Name: directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

Författarna tackar BMBF för ekonomiskt stöd och Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) för att tillhandahålla forskningsanläggningen. Vi är tacksamma mot P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornien, USA för att tillhandahålla plasmid pEVOL-pAzF. Vi tackar personalen vid Life Imaging Center (LIC) i Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) av Albert-Ludwigs-University Freiburg för hjälp med sina confocal mikroskopi resurser, och utmärkt stöd i bildinspelning.

1. Utformning och kloning av amphifila elastinliknande proteiner
<ol><li>Klona och designa konstruktionerna enligt beskrivningen någon annanstans8,20. Plasmider finns tillgängliga på begäran.</li>
</ol>2. Proteinuttryck, rening och beredning
<ol><li>Uttryck för F20E20-mEGFP och F20E20-mCherry<ol>
<li>Inokulera huvuduttryckskulturen från över en natt före kultur till en OD600 av 0,3. Inkubera vid 37 °C, 200 rpm i ste...

<ol>
	<li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems.">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li><li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins.">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li><li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins.">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li><li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles.">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures.">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li><li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design,+synthesis,+and+testing.">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li><li>Schreiber, A., St&#252;hn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library.">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163 (2019).</li><li>Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity.">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li><li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin.">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li><li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly.">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li><li>Mart&#237;n, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodr&#237;guez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers:The+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium.">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li><li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils.">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. , (2017).</li><li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin.">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li><li>Park, W. M., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Triggered+Self-Assembly+of+Folded+Proteins+into+Vesicles.">Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vesiculo+Synthesis+of+Peptide+Membrane+Precursors+for+Autonomous+Vesicle+Growth.">In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials.">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li><li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions.">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li><li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+domains+and+the+"lipid+raft"+concept.">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li><li>Br&#228;se, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse.">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran&#8211;Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+(BHT).">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran&#8211;Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li><li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimalist+Protocell+Design:+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions.">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li><li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems.">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li><li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking.">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li></ol>

Ett fel efter de beskrivna protokollen för montering av definierade supramolekylära strukturer leder huvudsakligen antingen till bildandet av ospecifika aggregat (figur 2,IV) eller till homogent distribuerade ELP-amphifiler. Kritiska steg i protokollet diskuteras nedan:
För hög uttrycksutbyte av amfifil ELP är en relativt låg temperatur på 20°C optimal. För framgångsrik affinitet baserad rening av amfifil ELP en urea koncentration av 4 M i lysis bufferte...

