Name: directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

המחברים מודים ל-BMBF לתמיכה פיננסית ולמרכז לניתוח מערכות ביולוגיות (מרכז המחקר) למתן מתקן מחקרי. אנו אסירי תודה לפ. ג. שולץ, TSRI, לה הויה, קליפורניה, ארה ב לאספקת הפלפמיד pEVOL-פזף. אנו מודים לצוות של מרכז הדמיה לייף (LIC) במרכז לניתוח מערכות ביולוגיות (Ludwigs SA) של ה אלברט-, אוניברסיטת פרייבורג לעזרה עם משאבי המיקרוסקופיה שלהם, ותמיכה מצוינת בהקלטת תמונה.

1. עיצוב ושיבוט של לאלסטין שונים, כמו חלבונים (ELPs)
<ol><li>לשכפל ולעצב את המבנים כמתואר במקום אחר8,20. המלון מציע שירותי פלמידים על פי בקשה.</li>
</ol>2. ביטוי חלבון, טיהור והכנה
<ol><li>ביטוי של F20E20-מגלית וF20E20-מדובדבן<ol>
<li>החזר תרבות הביטוי העיקרי מן הלילה טר?...

<ol>
	<li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems.">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li><li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins.">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li><li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins.">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li><li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles.">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures.">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li><li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design,+synthesis,+and+testing.">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li><li>Schreiber, A., St&#252;hn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library.">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163 (2019).</li><li>Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity.">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li><li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin.">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li><li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly.">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li><li>Mart&#237;n, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodr&#237;guez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers:The+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium.">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li><li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils.">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. , (2017).</li><li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin.">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li><li>Park, W. M., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Triggered+Self-Assembly+of+Folded+Proteins+into+Vesicles.">Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vesiculo+Synthesis+of+Peptide+Membrane+Precursors+for+Autonomous+Vesicle+Growth.">In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials.">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li><li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions.">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li><li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+domains+and+the+"lipid+raft"+concept.">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li><li>Br&#228;se, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse.">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran&#8211;Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+(BHT).">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran&#8211;Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimalist+Protocell+Design:+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions.">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li><li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems.">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li><li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking.">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li></ol>

תקלה בזמן השימוש בפרוטוקולים המתוארים להרכבת מבנים מולקולריים מוגדרים, מובילה בעיקר להיווצרות אגרגטים לא ספציפיים (איור 2, IV) או להפצת הומוגנרים. שלבים קריטיים של הפרוטוקול נדונים להלן:
בעבור התשואה הגבוהה של המידע האמפיבי, טמפרטורה נמוכה יחסית של 20 ° c היא א...

