Name: directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

يشكر المؤلفون بنك دبي للموارد المالية على الدعم المالي ومركز تحليل النظم البيولوجية (ZBSA) لتوفيره مرفق البحث. ونحن ممتنون لP. G. شولتز، TSRI، لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية لتوفير pEVOL-pAzF plasmid. نشكر موظفي مركز تصوير الحياة (LIC) في مركز تحليل الأنظمة البيولوجية (ZBSA) التابع لجامعة ألبرت لودفيغز-فريبورغ على المساعدة في مواردهم من الفحص المجهري المحوري، والدعم الممتاز في تسجيل الصور.

1. تصميم واستنساخ البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELPs)
<ol><li>استنساخ وتصميم الهياكل كما هو موضح في مكان آخر8،20. وتتوفر البلازميدات عند الطلب.</li>
</ol>2. البروتين التعبير والتنقية والإعداد
<ol><li>التعبير عن F20E20-mEGFP و F20E20-mCherry<ol>
<li>تطعيم ثقافة التعبير ال?...

<ol>
	<li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems.">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li><li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins.">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li><li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins.">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li><li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles.">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures.">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li><li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design,+synthesis,+and+testing.">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li><li>Schreiber, A., St&#252;hn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library.">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163 (2019).</li><li>Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity.">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li><li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin.">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li><li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly.">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li><li>Mart&#237;n, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodr&#237;guez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers:The+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium.">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li><li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils.">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. , (2017).</li><li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin.">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li><li>Park, W. M., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Triggered+Self-Assembly+of+Folded+Proteins+into+Vesicles.">Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vesiculo+Synthesis+of+Peptide+Membrane+Precursors+for+Autonomous+Vesicle+Growth.">In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials.">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li><li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions.">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li><li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+domains+and+the+"lipid+raft"+concept.">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li><li>Br&#228;se, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse.">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran&#8211;Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+(BHT).">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran&#8211;Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimalist+Protocell+Design:+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions.">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li><li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems.">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li><li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking.">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li></ol>

خطأ أثناء اتباع البروتوكولات الموصوفة لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المحددة يؤدي بشكل رئيسي إما إلى تشكيل مجاميع غير محددة(الشكل 2، IV) أو إلى AMPhiphiles ELP-amphiphiles الموزعة بشكل متجانس. وترد أدناه مناقشة الخطوات الحاسمة للبروتوكول:
لعائد التعبير العالي من ELP amphiphilic، ?...

