrı saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Yüzey hazırlama
<ol><li>Silikon oksit gofret NOT: Bu yüzey PEG ve PNiPAM ile SMFS için kullanılmıştır.<ol>
<li>Bir elmas bıçak kullanarak küçük parçalar halinde bir silikon oksit gofret kesin.</li>
		<li>Silikon oksit parçalarını ayrı ayrı mikrosantrifüj tüplere koyun ve bu tüpleri etanol ile doldurun.</li>
		<li>10 dakika boyunca silikon oksit parçaları sonicate.</li>
		<li>Silikon oksit parçalarını iki kez etanol ile durulayın ve bir azot akışı altında dikkatlice kurulayın. Hemen silikon oksit parçaları kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Altın üzerinde hidrofobik alkan tiyol kendi kendine monte monolayer (SAM) NOT: Bu yüzey PS'li SMFS için kullanılmıştır. SAM'larhakkında daha fazla bilgi için literatür39,49'a bakın.<ol>
<li>4.1.1 – 4.1.4 adımlarını gerçekleştirmek için altın kaplı silikon gofret (A [100], 5 nm titanyum, 100 nm altın) kullanın.</li>
		<li>Yüzey parçalarını 18 saat boyunca 1-dodecanthiol çözeltisi (2 mM) ile inküler.</li>
		<li>Taze hazırlanmış SAM'ları etanolle iki kez durula.</li>
		<li>Doğrudan kullanım için azot akışı na sahip kuru SAM'lar veya daha sonra kullanım için 4 güne kadar etanolde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Veri toplama
NOT: Burada gösterilen tüm ölçümler, sıcaklık değişimi için ısıtma ve soğutma numunesi aşaması kullanılarak Cypher ES AFM ile ultra saf suda gerçekleştirilmiştir. Genellikle, sıvılarda ölçme özelliği sağlayan tüm AfM'ler kullanılabilir.
<ol><li>İşlevselleştirilmiş AFM cantilever çipini AFM'ye takın.</li>
	<li>Hazırlanan yüzeyi sıvılarda ölçüm için uygun bir numune tutucuya yapıştırın (örn. Yüksek Çözünürlüklü Çoğaltıcı Bileşik 101RF veya UV kürlenebilir yapıştırıcı). NOT: Bu yapıştırMa ajanları son derece durağan ve çok sayıda polar çözücüye karşı dayanıklıdır. Yapıştırıcının polar olmayan çözücülere (örn. toluen veya hekzane) veya yüksek sıcaklıklara karşı direnci kullanılmadan önce kontrol edilmelidir.</li>
	<li>AFM kantilever çipini ve sonda örneğini sıvıya batırın: ultra saf su. NOT: AFM kantilever talaş tutucusuna bir çözücü damlası (yaklaşık 100°L) yatırılabilir. AFM cantilever yongasının çözücü ile kaplanması kılcal kuvvetleri azaltır, aksi takdirde hava-çözücü arabiriminden geçen numune yüzeyine yaklaşırken AFM kantilüzerinde hareket eder.</li>
	<li>Gerekirse, sıcaklığı ayarlayın ve sistemin dengelemesi için izin verin. NOT: Sıcaklık değişiklikleri alüminyum veya altın gibi yansıtıcı kaplamaile AFM cantilevers için bimetalik etkisi nedeniyle AFM cantilever bir sapma neden olabilir. Sapma sinyalinde daha fazla değişiklik gözlenmeyene kadar (MLCT-Bio-DC için 15 dakikaya kadar) yüzeyden (birkaç μm) uzak bir şekilde dengelenmelidir.</li>
	<li>İşlevselleştirme yaşlanma herhangi bir etkisini dışlamak için rasgele sıcaklık değişir. Uygulanan sıcaklıkların AFM kantilinin geri dönüşü olmayan bükülmesine yol açmadığından emin olun. NOT: Çözücü özellikleri (buharlaşma veya viskozite değişiklikleri gibi) üzerindeki herhangi bir sıcaklık etkisi deneylerinizi engelleyebilir. Sunulan örneklerde sıcaklık, 10 K'lık basamaklarda 40 K'ye kadar bir aralıkta, çözücü olarak su alarak (örneğin, 278 K'den 318 K'ye) değişmekteydi.</li>
	<li>Sert bir yüzeye (silikon oksit gibi) kuvvet uzatma eğrileri alarak InvOLS'i (ters optik kol hassasiyeti) belirlemek için yüzeye yaklaşın. Bunun için fotodedektörün (V' deki) piezo mesafesinin sapma sinyalini alın ve doğrusal bir fonksiyon kullanarak AFM kantilever ucunun alt takim yüzeyine (itici rejim) girintilatını temsil eden parçanın eğimini belirleyin. Hataları azaltmak için, son InvOLS değerini elde etmek için en az beş değerin ortalamasını alın. Daha fazla bilgi için, literatür4,,39bakın . NOT: InvOLS sadece sert yüzeylerde güvenilir bir şekilde belirlenebilir. Yumuşak yüzeyler veya arayüzler üzerinde yapılan deneylerde yumuşak yüzeylerinize yakın sert bir yüzey yerleştirdiğinizden emin olun. Daha sonra, InvOLS kalibrasyonu, AFM kurulumunu sökmeye gerek kalmadan yumuşak yüzey deneylerinizden önce veya sonra yapılabilir.</li>
	<li>Yay sabit tayini için, AFM kantilever ucu ve yüzeyi (birkaç μm) arasında ne çekici ne de itici etkileşimler ile AFM cantilever yüksekliğe taşıyın. Daha sonra, güç spektral yoğunluğu (PSD) vs frekans çizilir bir termal gürültü spektrumu kaydedin. Aşağıdaki adımlar genellikle ticari AFM yazılımında otomatik dahili işlevler tarafından gerçekleştirilir: birincisi, elde edilen termal gürültü spektrumu PSD'ye bir fonksiyon takılarak analiz edilir, örneğin basit bir harmonik osilatör (SHO). Uyum, birinci ve ikinci rezonans arasında minimuma kadar yapılır. İkinci olarak, PSD vs frekans çiziminin donatılmış kısmının altındaki alan, AFM kantilinin dikey yönde ortalama kare deplasmanını temsil eden olarak belirlenir. Son olarak, denklik teoremi AFM cantilever kuvvetsabiti 28,50elde etmek için kullanılır. NOT: AFM kantilinin ilk rezonans tepe noktasını içeren uygun bir frekans aralığı kullanılmalıdır. Tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, mümkün olan en yüksek frekans çözünürlüğü ile en az 10 PSD birikmelidir.</li>
	<li>Deneyi başlatın. Herhangi bir yerel yüzey etkisinden (örn. yabancı maddelerin, çıkıklar) ve ortalama farklı yüzey alanlarına karşı güç uzantısı eğrileri (örneğin, 20 x 20 μm2'lik bir alan için 10 x 10 puan) alarak kuvvet haritalarını kaydedin. NOT: Tipik parametreler, yeterli çözünürlüğü sağlamak için 1 μm/s çekme hızı ve 5 kHz örnekleme hızıdır. Çekme hızı farklı olduğunda örnekleme hızı uyarlanmalıdır. Geri çekme mesafesi, ölçülen polimerin kontur veya desorpsiyon uzunluğuna (beklenen uzunluğun yaklaşık iki katı) uyarlanmalıdır.</li>
	<li>Tek polimerin yüzeye yapışmasını sağlamak için çalışma süresini kullanın ve yüzeye doğru değiştirin (genellikle 0 - 5 s).</li>
	<li>Sistemin tutarlılığını ve stabilitesini kontrol etmek için deneyin sonunda InvOLS ve yay sabitinin belirlenmesini tekrarlayın. NOT: Polimer ve yüzey arasında güçlü yapışma için, kalibrasyon işlevselleştirme korumak için gerçek deneyden sonra yapılabilir.</li>
</ol>6. Veri değerlendirmesi
NOT: Veri değerlendirmesi için, aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için Igor Pro'ya dayalı özel olarak yazılmış bir yazılım kullanılmıştır.