הרכבת של מבנים supraמולקולריים ליישומים ביוטכנולוגיים הופכת להיות חשובה יותר ויותר1,2,3,4,5. עבור ההרכבה של ארכיטקטורות פונקציונלי כגון מאכאוטים, ושלפוחיות, וסיבים עם תכונות פיסיוכימיקלים הרצוי חשוב להבין ולשלוט על המאפיינים הפיזיקליים והקונפורמציה של הרכיבים. בשל הדיוק המולקולרי של מולקולות שנמצאו בטבע, אבני בניין עבור מבנים supraמולקולריים מבוססים יותר ויותר על שומנים, חומצות גרעין או חלבונים. לעומת פולימרים סינתטיים, אבני הבניין פרוטטינואאוס לאפשר שליטה מדויקת על מבנה סופרא מולקולרית מתהווה6 ברמה הגנטית. החומצה האמינית העיקרית (aa) הרצף של אבני בניין חלבון בודדים מקודד את המידע עבור פוטנציאל ההרכבה שלהם מן המולקולרי עד רמת מאקרוסקופי, כמו גם את הצורה תלת מימדי ותכונות פיזיות של מבנה סופרא מולקולרית הסופי7.
שיטות מדווחות להרכבת מבנים מולקולריים שונים מעורבות לעתים קרובות בחלבונים מסוג שונות, כגון אלסטין עם חלבונים רגישים בטמפרטורה.מיכל 5,8,9, רקומביננטי oleosin10ומטבעוניים של חלבון מלאכותי11. הטמפרטורות שגרמו לשיטות הובילו להרכבת מיקרולים4,10,12, סיבים13, סדינים14ושלפוחיות9,15,16. שיטות הכוללות ממיסים אורגניים הוחלו על היווצרות חלבון דינאמי מבוסס שלפוחיות8,11,14. עד כה, פרוטוקולים שהוחלו עבור היווצרות שלפוחית לעיתים קרובות חסרים בקרת הרכבה על הרכבות בגודל מיקרומטר16,17או שיהיה ברשותך תפוקת הרכבה מוגבלתמיכל 5. בנוסף, יש המדווחים על מספר שלפוחיות של המבוסס על היכולת לפגום בפוטנציאל12או יציבות מוגבלת לאורך זמן9. הטיפול בחסרונות אלה, הפרוטוקולים המוצגים מאפשרים הרכבה עצמית של מבני מיקרומטר ומיקרומטר מולקולרי בגודל תת-מיקרומטר עם תכונות פיזיוכימיות ברורים, פוטנציאל מעטיפת טוב ויציבות זמן רב. מותאם במיוחד להרכיב מבנים מולקולריים, המשתרעים על-ידי מגוון כדורי וחבילות סיבים מעוותים לunilamellar שלפוחיות בהתאם לפרוטוקול המוחל ולתנאי הסביבה הקשורים. חלבון וממברנה גדול מבוססי קרום התאים (PMBC) לחשוף את כל פנוטיפים הראשי כגון פיוז'ן ממברנה התנהגות הפרדת פאזה אנלוגית ליפוזומים. PMBCs מכמס ביעילות מולקולות מטענים פלורסנט מגוונת אשר ניתן לפקח באמצעות מיקרוסקופ epiפלואורסצנטי פשוט. הדומיינים החוזרים ונשנים בשימוש במחקר זה הם אבני בניין אטרקטיבי עבור ארכיטקטורות מבוססות חלבון סופרא מולקולרית18. יחידת החזרה הפנטדית של סיוע (vpgvg) ידועה לסבול aa שונה מלבד פרולין בעמדה הרביעית (valine, V), תוך שמירה על מאפיינים מבניים ופונקציונלי19. העיצוב של ELPs אמפיפילי המכיל תחומים הידרופיפילית והידרופובי ייחודיים התממשו על ידי החדרת שאריות האורחים aa (X) ב VPGXG חזרה עם הידרופוטטי ברורים, קוטביות, טעינה20. בתחומים שונים של הידרופובי (F) או איזולאוצין (I) בעוד התחום ההידרופילי הכיל גלוטמית חומצה (E) או ארגינין (R) כפסולת אורחים. ניתן למצוא רשימה של בנייה מתאימה של מבנים למען הילד ורצפי ה-aa במידע המשלים והפניות8,21. כל אבני הבניין שבו מצוידים או עם צבעי פלורסנט קטנים או חלבונים פלורסנט עבור ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ ניאון. מגה-בוקס וחלבונים פלורסנט אחרים היו N-סופני התמזגו לתחומים הידרופילי של האמפיפינרס. הצבעים האורגניים היו מצוענים באמצעות מאמץ לקדם את הנחושת, לאחר שהוא הציג את חומצת האמינו הטבעית (UAA). התאגדות השיתוף המשותף של ה-UAApara-azidophenאלצין22מתיר את השינוי של מסוף N. של התחום ההידרופילי בדרך זו צבע פלורסנט ירוק BDP-FL-יתד4-DBCO (BDP) או כל מולקולה פלורסנט קטנה עם cyclooctyne מתוח יכול לשמש לווין פלורסנט. התאגדות מוצלחת של ה-UAA פזגז ו ציקלותוספת של הצבע באמצעות ספאץ ניתן לאשר בקלות באמצעות LC-MS/MS בשל אינון יעיל של פפטידים טריפטיים המקביל8. צבע אורגני קטן זה הוחל כדי להרחיב את בחירת הממס עבור פרוטוקולי ההרכבה, מאז חלבונים פלורסנט אינם תואמים את רוב המיסים האורגניים. שני פרוטוקולי ההרכבה היעילים ביותר עבור מבנים מולקולריים שפותחו במעבדה שלנו מתוארים להלן. שיטת הנפיחות THF תואם רק עם צבע אורגני שונה למען הטוב ביותר. לעומת זאת, 1-butanol (BuOH) שיטת ההבלטה תואמת חלבונים רבים כמו בדיקה פלורסנט לדוגמה mEGFP, מאז השיטה המתוארת משמר באופן מלא את הזריחה של אלה חלבונים היתוך. בנוסף, כימוס של מולקולות קטנות התנהגות היתוך vesicular עובד הטוב ביותר על ידי שימוש בשיטת BuOH שחול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1191px;" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1 &#181;m and 0.2 &#181;m Steril Filter</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1-butanol. &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2log DNA ladder</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">50 mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">79249 Alkyne Mega Stokes dye</td>
			<td style="width:411px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetic acid glacial</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetonitrile, anhydrous, 99.8%</td>
			<td style="width:411px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ampicillin sodium-salt, 99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BDP-FL-PEG4-DBCO</td>
			<td style="width:411px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Biofuge</td>
			<td style="width:411px;">Heraeus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Bottle Top Filter with PES membrane (45 &#181;m, 22 &#181;m)</td>