تجميع الهياكل فوق الجزيئية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية أصبحت مهمة بشكل متزايد1،2،3،4،5. لتجميع العمارات الوظيفية مثل الكوات، الحويصلات، والألياف مع الخصائص الفيزيائية الكيميائية المطلوبة من المهم فهم والسيطرة على الخصائص الفيزيائية الكيميائية والتوافق للمكونات. بسبب الدقة الجزيئية للجزيئات الموجودة في الطبيعة ، تعتمد كتل البناء للهياكل فوق الجزيئية بشكل متزايد على الدهون أو الأحماض النووية أو البروتينات. بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية، تسمح كتل البناء البروتينية بالتحكم الدقيق في الهياكل فوق الجزيئية الناشئة6 على المستوى الوراثي. يقوم تسلسل الأحماض الأمينية الأولية (aa) لكتل بناء البروتين الفردية بترميز المعلومات لإمكانات تجميعها من الجزيئية حتى المستوى العياني بالإضافة إلى الشكل ثلاثي الأبعاد والخصائص الفيزيائية للهيكل فوق الجزيئي النهائي7.
الطرق المبلغ عنها لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المختلفة غالبا ما تنطوي على البروتينات الأمفيلية مثل البروتينات الحساسة لدرجة الحرارة الإيلاستين (ELP)5,8,9، المؤتلف oleosin10والبروتين الاصطناعي الأمفيلي11. وقد أدت أساليب درجة الحرارة التي أطلقت إلى تجميع micelles4,10,12الالياف13اوراق14والحويصلات9,15,16. تم تطبيق طرق تتضمن المذيبات العضوية لتشكيل الحويصلات الديناميكية القائمة على البروتين8,11,14. حتى الآن ، والبروتوكولات المطبقة لتشكيل الحويصلات غالبا ما تفتقر إلى السيطرة على التجميعات micrometer الحجم16,17أو يكون لها عائد تجميع محدود5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الحويصلات القائمة على ELP المبلغ عنها قد أضعفت إمكانات التغليف12أو استقرار محدود مع مرور الوقت9. معالجة هذه العيوب، والبروتوكولات المقدمة تمكين التجميع الذاتي للميكرومتر والصغرى الفرعية الحجم الهياكل فوق الجزيئية مع خصائص physiochemical متميزة، وإمكانات تغليف جيدة والاستقرار لفترة طويلة. تجمع ELPs الأمفيلية المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية ، تمتد عبر النطاق من الكوات كروية وحزم الألياف الملتوية عالية الطلب إلى الحويصلات unilamellar اعتمادًا على البروتوكول المطبق والظروف البيئية المرتبطة به. تكشف المقصورات الكبيرة المستندة إلى غشاء البروتين البطيني (PMBC) عن جميع الأنماط الظاهرية الرئيسية مثل دمج الأغشية وسلوك فصل المرحلة المشابه للدهون. تقوم شركات PMBCs بتغليف جزيئات الشحن الفلورية المتنوعة كيميائياً والتي يمكن رصدها باستخدام المجهر البسيط للكشف عن الفلورسينس. تعد نطاقات ELP المتكررة المستخدمة في هذه الدراسة لبنات بناء جذابة للبنيات فوق الجزيئية القائمة على البروتين18. ومن المعروف أن وحدة تكرار الببتيدات ELP (VPGVG) تتسامح مع aa مختلفة إلى جانب proline في المركز الرابع (valine, V)، مع الحفاظ على خصائصها الهيكلية والوظيفية19. تم تحقيق تصميم ELPs الأمفيلية التي تحتوي على مجالات مائية ومائية مميزة عن طريق إدراج بقايا ضيف Aa (X) في VPGXG يكرر مع الهيدروكوبية المتميزة والقطبية والشحن20. نطاقات AMPhiphilic ELP حيث مجهزة فينيل ألانين (F) أو isoleucine (I) في حين أن المجال الهيدروفيلي يحتوي على حمض الغلوتاميك المشحون (E) أو أرجينين (R) كمخلفات ضيف. يمكن العثور على قائمة ببنيات ELP الأمفيفيلية المؤهلة وتسلسل aa المقابل لها في المعلومات والمراجع التكميلية8,21. جميع اللبنات حيث مجهزة إما مع الأصباغ الفلورية الصغيرة أو البروتينات الفلورية للتصور عن طريق المجهر الفلوري. mEGFP وغيرها من البروتينات الفلورية كانت ن تنصهر ميؤوس منها إلى المجالات المائية من amphiphiles ELP . وقد تترافق الأصباغ العضوية عبر سلالة خالية من النحاس تعزيز الكين-الأزيد cycloaddition (SPAAC) إلى حمض أميني غير طبيعي تم عرضه مترجماً للمشترك (UAA). المشاركة في الترجمة لـ UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22يسمح تعديل N-المحطة الطرفية للمجال ELP المائية. وبهذه الطريقة صبغ الفلورسنت الأخضر BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) أو أي جزيء الفلورسنت الصغيرة مع سيكلووكتاين المتوترة يمكن استخدامها كمسبار الفلورسنت. يمكن بسهولة تأكيد النجاح في دمج pAzF UAA وcycloaddition من الصبغة عبر SPAAC عن طريق LC-MS / MS بسبب التهيئة الفعالة للببتيدات التربكية المقابلة8. تم تطبيق هذه الصبغة العضوية الصغيرة لتوسيع نطاق اختيار المذيبات لبروتوكولات التجميع ، نظرًا لأن البروتينات الفلورية لا تتوافق مع معظم المذيبات العضوية. يتم وصف بروتوكولي التجميع الأكثر كفاءة للهياكل فوق الجزيئية التي تم تطويرها في مختبرنا أدناه. طريقة تورم THF متوافقة فقط مع الصبغة العضوية المعدلة AMPhiphilic ELP. في المقابل ، فإن طريقة قذف 1-butanol (BuOH) متوافقة مع العديد من البروتينات مثل مسبار الفلورسنت على سبيل المثال mEGFP ، لأن الطريقة الموصوفة تحافظ بشكل كامل على فلورسسينس من هذه البروتينات الاندماجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تغليف الجزيئات الصغيرة وسلوك الانصهار الفيزلي يعمل بشكل أفضل من خلال استخدام طريقة البثق BuOH.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1191px;" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1 &#181;m and 0.2 &#181;m Steril Filter</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1-butanol. &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2log DNA ladder</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">50 mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">79249 Alkyne Mega Stokes dye</td>
			<td style="width:411px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetic acid glacial</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetonitrile, anhydrous, 99.8%</td>
			<td style="width:411px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ampicillin sodium-salt, 99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BDP-FL-PEG4-DBCO</td>
			<td style="width:411px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Biofuge</td>
			<td style="width:411px;">Heraeus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Bottle Top Filter with PES membrane (45 &#181;m, 22 &#181;m)</td>
			<td style="width:411px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Brillant Blue G250 (Coomassie)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BspQI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Camera DS Qi1</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5417r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5810r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CF-400-Cu square mesh copper grid</td>
			<td style="width:411px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CompactStar CS 4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral</td>
			<td style="width:411px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:411px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dnase I</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EarI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Environmental shaker incubator ES-20</td>
			<td style="width:411px;">Biosan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Filter supports</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glass plates</td>
			<td style="width:411px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycerol Proteomics Grade</td>
			<td style="width:411px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycin</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">H4-Azido-Phe-OH</td>
			<td style="width:411px;">Bachhem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Heat plate MR HeiTec</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HindIII</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HisTrap FF crude column</td>
			<td style="width:411px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nickel column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator ix 20</td>
			<td style="width:411px;">INTAS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator LAS-4000</td>
			<td style="width:411px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Imidazole</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Immersions oil for microscopy</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Incubators shakers Unimax 1010</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Inkubator 1000</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">IPTG, &#62;99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Kanamycinsulfate</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">L(+)-Arabinose</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE</td>
			<td style="width:411px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">LB-Medium</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lyophilizer Alpha 2-4 LSC</td>
			<td style="width:411px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lysozyme, 20000 U/mg</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope CM 100</td>
			<td style="width:411px;">Philips</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope Eclipse TS 100</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microwave</td>
			<td style="width:411px;">Studio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Mini-Extruder Set</td>
			<td style="width:411px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">NaCl, &#62;99.5%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Natriumhydroxid pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ni-NTA Agarose, PerfectPro</td>
			<td style="width:411px;">5 Prime</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Nucleopore Track-Etch Membrane</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PH meter 766 calimatic</td>
			<td style="width:411px;">Knick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Polypropylene Columns (1 mL)</td>
			<td style="width:411px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PowerPac basic</td>
			<td style="width:411px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Propanol-2-ol</td>
			<td style="width:411px;">Emplura</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Protein ladder 10-250 kDa</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Recirculating cooler F12</td>
			<td style="width:411px;">Julabo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Reinforcement rings</td>
			<td style="width:411px;">Herma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SacI HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SDS Pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TEMED</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TexasRed Dextran-Conjugate</td>
			<td style="width:411px;">MolecularProbes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Thermomix comfort</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">THF, &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Trypton/Pepton from Casein</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Urea p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Vacuum pump 2.5</td>
			<td style="width:411px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XbaI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XhoI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro

لبنات بناء البروتين مصممة هي المرشحين تنوعا لتجميع الهياكل فوق الجزيئية مثل الخلايا الحد الأدنى، ومركبات تسليم الأدوية وسقالات الإنزيمات. نظرًا لتوافقها البيولوجي وقابليتها للتآلف على المستوى الوراثي ، تعد البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) لبنات بناء مثالية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي. ومع ذلك، فإن تجميع الهياكل فوق الجزيئية القائمة على البروتين مع خصائص physiochemical متميزة وإمكانات تغليف جيدة لا يزال تحديا.
هنا نقدم بروتوكولين فعالين للتجميع الذاتي الموجه من ELPs amphiphilic في بنيات البروتين فوق الجزيئيمثل coacervates الكروية والألياف والحويصل المستقرة. تقوم بروتوكولات التجميع المقدمة بإنشاء مقصورات قائمة على غشاء البروتين (PMBCs) استنادًا إلى ELPs ذات خصائص فيزيائية كيميائية قابلة للتكيف. PMBCs إظهار سلوك فصل المرحلة وتكشف عن طريقة الانصهار الغشاء تعتمد وقادرة على تغليف جزيئات البضائع الفلورية المتنوعة كيميائيا. تتمتع شركات PMBCs الناتجة عن ذلك بإمكانية تطبيق عالية كمنصة لصياغة الأدوية وتسليمها، والخلية الاصطناعية، ومساحة التفاعل المجزأة.