<ol><li>Ham sapma sinyalini (Volt cinsinden) kaydedilen InvOLS ve belirlenen yay sabiti ile çarpımıyla kuvvet değerlerine (Newtoncinsinden) dönüştürün.</li>
	<li>Gerçek uzantısı (uç-yüzeymesafesi)elde etmek için piezo elemanları tarafından dikey yönde sürülen mesafeden AFM kantilinin sapmasını (InvOLS ile ham sapma sinyalinin çarpımından sonra) çıkar.</li>
	<li>Son olaydan sonra doğrusal bir işlevi taban çizgisine takarak ve kuvvet uzatma eğrisinden aynı sıyrık çıkararak sürüklenme için elde edilen kuvvet uzatma eğrilerini düzeltin. Monte edilen parça, AFM kantilever ucu ile altta yatan yüzey arasında ne çekici ne de itici etkileşimlerin gözlenmediği yüzeyden yeterli bir uzantıyı temsil etmelidir. Daha sonra, taban çizgisi sıfır eksenine ayarlanır. NOT: Altın gibi yüksek yansıtıcı yüzeylerde ölçümler olması durumunda parazitler ortaya çıkabilir. Bunlar lazer ışınının yüzeyden ve AFM kantilinin arkasından kısmi yansımasısonucuortaya çıkar. Yani, elde edilen kuvvet uzatma eğrileri dikey uzantısı boyunca bir sinüzoidal kuvvet sinyali artifakı gösterebilir. Bu son kuvvet değerlerini engelleyen bir obje. Bu kuvvet uzatma eğrilerini hala hesaba katabilmek için bir düzeltme mümkündür (Şekil 2).</li>
	<li>Parazitler kuvvet uzatma eğrilerinde görünürse, spesifik olmayan yapışma ve aynı sinüsoidal artifak (yani genlik ve faz)(Şekil 2A)dışında başka olaylar gösteren temsili bir kuvvet uzatma eğrisi (geri çekme eğrisi) seçin. NOT: Parazitin düşük frekans deseni elde etmek için temsili kuvvet uzatma eğrisini düzleştirin.</li>
	<li>Düzeltilmesi gereken bir kuvvet uzatma eğrisi seçin (Şekil 2B).</li>
	<li>6.4 adımlarından her iki kuvvet uzatma eğrisini de yerle bir edin. ve 6.5. her ikisinin de aynı sinüzoidal artifa (yani genlik ve faz) gösterdiğinden emin olmak için (Şekil 2C).</li>
	<li>(Düzgünleştirilmiş) kuvvet uzatma eğrisini kuvvet uzatma eğrisinden çıkararak sinüzoidal taban çizgisi yerine düz bir anaçizgiye doğru düzeltilmelidir (Şekil 2D). NOT: Temsili eğrinin spesifik olmayan yapışma tepe noktasının eğrilerde görünen tek moleküllü olaylardan farklı olduğuna dikkat edin. Aslında, temsili eğriseçimi uygun bir düzeltme için çok önemlidir.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

AFM tabanlı SMFS polimer fiziğinde tek molekül etkileşimleri araştırmak için önemli araçlardan biridir. Gerçek bir tek molekül deneyi için, prob polimerinin Bir AFM kantilever ucuna kovalent bağlanması esastır.
Birçok önceki çalışmalar nanofishing deneyler, özellikle PNiPAM, polimerler bir yüzeye adsorbe ve daha sonra rasgele bir AFM cantilever ucu30,kullanarak substrat onları seçerek gerilmiş dayanmaktadır ,31. Bu sonuçları değiştirebilir ve tek molekül davranışıyanlış yorumlanmasına yol açabilir. Komşu polimerlerle etkileşimler hariç tutulamaz, çünkü burada, ortak etkiler sonuçlara hakim olabilir. Bu sonuçlar üzerinde büyük bir etkisi vardır, tek izole moleküllere göre toplu olarak önemli ölçüde farklı davranış gösteren polimerler özellikle57,58.