			<td style="width:411px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Brillant Blue G250 (Coomassie)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BspQI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Camera DS Qi1</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5417r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5810r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CF-400-Cu square mesh copper grid</td>
			<td style="width:411px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CompactStar CS 4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral</td>
			<td style="width:411px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:411px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dnase I</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EarI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Environmental shaker incubator ES-20</td>
			<td style="width:411px;">Biosan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Filter supports</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glass plates</td>
			<td style="width:411px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycerol Proteomics Grade</td>
			<td style="width:411px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycin</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">H4-Azido-Phe-OH</td>
			<td style="width:411px;">Bachhem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Heat plate MR HeiTec</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HindIII</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HisTrap FF crude column</td>
			<td style="width:411px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nickel column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator ix 20</td>
			<td style="width:411px;">INTAS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator LAS-4000</td>
			<td style="width:411px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Imidazole</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Immersions oil for microscopy</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Incubators shakers Unimax 1010</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Inkubator 1000</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">IPTG, &#62;99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Kanamycinsulfate</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">L(+)-Arabinose</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE</td>
			<td style="width:411px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">LB-Medium</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lyophilizer Alpha 2-4 LSC</td>
			<td style="width:411px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lysozyme, 20000 U/mg</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope CM 100</td>
			<td style="width:411px;">Philips</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope Eclipse TS 100</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microwave</td>
			<td style="width:411px;">Studio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Mini-Extruder Set</td>
			<td style="width:411px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">NaCl, &#62;99.5%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Natriumhydroxid pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ni-NTA Agarose, PerfectPro</td>
			<td style="width:411px;">5 Prime</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Nucleopore Track-Etch Membrane</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PH meter 766 calimatic</td>
			<td style="width:411px;">Knick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Polypropylene Columns (1 mL)</td>
			<td style="width:411px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PowerPac basic</td>
			<td style="width:411px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Propanol-2-ol</td>
			<td style="width:411px;">Emplura</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Protein ladder 10-250 kDa</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Recirculating cooler F12</td>
			<td style="width:411px;">Julabo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Reinforcement rings</td>
			<td style="width:411px;">Herma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SacI HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SDS Pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TEMED</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TexasRed Dextran-Conjugate</td>
			<td style="width:411px;">MolecularProbes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Thermomix comfort</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">THF, &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Trypton/Pepton from Casein</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Urea p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Vacuum pump 2.5</td>
			<td style="width:411px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XbaI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XhoI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro

אבני בניין מותאמות פרוטטינואאוס הם מועמדים מגוונים עבור הרכבה של מבנים supraמולקולריים כגון תאים מינימליים, כלי רכב של משלוחי סמים והאנזים פיגומים. עקב תאימות תאימות שלהם על הרמה הגנטית, החלבונים כמו אלסטין (למשל) הם אבני בניין אידיאלי עבור יישומים ביו טכנולוגיים ביו-רפואיים. אף על פי כן, ההרכבה של מבנים supraמולקולריים מבוססי חלבון עם תכונות פיזיוכימיות ברורים ופוטנציאל מעטפת טוב נשאר מאתגר.
כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים יעילים עבור הרכבה עצמית מודרך של elps אמפיפילי לתוך ארכיטקטורות חלבון סופרא מולקולרית כגון כדורי כדורית, סיבים ושלפוחיות יציבה. פרוטוקולי ההרכבה שהוצגו ליצור תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) מבוסס על ELPs עם תכונות הסתגלות פיסיוכימיקלים. PMBCs להפגין התנהגות הפרדת הפאזה וחשיפת שיטת היתוך ממברנה תלוי ומסוגלים לכמסים מגוון כימית מולקולות מטענים פלורסנט. PMBCs וכתוצאה מכך יש פוטנציאל יישום גבוה כמו ניסוח התרופה ופלטפורמת המסירה, תא מלאכותי, וחלל התגובה מידור.