تطوير بروتوكول لإنتاج الحويصلات يوضح الشكل 1 طريقتي إعداد الحويصلات المختلفة. تتكون طريقة تورم THF على الجانب الأيسر من ثلاث خطوات متتالية ونتائج في تجمعات فوق جزيئية مختلفة من ELP اعتمادًا على درجة الحرارة. في الشكل 1A صور المجهر epifl...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

في واجهة المذيبات العضوية والمائية ، تتجمع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية معقدة مثل الحويصلات والألياف والكواسيرفات التي تسببها المعلمات البيئية. تنتج بروتوكولات التجميع الموصوفة مقصورات تعتمد على الأغشية البروتينية (PMBCs) مع خصائص قابلة للسحب ، مما يتيح تغليف البضائع المختلفة.

توجيه تجميع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين إلى هياكل فوق جزيئية محددة وتغليف البضائع في المختبر

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

التجميع الفعال للهياكل فوق الجزيئية لتصميم الخلايا الدنيا وتسليم الأدوية لا يزال يشكل تحديا. هنا، نبرهن على بروتوكولات فعالة تنتج هياكل فوق احشائيّة تعتمد على بروتينات تشبه الإيلاستين. بروتوكولات التجميع المعروضة تولد هياكل فوق احشائية متعددة مع خصائص الفيزياء الكيميائية القابلة للتكيف، مثل الحويصلات والألياف والكوسيرفات.تظهر المقصورات القائمة على غشاء البروتين سلوك فصل المرحلة وتسمح بتغليف جزيئات البضائع الفلورية المتنوعة كيميائيًا. للتعبير عن F20E20-mEGFP و F20E20-mCherry، تلقيح ثقافة التعبير الرئيسي من بين عشية وضحاها ما قبل الثقافة إلى OD600 من 0.3. احتضانه في 400 ملليلتر من متوسطة LB العقيمة تكملها المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.عندما تصل ثقافة التعبير إلى OD600 من 0.5 إلى 0.8، أضف IPTG إلى تركيز نهائي من ميليمولار واحد، وخفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية. للتعبير عن ELP amphiphilic مع الأحماض الأمينية غير طبيعي، تلقيح ثقافة التعبير الرئيسي من بين عشية وضحاها E.coli قبل الثقافة التي تحتوي على البلازميدات المناسبة إلى OD من 0.3. احتضانه في 400 ملليلتر من متوسطة LB العقيمة تكملها كاناميسين وكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.لتحضير مخزون الأحماض الأمينية غير الطبيعي 100 مللي ميللي، أضف 206.2 ملليغرام من الأحماض الأمينية غير الطبيعية إلى ثمانية ملليلترات من الماء فائق البور. رفع درجة الH من الحل مع هيدروكسيد الصوديوم ثلاثة المولر، ومزيج بقوة. عندما يتم حل الأحماض الأمينية غير الطبيعية، وخفض درجة الحموضة إلى ما يقرب من 10.5، وإضافة الماء فائقة السخاء إلى حجم 10 ملليلتر.تصفية الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر معقمة، و aliquot ذلك في أنابيب التفاعل مليلتر اثنين. عندما تصل ثقافة التعبير إلى OD600 من 0.5 إلى 0.8، أضف الأحماض الأمينية غير الطبيعية إلى تركيز نهائي من ميليمولار اثنين. احتضانه لمدة 10 دقائق أخرى.ثم حث التعبير عن البروتين الهدف وsRNA synthetase اللازمة عن طريق إضافة في وقت واحد من IPTG وعربينوز. خفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية، والسماح للتعبير عن الاستمرار لمدة 20 ساعة تقريبا. بعد الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية و 4، 000 مرات ز لمدة 40 دقيقة.Resuspend بيليه الخلية في عازلة التحلل مع lysozyme وPMSF. احتضان الحل لمدة 30 دقيقة على الجليد. ثم تجميد وذوبانه مرتين عن طريق غمر في النيتروجين السائل.سونيكات التعليق، ومسح lysate بواسطة الطرد المركزي في 10، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 40 دقيقة. ثم تنقية البروتين باستخدام اللوني تقارب. بعد التهيّن البروتيني، قم بتخزينه عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامه أكثر.إضافة ميكرولتر واحد من صبغة الفلورسنت إلى 500 ميكرولترات من حل ELP، واحتضان رد فعل لحوالي 10 ساعات في 15 درجة مئوية في حين تهتز في ThermoMixer، مع التأكد من لحمايته من الضوء. لإزالة صبغة الفلورسنت المفرطة، قم بتكبيل غشاء غسيل الكلى في الماء فائق الخطورة لمدة 10 دقائق. قطع الغشاء إلى الحجم الصحيح ليتم وضعها على رأس فتح أنبوب رد الفعل مع الحل ELP النقر.ثم إصلاح الغشاء إلى الفتح عن طريق إغلاق الأنبوب مع غطاء لا يحتوي على جوهر. املأ المسافة بين الغطاء والغشاء بالمخزن لمنع محاصرة الهواء. ثم ضع أنبوب التفاعل في المخزن المؤقت المختار ، ادفعه تحت السطح ، وقم بتحويله رأسًا على عقب.