Burada sunulan işlevselleştirme protokolü güvenilirdir ve kontur uzunluklarına, hidrofobikliklerine veya monomerlerin sterik engeline bakılmaksızın farklı polimerlere kolayca uygulanabilir. Ayrıca, tek probu polimer ived polimeri ile AFM cantilever ucu ile AFM kantilever ucu ile altta yatan yüzey arasındaki istenmeyen etkileşimleri önlemek için bir pasifasyon sağlanır. Ayrıca, germe olaylarını gösteren kuvvet uzatma eğrilerinin değerlendirilmesi gösterilir. Burada, ana kuvvet uzatma eğrilerinin belirlenmesi için bir yordam önerilmektedir. Bu, kuvvet uzatma davranışı üzerinde sıcaklıkla ilgili etkileri ortaya çıkarmak için daha iyi bir araç sunar. Ayrıca, sürekli kuvvet platoları içeren tek moleküllü desorpsiyon olaylarının analizi sağlanır. Ayrıca, kuvvet uzatma eğrilerinde sinüzoidal kuvvet sinyal yapılarını düzeltmenin basit bir yolu, aksi takdirde deneyin sonuçlarını bozabilir verilmiştir.
Stetter ve ark.39ile karşılaştırıldığında, burada sunulan işlevselleştirme prosedürü dört yerine üç adıma indirgenir ve prosedürün sağlamlığı artırılır. Tek adımda PEGiletion ve silanization gerçekleştirmenin en büyük yararı daha iyi kontrollü bir reaksiyona sahip olmak ve verimi artırmaktır. Ayrıca, daha az çözüm hazırlanması ve daha az durulama adımı gereklidir. Bu, hazırlama çabasını ve süresini azaltır ve tekrarlanabilirliği artırır. Ayrıca, AFM cantilevers hareketli her zaman işlevselleştirme sürecinin önemli bir parçasıdır. Bir çözümden diğerine aktarım her zaman hava-su arabirimi üzerinden yapılan aktarımlar veya cımbızların yanlış kullanımı yla AFM kantileverlerini kaybetme nedeniyle işlevselleştirme kalitesini güçlü bir şekilde etkileme riski taşır.
Tek bir polimerin AFM kantilever ucuna uygun kovalent eki olduğunu kanıtlamak için farklı koşulların karşılanması gerekir. İlk olarak, kontrol AFM kantilevers önemli önemtaşımaktadır ve her işlevselleştirme için hazırlanmalıdır. Az sayıda kuvvet uzatma eğrisi kontrol deneyinde uzanır veya platolar gösterirse (sunulan örneklerde %2'den az) işlevselleştirme işlemi ve deneyleri gerçekleştirmek için sıvı hücresi yalnızca temiz olarak kabul edilir.
Daha fazla damla veya maxima ile net bir germe deseni uygun tek molekül germe olayları olması için gereklidir. Ayrıca, kopma kuvvetinin kopma hızındaki bağımlılığı veya germe eğrisinin tam elastik tepkisi analiz edilmelidir, birden fazla polimerin aynı anda desorpsiyonunun dışlanabilmesi için59,60. PEG ve PNiPAM için, yüzeyin farklı konumlarında alınan kuvvet uzatma eğrilerinin %19 ve %42'si sırasıyla böyle bir germe deseni göstermiştir. Germe olaylarını elde etmek için polimerin ilgili alttaki yüzeye physisorption güçlü olmalıdır. Aksi takdirde plato benzeri bir desorpsiyon olayı gözlenir. Bu, yüksek kuvvetlerde (500 pN veya daha fazla) germe olaylarının tespiti için daha da belirleyicidir. Bu güçlü fizyorpsiyon her kuvvet uzatma eğrisi için karşılanmadığı için, bu tür olayların verimi saf plato benzeri desorpsiyon olaylar için daha azdır. Alternatif olarak, polimer ve altta yatan yüzey arasında kateşoller veya chemisorpsiyon gibi güçlü bir şekilde yapışan gruplar kullanılabilir. Ancak, bu polimer61,,62de daha fazla fonksiyonel grupların veya bağlantı sitelerinin giriş gerektirir.
Aslında, polimerin kütlesi (yani kontur uzunluğu) değerli bir parmak izi sağlar. Kütle aşağıdaki nedenlerden dolayı ölçülen kontur uzunluğuna doğrudan çevrilemese de, uzunluk dağılımı tek moleküllü olayları tanımlamak için çok değerlidir. Düşük polidispersitliğe sahip bir PNiPAM polimeri durumunda(1.28) elde edilen germe olaylarının (ve dolayısıyla polimer uzunluğunun) uzatma değerlerinde önemli farklılıklar bulduk. Bunun bir nedeni polimer uzunluğu ve dağılımının belirlenmesi olabilir. Boyut dışlama kromatografisinde (SEC), hedef polimerin göreceli ağırlığı PS veya poli (metil metakrilat) (PMMA)63gibi standartlara göre belirlenir. Hedef polimerin hidrodinamik yarıçapı ve standart önemli ölçüde farklı olabilir, çünkü tahmin edilen göreli ağırlık mutlak moleküler ağırlık sapma bekleniyor. Ayrıca, silane tabakası işlevselleştirme işlemi sırasında toluen sahte su ile oliomerize olabilir. Bu tür oligomerlerin AFM kantilever ucuna bağlanması, daha az bağlantı noktası64olan daha esnek bir katmana yol açar. Ayrıca, silikon tabakasına polimer in ek noktası mutlaka tespit uzunluk değerleri29bir kayma yol açan tepe de olmayabilir. Solucan zinciri (WLC) veya serbestçe eklemli zincir (FJC) modeli gibi bir polimer modeli peg veya PNiPAM için ilgili kuvvet uzatma davranışını tüm uzatma aralığı18,29,,41,,65,66üzerinden düzgün bir şekilde yeniden üretemezken, böyle bir polimer modeli diğer polimerik ve protein sistemleri10,15,67,68.68
Tek bir PS polimerin kovalent eki (kontur uzunluğu 1 μm'den fazla) sadece, önemli sayıda kuvvet uzatma eğrisi nin yeterince uzun bir sabit kuvvet platosu gösterdiğinde başarılı olduğu kabul edilir(Şekil 5). Tek bir polimerin desorbing insorbing kaynaklanan bir plato, Şekil 5A'dabelirtildiği gibi, belirli bir uzantıda taban çizgisine sabit bir kuvvetin tek bir keskin damlası ile tanımlanır. AFM kantilever ucuna daha fazla polimer takılıysa,56 (Şekil 5C)platolar bir çağlayan gözlenir. Plato uzunluğu (desorpsiyon uzunluğu), polimer kontur uzunluğu ile ilişkili51,altta yatan yüzeye AFM cantilever ucu (burada yaklaşık 200 nm) spesifik yapışma nedeniyle herhangi bir yapışma tepe önemli ölçüde daha uzun olmalıdır. Yalnızca tek bir kuvvet uzatma eğrisinde görünen özellikler yorumlanmamalıdır. Sunulan deneylerde, 100 eğriden en az 80'i yüzeydeki iki farklı noktada en az iki kuvvet haritasında 200 nm'den daha uzun bir plato gösterdi. Ayrıca, Şekil 5B ve 5D'deverilen dağılım çizimlerini kullanarak desorpsiyon uzunluklarının dağılımı, AFM kantilever ucuna bağlı olup olmadığını ve kaç polimerin bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. PS durumunda, kuvvet uzatma eğrilerinin platolarından alınan desorpsyon kuvveti ve uzunluğunun dar dağılımı başarılı bir kovalent eki nin kanıtı olarak hizmet vermiştir. Bu sonunda işlevselleştirme protokolünün başarısını kanıtladı. Bu nedenle, bu kuvvet ve uzunluk dağılımlarını yayınlarda sunmayı şiddetle tavsiye ediyoruz.