פיתוח פרוטוקולים לייצור ושלפוחית איור 1 מתווה את שתי שיטות ההכנה השונות של שלפוחית הדעת. שיטת הנפיחות THF בצד שמאל מורכב משלושה שלבים רצופים ותוצאות הרכבות supraמולקולריים שונים של הטוב ביותר בהתאם לטמפרטורה. באיור 1A תמונות מיקרוסקו...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

ההרכבה היעילה של מבנים supramolecular עבור עיצוב תאים מינימלי משלוח סמים נשאר מאתגר. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים יעילים המניבים מבנים על-תאיים המבוססים על חלבונים אמפיפיליים דמויי אלסטין. פרוטוקולי ההרכבה המוצגים יוצרים מבנים על-תאיים רב-תכליתיים בעלי תכונות פיזיוכימיות הניתנות להתאמה, כגון וקסיקלים, סיבים וקוארבטים.תאים מבוססי קרום חלבון מדגימים התנהגות של הפרדת פאזה ומאפשרים אנקפסולציה של מולקולות מטען פלואורסצנטיות מגוונות מבחינה כימית. לביטוי של F20E20-mEGFP ו- F20E20-mCherry, חסן את תרבות הביטוי העיקרית מקדם התרבות בן הלילה ל- OD600 של 0.3. דגירה זה 400 מיליליטר של בינוני LB סטרילי בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד.כאשר תרבות הביטוי מגיעה ל- OD600 של 0.5 עד 0.8, הוסף IPTG לריכוז סופי של מילימולר אחד, והקטן את טמפרטורת הדגירה ל - 20 מעלות צלזיוס. לביטוי של ELP אמפיפילי עם חומצת אמינו לא טבעית, לחסן את תרבות הביטוי העיקרית מן הלילה E.coli טרום תרבות המכילה את הפלסמידים המתאימים OD של 0.3. דגירה זה 400 מיליליטר של בינוני LB סטרילי בתוספת קאנאמיצין וכלוראמפניקול ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד.כדי להכין את מלאי חומצות האמינו הלא טבעיות 100 מילימולרית, להוסיף 206.2 מיליגרם של חומצת אמינו לא טבעית לשמונה מיליליטר של מים אולטרה-פלור. העלה את רמת ה- pH של הפתרון עם נתרן הידרוקסיד תלת-גוחן, ומערבבים במרץ. כאשר חומצת האמינו הלא טבעית מומסת, מנמיכים את ה- pH לכ- 10.5 ומוסיפים מים אולטרה-חמים לנפח של 10 מיליליטר.סנן את הפתרון באמצעות מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר, ולחץ עליו בצינורות תגובה של שני מיליליטר. כאשר תרבות הביטוי מגיעה OD600 של 0.5 כדי 0.8, להוסיף את חומצת האמינו הלא טבעית לריכוז הסופי של שני מילימולרים. דגירה זה במשך 10 דקות נוספות.לאחר מכן לגרום לביטוי של חלבון היעד ואת הסינתטאז tRNA הדרוש באמצעות תוספת בו זמנית של IPTG ו arabinose. להפחית את טמפרטורת הדגירה ל 20 מעלות צלזיוס, ולאפשר ביטוי להמשיך במשך כ 20 שעות. לאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו 4, 000 פעמים גרם במשך 40 דקות.תן שימוש חוזר לכדור התא במאגר תיזה עם lysozyme ו- PMSF. דגירה הפתרון במשך 30 דקות על קרח. ואז להקפיא ולהפשיר אותו פעמיים על ידי טביעה בחנקן נוזלי.Sonicate ההשעיה, ולנקה את lysate על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. לאחר מכן לטהר את החלבון באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. לאחר אלוטיון החלבון, יש לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.הוסיפו מיקרוליטר אחד של צבע פלואורסצנטי ל-500 מיקרוליטרים של תמיסת ELP, ודאגו להגן עליו מפני אור במשך כ-10 שעות ב-15 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול בתרמומיקסר, תוך הקפדה להגן עליו מפני אור. כדי להסיר צבע פלואורסצנטי מוגזם, יש לצייד קרום דיאליזה במים אולטרה-חמים למשך 10 דקות. חותכים את הממברנה לגודל הנכון כדי להיות ממוקם על גבי הפתיחה של צינור התגובה עם פתרון ELP לחץ.ואז לתקן את הממברנה לפתיחה על ידי סגירת הצינור עם מכסה שאין לו ליבה. מלאו את החלל בין המכסה לממברנה במאגר כדי למנוע השמנה של אוויר. לאחר מכן מניחים את צינור התגובה במאגר הנבחר, דוחפים אותו מתחת לפני השטח, ולהפוך אותו במהופך.בצע דיאליזה במשך שלוש שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס, מה שמאפשר לדיאליזה להימשך לפחות שלוש שעות נוספות לאחר כל שינוי חיץ. עבור נפיחות THF, דיאליזה פתרון ELP הומוגני נגד חיץ פוספט או טריס עם pH יציב 7.5. מכינים את lyophilizer, ומצננים אותו לטמפרטורה ההתחלה לייבוש הקפאה.עליות פתרון חלבון דיאליזה בצינורות תגובה 1.5 מיליליטר, ולאטום עם כובעים עם חור קטן, כדי למנוע לאבד את המדגם מוצק עקב שינויים בלחץ במהלך הקפאה ייבוש. להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי. מוציאים את דגימות החלבון הקפואות מהחנקן הנוזלי, ומיד מניחים אותן בליופילייזר כדי להתחיל לייבוש הקפאה.