إجراء غسيل الكلى لمدة ثلاث ساعات على الأقل في أربع درجات مئوية، مما يسمح لغسيل الكلى بالاستمرار لمدة ثلاث ساعات أخرى على الأقل بعد كل تغيير عازل. بالنسبة لتورم THF ، اطلب محلول ELP المتجانس ضد الفوسفات أو المخزن المؤقت تريس مع 7.5 pH ثابت. إعداد lyophilizer، وتبريده إلى درجة حرارة البدء لتجميد التجفيف.Aliquot حل البروتين dialyzed في أنابيب التفاعل 1.5 ملليلتر، وختم مع قبعات مع ثقب صغير لتجنب فقدان العينة الصلبة بسبب التغيرات في الضغط في سياق تجميد التجفيف. تجمد العينات في النيتروجين السائل. أخذ عينات البروتين المجمدة من النيتروجين السائل، ووضعها على الفور في مزيل الجفاف لبدء تجميد التجفيف.بعد العينة جافة تماما، تهوية مع النيتروجين الجاف، وعلى الفور إغلاق أغطية أنبوب التفاعل لتجنب ملامسة رطوبة الهواء. إضافة نقية THF لعينات lyophilized، ووضع الحل في 2000 2000 100 100 100 1000 1000 100000000000000000000000000000000000000000000000000000 سخني دراجات الحرارة إلى 30 إلى 60 درجة مئوية لتشكيل الفُيَس أو ما يصل إلى 90 درجة مئوية لتشكيل الألياف، ثم أعد أنابيب رد فعل جديدة إما بماء فائق السخاء أو عازلة.بعد سونيكيشن، ضع حل ELP/THF والمياه المعدة أو العازلة في ثيرموستر لمدة خمس دقائق. ثم تقسيم حل ELP على أعلى الماء أو العازلة، والتأكد من أن فصل المرحلتين و interphase متميزة مرئية، ووضع الخليط مرة أخرى في الترموستر. اسمحوا العينة تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، والمضي قدما مع غسيل الكلى ضد الماء أو العازلة أو مع المجهر الفلوريسنس.إعداد واحد إلى 50 ميكرومولار ELP الحل، وإضافة 10 إلى 20٪ 1-بوتانول. على الفور مزيج الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. وينبغي زيادة تعكر الحل أثناء الاختلاط، مما يدل على تشكيل الفينة.لتحقيق توزيع حجم ضيق، بثق المحاصل مع الطارد مصغرة من خلال غشاء مع حجم المسام من ميكرومتر واحد. لتغليف الصبغة، مزيج ما يقرب من 40 ميكرولترات من حل ELP في 10 ملليمولار تريس-HCl مع ميكرولتر واحد من ديكستران تكساس ريد الأسهم الحل في DMSO. إضافة 10 ميكرولترات من 1-بوتانول، وبثق خمس إلى 10 مرات من خلال حقنة مجهزة بإبرة 0.25 في 25 ملليمتر.وتتألف طريقة تورم THF من ثلاث خطوات متتالية والنتائج في تجميعات مختلفة فوق الجزيئات من ELP اعتمادا على درجة الحرارة. تظهر صور المجهر epifluorescence الفُيْسَرة العُيْدَسَة التي تم تجميعها من BDP-R20F20 وهياكل الرجفان التي تم تجميعها من BDP-R40F20. طريقة 1-بوتانول البثق يؤدي حصرا إلى تشكيل حويصلات ELP.يتم إنتاج حوالي اثنين من أوامر حجم أكثر من vesicles مقارنة مع طريقة تورم THF. تم خلط BDP-R40F20 مع 10 إلى 15٪ البوتانول، وتم إعداد الفهيلات عن طريق بثق الخليط. تم تجميع هياكل مختلفة فوق الجزيئات من BDP-R40F20 عبر بروتوكول تورم THF.تم تعديل درجة الـ PH للمخزن المؤقت ودرجة حرارة عملية التجميع لتشكيل إما coacervates أو fibrils أو الحويصلات. أخطاء صغيرة في بروتوكول التجميع يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجاميع. تم تغليف صبغة مشحونة بشكل إيجابي ATTO Rho 13 والديكستران الأحمر 3000 السكاريد في تجويف الحويصلات التي تم تجميعها من F20R20-mEGFP عبر طريقة بثق 1-بوتانول.صور المجهر كونوكال تظهر الفينة في القناة الخضراء، والبضائع في القناة الحمراء، والتغليف الناجح في القناة المدمجة الناتجة. كما تم إثبات فصل المرحلة وسلوك الاندماج من أمفيفيليات ELP عند خلط كتل بناء PMBC واحدة مقابل مجموعات السكان PMBC المجمعة. يؤدي الخلط قبل تجميع PMBC إلى جزيئات موزعة بشكل متجانس داخل غشاء PMBC المجمع ، في حين يؤدي خلط مجموعات الحسوس المجمعة إلى بقع غشاء من الفلورس الأحمر أو الأخضر التي تكون مرئية لمدة 20 دقيقة على الأقل.عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تولي اهتماما لأمر الخطوة الصحيحة وللفروق بين طريقة THF تورم وطريقة البثق بوتانول. بعد هذا البروتوكول، يمكن استخدام vesicles ELP كمكوكات تسليم المخدرات، كمنصة لردود الفعل الأنزيمية، مثل النسخ في المختبر والترجمة، أو في تشكيل خلايا الحد الأدنى الاصطناعية.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