Birçok önceden ayarlanmış parametreyi içeren yerleşik algoritmalar kullanılarak kuvvet uzatma eğrilerinin değerlendirilmesi özenle yapılmalıdır. Örneğin, uygulanan her çekme hızı için sabit bir örnekleme hızının uygun olmaması veya kuvvet uzatma eğrilerinin otomatik olarak yumuşaması önemli ayrıntıların ortalamasını alabilir. Genellikle ilgili değerlendirme prosedürünün doğru anlaşılması, değerlendirme prosedüründeki hataları önleyebilir ve bu da AFM tabanlı bir SMFS deneyinin son bulgularını güçlü bir şekilde etkileyebilir.
Özetle, güvenilir ve çeşitli polimerlere kolayca uygulanabilen bir işlevselleştirme protokolü salıyoruz. Ayrıca, tek molekülkuvvet-uzatma eğrilerinin doğru değerlendirilmesi sunulur, bu da germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu gibi fiziksel parametrelerin belirlenmesine olanak sağlar. Sunulan protokoller ve prosedürler, tek molekül düzeyinde uyaranduyarlı sistemlerin araştırılması için değerlidir.

1980'lerde icadından bu yana,1,atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sub-nanometre mekansal çözünürlük, alt pikonewton kuvvet çözünürlüğü ve çeşitli çözücü ve sıcaklıkkoşullarındaölçme imkanı 2 ,3,4,5,,6,7içeren doğa biliminin en önemli görüntüleme tekniklerinden biri haline gelmiştir .
Görüntüleme dışında8,9, AFM tek molekül kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için kullanılır (SMFS) tek bir polimer ve yüzeyler arasındaki yapışkan etkileşimleri içine fikir veren, tek polimerlerin fiziksel özellikleri ve proteinlerin gelişen mekanizmaları7,10,11,12,13,14,15,16. Normal bir SMFS deneyinde, işlevselleştirilmiş kantilever ucu bir yüzeyle temas eder, böylece AFM'deki polimer bu yüzeye fizorbs uç. AFM kantilite ucunu yüzeyden geri çekerek, AFM kantilinin sapmasındaki bir değişiklik kuvvet uzatma eğrisine giden bir kuvvete dönüştürülür4. Germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu gibi fiziksel parametreler çekme hızı, yüzeyde çalışma süresi, yüzeye girinti derinliği, sıcaklık, çözücü17,,18 ve katı yüzeyler, polimer filmler veya desteklenen lipid bilayers19,20,21,22gibi farklı parametrelere bağlı olarak belirlenebilir. Ayrıca, bir polimer farklı mekansal yönlerde incelenmiş olabilir, böylece polimer sürtünme özellikleri araştırarak23,24,25,26.
Bu tür çalışmalar için araştırılan polimerin AFM kantilever ucuna kovalent bağlanması esastır. Böylece, bir AFM cantilever ucuna bağlı bir ve aynı polimer ile tek molekül olayların yüksek verim afm cantilever27,,28,değişen ek noktaları29 veya değişen polimerler (farklı kontur uzunlukları ile) nanobalıkçılık durumunda olduğu gibi kalibrasyon nedeniyle sonuçların herhangi bir önyargı önler30,31,32. Ayrıca, diğer polimerler ile etkileşimleri yanı sıra ortalama etkileri yaygın olarak önlenebilir18,28. AFM kantilever ucuna bir polimer kovalent eki için, kimyasal değişiklikler farklı uygulanabilir, birçoğu Hermanson tarafından kitapta özetlenebilir33. Amin ve tiyol bazlı bağlama reaksiyonları yanı sıra tıklama kimyaa afm cantilever uç fonksiyonelizasyonunda en sık kullanılan yöntemleri temsil34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke ve ark.40 nasıl 1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/NHS kimya sı bir AFM kantilever ucuna bir protein eklemek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ancak, dedi fonksiyonel gruplar çapraz bağlantı eğilimindedir, böylece işlevsellik kaybına yol açan43,44. Ayrıca, karbodiimidesçözeltisi 43hızlı hidroliz eğilimi göstermektedir. Maleimid ve tiyol grupları genellikle daha kararlıdır ve çapraz bağlama reaksiyonları göstermezler. Sunulan protokol,35,39.