לאחר שהדגימה יבשה לחלוטין, יש לאוורר אותה בחנקן יבש, ולסגור מיד את מכסי צינור התגובה כדי להימנע ממגע עם לחות האוויר. מוסיפים THF טהור לדגימות ליופילית, ומ מניחים את הפתרון בסוניקטור אמבט מים עם מי קרח במשך 15 דקות. מחממים תרמוצ'ילר ל-30 עד 60 מעלות צלזיוס להיווצרות ווסקל או עד 90 מעלות צלזיוס להיווצרות סיבים, ומכינים צינורות תגובה חדשים עם מים אולטרה-חמים או חוצץ.לאחר sonication, מניחים את פתרון ELP / THF ואת המים המוכנים או חיץ בתרמוציקלר במשך חמש דקות. לאחר מכן מרפדים את תטביט ELP על גבי המים או המאגר, מוודאים כי ההפרדה בין שני השלבים והאינטרפאזה המובהק נראית לעין, וממקמים את התערובת בחזרה בתרמוציקלר. תן את המדגם להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולהמשיך עם דיאליזה נגד מים או חיץ או עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטי.הכן פתרון ELP של 1 עד 50 מיקרומולרים והוסף 10 עד 20%1-butanol. מיד לערבב את הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה. מערבולת של הפתרון צריך להגדיל במהלך ערבוב, המציין היווצרות גדילה.כדי להשיג התפלגות גודל צר, להחדיר שלפוחיות עם extruder מיני דרך קרום עם גודל נקבובית של מיקרומטר אחד. עבור אנקפסולציה צבע, לערבב כ 40 microliters של פתרון ELP ב 10-מילימולר טריס-HCl עם מיקרוליטר אחד של פתרון מניות Dextran טקסס אדום ב- DMSO. הוסף 10 microliters של 1-butanol, ולהבליט חמש עד 10 פעמים דרך מזרק מצויד מחט 0.25 על ידי 25 מילימטר.שיטת הנפיחות THF מורכבת משלושה שלבים רצופים ותוצאות הרכבות supramolecular שונים של ELP בהתאם לטמפרטורה. תמונות מיקרוסקופיה epifluorescence להראות וקסיקים שנאספו מ BDP-R20F20 ומבנים fibrillary שנאספו מ BDP-R40F20. שיטת ההבלטה 1-butanol מוביל אך ורק להיווצרות של וריונים ELP.על שני סדרי גודל יותר נוי מיוצרים בהשוואה לשיטת הנפיחות THF. BDP-R40F20 היה מעורבב עם 10 עד 15% butanol, ו vesicles הוכנו באמצעות שבלט של התערובת. מבנים שונים supramolecular הורכבו מ BDP-R40F20 באמצעות פרוטוקול נפיחות THF.ה- pH של המאגר והטמפרטורה של תהליך ההרכבה הותאמו לצורת coacervates, fibrils או גרים. טעויות קטנות בפרוטוקול ההרכבה יכולות להוביל להיווצרות אגרגטים. צבע טעון חיובית ATTO Rho 13 ו פוליסכריד דקסטרן אדום 3000 היו עכוסים לתוך לומן של ורידים שנאספו מ F20R20-mEGFP באמצעות שיטת שולט 1-butanol.תמונות מיקרוסקופיות קונפוקלים מראות את הווסיקים בתעלה הירוקה, את המטען בתעלה האדומה ואת הערוץ הממוזג המוצלח בערוץ הממוזג שנוצר. ההפרדה פאזה והתנהגות היתוך של אמפיפילים ELP על ערבוב של אבני בניין PMBC יחיד לעומת אוכלוסיות PMBC התאספו הוכח גם. ערבוב לפני הרכבת PMBC מוביל למולקולות מבוזרות הומוגנית בתוך קרום PMBC שנאסף, בעוד ערבוב אוכלוסיות ורירית מורכבות מוביל כתמי קרום של פלואורסצנטיות אדומה או ירוקה גלויים לפחות 20 דקות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשים לב לסדר הצעד הנכון ועל ההבדלים בין שיטת הנפיחות THF לבין שיטת שולט butanol. בעקבות פרוטוקול זה, גדילי ELP יכולים לשמש הסעות משלוח סמים, כפלטפורמה לתגובות אנזימטיות, כגון תמלול ותרגום במבחנה, או בהיווצרות של תאים מינימליים סינתטיים.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

אוריגמי השראה עצמית הרכבה של חלקיקים בדוגמת וReconfigurable

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

היווצרות של מבני Biomolecular הוזמנו על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים קצרים

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

בSIMS אתרו וIR ספקטרוסקופיה של משטחים מוגדרים היטב הוכן על ידי רכה נחיתה של יונים המוניים שנבחרו

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Atomically Defined Templates for Epitaxial Growth of Complex Oxide Thin Films

תבניות מוגדרות אטומי לEpitaxial צמיחה של תחמוצת המורכבת Thin Films

Atomically defined substrate surfaces are prerequisite for the epitaxial growth of complex oxide thin films. In this protocol, two approaches to obtain ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

בינוי שיטתי סימטריים מחקרים של סדרה של אשכולות מולקולריים עם Triphenylacetates בינארי או המשולש אמוניום

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

Encapsulation של Dacarbazine הסוכן הטיפולי הסרטן בעזרת Carrier ליפידים Nanostructured

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

מאוד יציבים, חלקיקים שעירים פונקציונליים Biopolymers סיבי עץ: לקראת ננוטכנולוגיה קיימא

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

ממולקולות חומרים: הנדסה בגבישים נוזליים יוניים חדש דרך הלוגן מליטה

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...