اوريغامي الملهمة التجميع الذاتي للجزيئات منقوشة واعادة التشكيل

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

تشكيل الهياكل الجزيئية البيولوجية أمرت قبل التجميع الذاتي من الببتيدات قصير

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

في الموقع سيمز والأشعة تحت الحمراء الطيفي من السطوح محددة جيدا من إعداد لينة الهبوط من الأيونات اختيارها قداس-

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Atomically Defined Templates for Epitaxial Growth of Complex Oxide Thin Films

قوالب المعرفة بالذرة لالفوقي النمو من أكسيد مجمع الأغشية الرقيقة

Atomically defined substrate surfaces are prerequisite for the epitaxial growth of complex oxide thin films. In this protocol, two approaches to obtain ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

البناء ونظامية الدراسات متماثل من سلسلة من Supramolecular مجموعات مع ثنائي أو ترناري Triphenylacetates الأمونيوم

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

التغليف السرطان العلاجية وكيل داكاربازين طريق ذات البنية النانومترية الدهون الناقل

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

توليف وتوصيف المواد الغروية Supramolecular

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

مستقرة للغاية، وظيفية مشعر النانوية والبوليمرات الحيوية من ألياف الخشب: نحو تقنية النانو المستدام

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

من جزيئات المواد: هندسة البلورات السائلة الأيونية الجديدة من خلال الربط هالوجين

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...