Burada, kontur uzunluğu veya hidrofobiklik gibi özelliklere bakılmaksızın çok sayıda farklı polimere kolayca ayarlanabilen güvenilir bir işlevselleştirme protokolü sunulmaktadır. Hidrofilik polietilen glikol (PEG) ve poli(N-izopropilerilrilamid) (PNiPAM) ve yüksek molar kütleli hidrofobik polistiren (PS) olmak üzere üç farklı polimer seçilmiştir. Uygun bir bağlayıcı molekülü ile kovalent bağlama yeteneği sağlamak için, üç polimerfonksiyonel son grup olarak teleşitik tiyol moiety sahip için seçildi. Bağlayıcı molekülün kendisi tipik olarak iki aktif siteli kısa bir PEG polimeri, bir ucunda bir silane grubu ve diğer ucunda bir maleimid grubudur. Eski AFM cantilever ucuna kovalent bir eki sağlar ve ikinci işlevselleştirilmiş yüksek molar kitle polimer tiyol grubu ile bağlayıcı bir reaksiyon. Ayrıca, inaktif PEG bağlayıcı molekülleri prob polimeri ve AFM cantilever ucu ile AFM kantilever ucu ile altta yatan yüzey arasında istenmeyen etkileşimleri önlemek için bir pasifasyon tabakası görevi görebilirsiniz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Dodecanethiol (&#8805;98%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>417364-500ML</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution (30%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>CP17.2</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cypher ES</td>
			<td>Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>AFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>PO76.1</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated silicon wafer</td>
			<td>Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for SAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Replicating Compound</td>
			<td>Microset Products Ltd, UK</td>
			<td>101RF</td>
			<td>Bonding agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Used for cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Software environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra-30-LF-PC</td>
			<td>Diener Electronic, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>Plasma chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane</td>
			<td>Creative PEG works, USA</td>
			<td>PHB-1923</td>
			<td>Linker polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>Bruker, USA</td>
			<td>MLCT-Bio-DC</td>
			<td>AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV &#60; 10 &#181;m</td>
			<td>MicroChemicals, Germany</td>
			<td>WSA40600250 P1314SNN1</td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelab Chorus 1, 18.2 M&#937; cm</td>
			<td>Elga LabWater, Germany</td>
			<td>10034-540</td>
			<td>Ultrapure water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R3 SA</td>
			<td>Vomm GmbH, Germany</td>
			<td>5803 Blank</td>
			<td>Tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide)</td>
			<td>Gallei Group, Saarland University, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>PNiPAM probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol terminated polystyrene</td>
			<td>Polymer Source, Canada</td>
			<td>P40722-SSH</td>
			<td>PS probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiol-polyethylene glycol-thiol</td>
			<td>Creative PEGWorks, USA</td>
			<td>PSB-615</td>
			<td>PEG probe polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene (99.99%)</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>T324-500</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent attachment of single molecules for afm-based force spectroscopy

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi, tek bir polimer ve yüzeyler arasındaki etkileşimleri araştırmak için ideal bir araçtır. Gerçek bir tek molekül deneyi için, sonda molekülünün kovalent eki gereklidir, çünkü ancak o zaman bir ve aynı moleküle sahip yüzlerce kuvvet uzantısı izi elde edilebilir. Tek bir molekülün tek başına incelenmiş olduğunu kanıtlamak için birçok iz gereklidir. Ayrıca, pasifasyon tek prob molekülü ve AFM cantilever ucu yanı sıra AFM cantilever ucu ve altta yatan yüzey arasında istenmeyen etkileşimleri önlemek için çok önemlidir. Burada sunulan işlevselleştirme protokolü güvenilirdir ve çeşitli polimerlere kolayca uygulanabilir. Kuvvet uzatma izlerinde karakteristik tek molekül olayları (yani, esnemeler ve platolar) tespit edilir. Bu olaylardan germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu gibi fiziksel parametreler elde edilebilir. Bu, tek molekül düzeyinde uyarıcıduyarlı sistemlerin hassas bir şekilde araştırılması için özellikle önemlidir. Örnek sistemler olarak poli (etilen glikol) (PEG), poli(N-izopropilarilamid) (PNiPAM) ve polistiren (PS) sulu ortamda SiOx (PEG ve PNiPAM için) ve hidrofobik kendinden monte edilmiş monolayer yüzeylerden (PS için) gerilir ve desorbed edilir.

Aşağıdaki örnekler, PEG, PNiPAM ve PS polimerlerinin tek molekül germe ve desorpsiyon sonuçlarını göstermektedir. Tüm AFM cantilever ipuçları yukarıda verilen protokol ile işlevselleştirilmiştir. PEG ve PNiPAM sıcaklık değişimi ile SiOx üzerinde ölçüldü. PEG ve PNiPAM için ortaya çıkan ısıya bağlı germe eğrilerinin4,27ayrıntılı bir tartışması için,51,39bkz.
Örnek 1: PEG ve PNiPAM'ın suda gerilmesi Sudaki ısıya bağlı germe davranışı, bir ucunda ki AFM kantilucuya kovalent olarak bağlanan tek PNiPAM ve PEG polimerleri kullanılarak ölçüldü ve diğer ucunda ki SiOx yüzeyinde fizyonhaline verildi. Kalibrasyon ve temiz kontrol deneylerinden sonra (kuvvet uzatma eğrilerinin %2'sinden azı tek molekül lüzumlu olayları gösterir), her AFM kantili için en az iki kuvvet eşlemi kaydedildi. Isıya bağlı deney, her sıcaklıkta en az bir kuvvet haritası kaydedilerek gerçekleştirildi. Sadece birkaç germe olayı ortaya çıktığında, ilgili AFM kantili atılır ve çipin bir sonraki AFM kantili alınmıştır (genellikle MLCT-Bio-DC'nin C, B, D ve E sırasına göre). PEG'in örnek verileri için, ölçülen 500 kuvvet uzatma eğrisinin 95'inde (%19) tek bir germe olayı gözlendi. PNiPAM için, 600 kuvvet uzatma eğrisinin 252'si germe deseni (%42) gösterdi. Kuvvet uzatma eğrilerinin daha iyi karşılaştırılması için her sıcaklık için tek bir ana eğri oluşturuldu. Bu amaçla, konformasyonel dalgalanmalar ve çözücü etkileri ihmal edilebilir olan en az 500 pN'ye kadar germe olayı olan eğriler52olarak seçilmiştir. Dikkate alınan son esneme sayısı 278 K'da 3, PEG için 318 K'da 7 ve PEG için 318 K'da 4, 278 K'da 3, PNiPAM18için 318 K'da 3.
Ana eğrileri oluşturma yordamı Şekil 3'teverilmiştir. Seçilen kuvvet uzatma eğrileri(Şekil 3A) L0 (500 pN kuvvetinde uzatma) uzunluğuna yeniden ölçeklendirilir, bkz.B Yapışma tepe yüzey ve AFM cantilever ucu arasında spesifik olmayan yapışma büyük bir varyasyon gösterir, ancak polimer germe davranışı etkilemez. Yeniden ölçeklendirildikleri kuvvet uzatma eğrileri birleştirdikten sonra Şekil 3C'desunulduğu gibi bir binominal yumuşatma ile ortalama olarak belirlenir. Bunun için, Bir Gauss filtresi verileri Pascal üçgeninden türetilen normalleştirilmiş katsayılarla, 2053parametresine eşit bir düzeyde kıvrıklar. Son olarak, Şekil 3D'deverilen her sıcaklık için bir ana eğri elde edilir. Yakınlaştırma, kuvvet uzatma davranışı üzerindeki sıcaklık etkisinin en belirgin olduğu aralığı gösterir.
PEG (A) ve PNiPAM(B)sıcaklık davranışlarının karşılaştırılması Şekil 4'tebulunabilir. PEG için artan sıcaklıkile germe kuvvetinde azalma gözlenmiştir. Sıcaklığı 278'den 318 K'ye çıkarken 100 pN'de yeniden ölçeklenen uzatmanın yaklaşık %5'inde bir artış gözlendi. PNiPAM için, zıt bir ısıya bağlı kayma ortaya çıkabilir. Sıcaklık 278'den 328 K'ye yükseltildiğinde 100 pN'de yeniden ölçeklenen uzatmanın yaklaşık %1'inde azalma gözlenmiştir. Bu moleküler dinamikleri (MD) simülasyonları18yardımı ile germe serbest enerji enerjik ve entropik katkıları ayıklamak için kullanılabilir.
Örnek 2: PS'nin suda sam yüzeyinden desorpsiyonu PS'nin sudaki bir SAM yüzeyinden bozulması, desorpsiyon kuvvetini ve uzunluğunu belirlemek ve hidrofobik etkileşimi ölçmek için kullanılabilir. Kalibrasyondan sonra, yüzeyin iki farklı noktasında en az iki kuvvet haritası kaydedildi. Polimer eki başarılı olduğunda, kuvvet uzatma eğrileri karakteristik özelliği olarak sabit kuvvet platoları gösterdi, Şekil 5A ve Şekil 5Cbakın. Yayla benzeri desorpsiyon, problanan bağların dinamiği AFM kantilever ucunun (yarı-denge) çekme hızından çok daha hızlı olduğunda gözlenir. Plato benzeri kuvvet uzatma eğrilerinin desorpsiyon kuvvetleri, kuvvet uzatma izi54'üentegre ederek doğrudan yapışmaserbest enerji sağlar. Onlar sıvı ortamda yüzeylerde tek polimerlerin elektrostatik, dağılım ve hidrofobik etkileşimleri yanı sıra sürtünme özelliklerini belirlemek için kullanılmıştır2,4,23,51,54,55.
Sabit kuvvether plato daha sonra histogramlar çizilen desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu belirlemek için bir sigmoidal eğri ile donatılmıştır. Histogramlar maksimum değer ve standart sapma ayıklamak için bir Gaussian ile donatılmıştır. Daha iyi bir genel bakış için, desorpsiyon kuvveti ve uzunluk değerleri Şekil 5B ve Şekil 5D'deverildiği gibi bir dağılım çiziminde birlikte gösterilmiştir.
Suda SAM polistiren için, belirlenen desorpsiyon kuvvetleri daha önce elde edilen değerlere karşılık gelir19,23. Desorpsiyon uzunluğu polimer kontur uzunluğu51ile ilişkili olduğu için, desorpsiyon uzunluğu dağılımı fonksiyonel uç grubu aracılığıyla AFM cantilever ucuna ilgili polimerkovalent bağlama bir kanıtı olarak kullanılabilir. Böylece, desorption uzunluğu bir parmak izi olarak hizmet vermektedir.
AFM kantilever ucuna bağlı birden fazla polimer için, kuvvet uzatma eğrileri56platolar (ayrık adımlar) basamaklı görülebilir. Her plato farklı bir uzantıda bir polimerin desorpsiyontemsil eder. Şekil 5 Figure 5C ve Şekil 5D'de verilen deney, AFM kantilever ucuna aynı anda bağlı iki polimerin tipik bir durumunu göstermiştir. Son kopma takılarak, desorpsiyon uzunluğu için bimodal dağılımı bulunabilirken, desorpsiyon kuvveti dar bir dağılım gösterdi. Bu durumda, daha küçük desorpsiyon uzunluğu şekil 5C'debelirtildiği gibi, kuvvet uzatma eğrilerinin %90'ında, tek bir plato olarak veya daha uzun platoda ek bir plato olarak bulunabilir. Elde edilen kuvvet uzatma eğrilerinin %37'sinde daha yüksek desorpsiyon uzunluğu saptandı. Böylece, desorpsiyon uzunluğu dağılımı AFM cantilever ucuna bağlı farklı polimerlerin sayısını belirlemek için kullanılabilir. Genel olarak, desorpsiyon uzunluğu değerlerinin dar bir dağılımı, elde edilen kuvvet uzatma eğrilerinde bir ve aynı polimerin incelenmiş olduğunun iyi bir göstergesidir. Aynı zamanda, bir ve aynı tek polimerin ölçülüp ölçülmediğine karar vermek için ilgili kuvvet uzantısının bir üst pozisyonu kullanılabilir.
Tek bir PS polimerin kovalent bağlanması nı kanıtladıktan sonra, bu PS polimeri ile daha fazla deney substrat (katı yüzey ve polimer filmler), çözücü koşulları, sıcaklık, çekme hızı veya çalışma süresi açısından çeşitli deneyler yapılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig1a.jpg"> Şekil 1: Uç işlevselleştirme sürecine şematik genel bakış. (1) plazma aktivasyonundan sonra AFM kantilever ucunun kimyasal modifikasyonunu içerir (2) silanizasyon/PEGilation ve (3) polimer eki. Ayrıca peg, PNiPAM ve PS gibi kullanılan polimerlerin detaylı kimyasal yapıları gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig2a.jpg"> Şekil 2: Kuvvet uzatma eğrilerinde parazitlerin ortadan kaldırılması. (A) Uzantısı boyunca bir sinüzoidal kuvvet sinyali artifakı gösteren bir kuvvet uzatma eğrisi bulun ama tek bir molekül germe olayı olan. (B) Sinüzoidal artifadan düzeltilecek tek molekül lü bir kuvvet uzatma eğrisi seçin. (C) Eğrilerin sinüzoidal artifaklarının gerçekten eşleşip eşleşmediğini kontrol etmek için eğrileri üst üste bindirin. (D) Kuvvet uzatma eğrisi ( A )(B) den çıkarılarak düz taban çizgisi olan bir kuvvet uzatma eğrisi elde edilir.B Yapışma pik daha fazla analiz için kullanılamaz rağmen, kuvvet uzantısı eğrisi şimdi tek molekül olay bölgesinde çok daha doğru kuvvet değerlerine yol açan artifakı için düzeltilir (burada: > 0.2 μm uzatma). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig3a.jpg"> Şekil 3: PEG'in kuvvet uzatma eğrilerinden ana eğrilerin 298 K'de belirlenmesi. (A) 7 kuvvet uzatma eğrisi kullanarak 298 K'da deneysel veriler. 500pN(B)kuvvetinde L0 uzunluğuna yeniden ölçekledikten sonra, kuvvet uzatma eğrileri birleştirilebilir ve bir ana eğri(C)elde ederek binominal yumuşatma ile ortalama olarak birleştirilebilir. Yeniden ölçeklenmiş eğriler nokta olarak verilirken, ana eğri düz bir çizgi olarak gösterilir. Son olarak, farklı sıcaklıklar için elde edilen ana eğrileri karşılaştırılabilir (D). Yakınlaştırma, kuvvet uzatma davranışı üzerindeki sıcaklık etkisinin en belirgin olduğu aralığı gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig4a.jpg"> Şekil 4: PNiPAM ve PEG'in ısıya bağlı ana eğrilerinin karşılaştırılması. PEG için sıcaklığı artırırken 100 pN (orta kuvvet aralığı) yeniden ölçeklendirilir uzatma artışı gözlenirken(A),PNiPAM için ise zıt bir ısıya bağlı kayma ortaya çıkarır (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60934/60934fig5.jpg"> Şekil 5: PS'nin suda SAM üzerindeki kuvvet uzatma eğrilerinin analizi. (A) Örnek kuvvet uzatma eğrisi (mavi) plato (mor) bir sigmoidal uyum ile. Ayrıca, oklar platonun belirlenen kuvvetini (kırmızı) ve uzunluğunu (yeşili) işaretler. Sigmoidal fitler tarafından elde edilen desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu değerleri bir dağılım çiziminde görüntülenir ve elde edilen histogramlar bir Gaussian ile donatılmıştır. (B) Belirlenen ortalama desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğu değerleri (112 ± 6) pN ve (659 ± 7) nm olup, kuvvet uzatma eğrilerinin %93'ü bu tür tek plato olaylarını gösterir. (C) AFM kantilever ucuna aynı anda bağlı iki polimer için örnek kuvvet uzatma eğrisi (mavi). Burada, desorpsiyon kuvveti ortalama kuvvet değeri (117 ± 5) pN olan tek modal bir dağılım gösterirken, desorpsiyon uzunluğu için ortalama uzunluk değerlerine (656 ± 9) nm ve (1050 ± 16) nm'ye giden bir bimodal dağılımı bulunabilir. (D) Örneklenmiş kuvvet uzatma eğrilerinin %90'ı sadece tek plato olayları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60934/60934fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, polimerlerin mekanik ve yapışkan özelliklerini tanımlayan fiziksel parametreleri ölçmemizi sağlar. Tek molekülleri incelemek için AFM tabanlı kuvvet spektroskopisi kullanırken, bu moleküllerin kovalent olarak Bir AFM kantilever ucuna bağlanması için güvenilir ve verimli bir protokole sahip olmak gerekir. Bu protokol, kontur uzunluğu veya hidrofobiklik ne olursa olsun birçok farklı polimerler için kabul edilebilir.Organik buharların solunmasını önlemek için tüm adımlar duman kaputunda yapılmalıdır. Ayrıca, solvente dayanıklı cam, laboratuvar önlüğü ve göz koruması gereklidir. İlk olarak, Plazma odasına AFM kantilever talaşları yerleştirmek için taze temizlenmiş cımbız kullanın.Başlat ve sonra evet seçerek plazma odası yüzey aktivasyon programı başlatın. Plazma işleminin düzgün çalıştığını doğrulayın. Yüksek oksijen içeriği olan bir plazma işlemi açık mavi bir renk gösterir.Yüzey aktivasyon programı yürütülürken, mililitre başına 1,25 miligram konsantrasyon elde etmek için toluen içinde silane-PEG-mal çözünür. Çözeltinin üç mililitresini düz bir Petri kabına yerleştirin. Plazma işlemi tamamlandıktan sonra, onay seçerek plazma odasını havalandırın ve sonra havalandırma.Kirleticilerin emilimini önlemek için hemen bir sonraki adıma geçin. Cipsleri Petri kabına yerleştirin ve talaşları 60 derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Petri kabını fırından çıkarın ve en az 10 dakika soğumasını bekleyin.Sonra, cipsleri durula. PEG veya polistiren bağlanması için talaşları üç kez tolüen ile durulayın. Polinipam bağlanması için talaşlar toluen ile bir kez, etanol ile iki kez durulanmalıdır.Kapiller kuvvetlerin AFM kantili üzerindeki etkisini azaltmak için, durulama yaparken talaşları hafifçe yatırın. AFM cantilever yongaları deneyi etkileyebilecek fiziksel polimerlerin fazlalıklarını gidermek için düzgün bir şekilde durulanmalıdır. AFM kantilevers herhangi bir zarar görmesini önlemek için durulama dikkatle yapılmalıdır.Son olarak, kovalent polimer eki geçmeyecek kontroller olarak hizmet vermek için en az iki fiş hazırlayın. PEG ve polistiren yongalarına karşı kontroller için, etanol ile iki kez ve bir kez su ile durulayın. Polinipam yongalarına karşı kontroller için suyla iki kez durulayın.PEG veya polistiren kovalent eki gerçekleştirmek için, mililitre başına 1,25 miligram konsantrasyonda tolüen polimer çözeltisi üç mililitre hazırlamak. Bir Petri kabına çözelti ve cips ekleyin ve bir saat boyunca 60 santigrat derece cips kuluçka. PEG veya polistiren ile kuluçkadan sonra, talaşların 10 dakika soğumasını bekleyin.Talaşları toluen ile iki kez, etanolle iki kez ve bir kez de suyla durulayın. Polinipam kovalent eki gerçekleştirmek için, mililitre başına 1,25 miligram konsantrasyonda etanol polimer çözeltisi üç mililitre hazırlamak. Çözeltiyi ve talaşları petri kabına ekleyin ve talaşları oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın.Polinipam ile kuluçkasonra, etanol ile iki kez ve su ile iki kez cips durulayın. Bir deneyde kullanıma kadar talaşları saklamak için, her çipi su yla dolu bir mililitrelik Petri kabına ayrı ayrı yerleştirin. Petri tabaklarını dört santigrat derecede tutun.İlk olarak, işlevselleştirilmiş AFM cantilever çipini bir talaş tutucuya takın. Hazırlanan yüzeyi sıvı daki ölçümler için uygun bir numune tutucuya yapıştırın. Çipi suya batırmak için bir pipet kullanın.Örnek yüzeyi AFM'ye monte edin. Örnek yüzeyi suya batırın. Talaş tutucuyu AFM'ye bağlayın.Daha sonra çipi numune yüzeyine yaklaştırın. Hedef sıcaklığı ayarlamak ve modu ve geri bildirim radyo düğmelerini açmak için çevre panelini kullanın. Sonra sistem yaklaşık 15 dakika boyunca denge sağlar.Kuvvet uzatma eğrisi almak için, AFM kantilever ucunu yüzeye yaklaştırın ve tek kuvvet seçin. Elde edilen eğri, kırmızı renkle gösterilen yüzeye yaklaşım ve mavi ile gösterilen geri çekme ile piezo uzaklığı ile sapmayı görüntüler. Eğrinin AFM kantilever ucunun girintinini temsil eden kısmını alttaki yüzeye genişletin.Doğrusal bir uyum gerçekleştirmek için imleçleri yaklaşım veya geri çekme eğrisiüzerine ayarlayın ve bağlam menüsünden update INVOLS'u seçin. Ters optik kol hassasiyetdeğeri için ortaya çıkan değer sol üstteki panelde görünür. Bu yordamı en az beş kez tekrarladıktan sonra, ters optik kol hassasiyeti için bir ortalama hesaplayın ve panele ortalamayı girin.AFM kantilini, önceden devreye girmek için hareket etmeyi seçerek yüzeyden yaklaşık 100 mikrometre yükseklikte yerleştirin. Termal gürültü spektrumu için tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, ortalama sayıyı en az 10'a ayarlayın ve mümkün olan en yüksek frekans çözünürlüğünü seçin. Ardından, termal verileri yakalama'yı seçerek termal gürültü spektrumu kaydedin.Termal gürültü spektrumunu basit bir harmonik osilatör fonksiyonuna sığdırmak için, eğrinin ilk rezonans tepe noktasını temsil eden kısmını genişletin. Daha sonra fit'i başlatma'yı seçin. Son olarak, sığdırmazlık termal veri düğmesini kullanarak uygun rafine.Panelde ilgili kuvvet sabiti görünür. Verileri toplamaya başlamak için denemenin parametrelerini ayarlayın. Çekme hızını saniyede bir mikrometreye ayarlayın ve tetiki bir nanonewton'a ayarlayın.AFM kantilever ucuna yüzeye yaklaşın ve tek bir eğri kaydetmek ve parametrelerin el yazmasında açıklandığı şekilde ayarlanması gerekip gerekmediğini belirlemek için tek bir kuvvet seçin. Ana panelden F haritasını seçin. 100 eğrili bir kuvvet haritası elde etmek için kuvvet noktalarının ve kuvvet çizgilerinin sayısını 10'a ayarlayın.F haritasını seçerek kuvvet haritasını kaydetmeye başlayın. Herhangi bir yerel yüzey efektini önlemek ve farklı yüzey alanlarını ortalamaya çıkarmak için ızgara benzeri bir şekilde kuvvet uzatma eğrileri alın. Deneyden sonra, sistemin tutarlılığını ve stabilitesini kontrol etmek için ters optik kol hassasiyetinin ve yay sabitinin belirlenmesini tekrarlayın.Tek polinipam ve PEG polimerler kovalent bir ucunda bir AFM kantilever ucuna bağlı ve diğer ucunda silikon dioksit yüzeyinde physisorbed edildi. Isıya bağlı germe davranışını ölçmek için, ilgili kuvvet uzatma eğrisinin sonunda son bir maksimumun ardından net bir tek moleküllü germe olayı tespit edilmiştir. Sonra her sıcaklık için tek bir ana eğri oluşturuldu.PEG için, artan sıcaklıkla germe kuvvetinde azalma gözlendi. Polinipam için, ters eğilim gözlendi. Suda bir SAM yüzeyinden polistiren desorption desorption kuvvet ve uzunluğu belirlemek için kullanılabilir.Polimer eki başarılı olduğunda, kuvvet uzatma eğrileri sabit kuvvet platoları gösterdi. Her plato desorpsiyon kuvveti ve desorpsiyon uzunluğunu belirlemek için bir sigmoidal eğri ile donatılmıştır. Gözlenen desorpsiyon kuvvetleri daha önce elde edilen değerlere karşılık gelir.AFM kantilever ucuna birden fazla polimer takıldığında kuvvet uzatma eğrilerinde plato basamakları gözlenmiştir. İki polimer takılı yken, desorpsiyon uzunluğu için bimodal dağılımı bulunurken, desorpsiyon kuvveti dar bir dağılım gösterdi. İşlevselleştirilmiş bir AFM kantilever ucu, sıvı bir ortamda ve dış uyaranlarla tek moleküllerin kuvvet tepkisini ölçmek için kullanılabilir.Temiz ekipman, çözücüler, AFM cantilever ipuçları ve tekrarlanan durulama kullanımı, açıklanan kontrollü deneylerden önce teyit edilmesi gereken yüksek düzeyde temizlik sağlamak için çok önemlidir. Sunulan protokoller ve prosedürler uyarıcı duyarlı polimer sistemlerin daha iyi anlaşılması için önünü açtı. Sonuçlar doğrudan moleküler dinamik simülasyonlar ile karşılaştırılabilir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Moleküller, İyonlar, ve Akustik Kavitasyon ile Katı Parçacıklar etkinleştirilmesi

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektrokimyasal empedans spektroskopisi elektrokimyasal oranı sürekli tahmini için bir araç olarak

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

Bilgi taşıyan Peptoidlerin sentezi ve Dizi yönelimli Dinamik Kovalent Öz-montaj

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...