Monteringen av supramolekylära strukturer för biotekniska tillämpningar blir allt viktigare1,,2,,3,,4,,5. För montering av funktionella arkitekturer som coacervates, blåsor och fibrer med önskade fysikaliska kemiska egenskaper är det viktigt att förstå och kontrollera komponenternas fysikaliska och konformationsegenskaper. På grund av den molekylära precisionen hos molekyler som finns i naturen, byggstenar för supramolekylära strukturer alltmer baserade på lipider, nukleinsyror eller proteiner. Jämfört med syntetiska polymerer möjliggör proteinhaltiga byggstenar exakt kontroll över framväxande supramolekylära strukturer6 på genetisk nivå. Den primära aminosyran (aa) sekvensen av de enskilda proteinbyggstenarna kodar i sig informationen för deras monteringspotential från den molekylära upp till makroskopisk nivå samt den tredimensionella formen och de fysiska egenskaperna hos den supramolekylära strukturen7.
Rapporterade metoder för montering av olika supramolekylära strukturer involverar ofta amfifila proteiner såsom temperaturkänsliga elastinliknande proteiner (ELP)5,8,9, rekombinant oleosin10och artificiella proteinamfifiler11. Temperaturutlösta metoder har lett till montering av micelles4,10,12Fibrer13Ark14och blåsor9,15,16. Metoder som involverar organiska lösningsmedel har använts för bildning av dynamiska proteinbaserade blåsor8,11,14. Hittills har tillämpade protokoll för vesikelbildning ofta saknar monteringskontroll över mikrometerstora församlingar16,17eller har begränsad monteringsavkastning5. Dessutom har vissa rapporterade ELP-baserade vesicles försämrat inkapslingspotential12eller begränsad stabilitet över tiden9. Att ta itu med dessa nackdelar, de presenterade protokollen möjliggör självmontering av mikrometer och sub mikrometer storlek supramolekylära strukturer med distinkta physiochemical egenskaper, god inkapsling potential och lång tid stabilitet. Skräddarsydda amphiphilic ELPs montera i supramolekylära strukturer, som spänner över allt från sfäriska coacervates och högt beställda vridna fiber buntar till unilamellar blåsor beroende på tillämpad protokoll och tillhörande miljöförhållanden. Stora vesikulära proteinmembranbaserade fack (PMBC) avslöjar alla huvudsakliga fenotyper såsom membranfusion och fasseparationsbeteende som är analogt med liposomer. PMBC:er kapslar effektivt in kemiskt olika fluorescerande lastmolekyler som kan övervakas med hjälp av enkel epifluorescensmikroskopi. De repetitiva ELP-domäner som används i denna studie är attraktiva byggstenar för proteinbaserade supramolekylära arkitekturer18. ELP pentapeptid upprepa enheten (VPGVG) är känd för att tolerera olika aa förutom proline på fjärde plats (valine, V), samtidigt som dess strukturella och funktionella egenskaper19. Utformningen av amphifila ELPs som innehåller särskiljande hydrofila och hydrofoba domäner realiserades genom att aa gästrester (X) infogas i VPGXG upprepa med distinkt hydrofobiskhet, polaritet och laddning20. Amfifila ELP-domäner utrustade med hydrofoba fenylalanin (F) eller isoleucin (I) medan den hydrofila domänen innehöll laddad glutaminsyra (E) eller arginin (R) som gästrester. En förteckning över stödberättigande amphifila ELP-konstruktioner och motsvarande aa-sekvenser finns i den kompletterande informationen och hänvisningarna8,21. Alla byggstenar utrustade antingen med små fluorescerande färgämnen eller fluorescerande proteiner för visualisering via fluorescensmikroskopi. mEGFP och andra fluorescerande proteiner var N-terminally smält till hydrofila domäner elp amfifiler . Organiska färgämnen konjugerades via koppar-fri stam främjas alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) till en co-translationally införts onaturliga aminosyra (UAA). Det medöversättningsmässiga införlivandet av UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22tillstånd att ändra N-terminalen av den hydrofila ELP-domänen. På detta sätt den gröna fluorescerande färgämne BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) eller någon liten fluorescerande molekyl med en ansträngd cyklooctyne kan användas som fluorescerande sond. Framgångsrik införlivande av UAA pAzF och cycloaddition av färgen via SPAAC kan enkelt bekräftas via LC-MS/MS på grund av effektiv jonisering av motsvarande tryptiska peptider8. Detta lilla organiska färgämne applicerades för att bredda lösningsmedelsvalet för monteringsprotokoll, eftersom fluorescerande proteiner är oförenliga med de flesta organiska lösningsmedel. De två mest effektiva monteringsprotokollen för supramolekylära strukturer som utvecklats i vårt labb beskrivs nedan. THF svullnad metoden är endast kompatibel med organiska färgämne modifierade amfifil ELP. Däremot är 1-butanol (BuOH) extruderingsmetod kompatibel med många proteiner som fluorescerande sond t.ex. Dessutom fungerar inkapsling av små molekyler och vesikulärt fusionsbeteende bäst genom att använda BuOH-extruderingsmetoden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1191px;" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1 &#181;m and 0.2 &#181;m Steril Filter</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">1-butanol. &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2log DNA ladder</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">50 mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">79249 Alkyne Mega Stokes dye</td>
			<td style="width:411px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetic acid glacial</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Acetonitrile, anhydrous, 99.8%</td>
			<td style="width:411px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ampicillin sodium-salt, 99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BDP-FL-PEG4-DBCO</td>
			<td style="width:411px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Biofuge</td>
			<td style="width:411px;">Heraeus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Bottle Top Filter with PES membrane (45 &#181;m, 22 &#181;m)</td>
			<td style="width:411px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Brillant Blue G250 (Coomassie)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">BspQI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Camera DS Qi1</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5417r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Centrifuge 5810r</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CF-400-Cu square mesh copper grid</td>
			<td style="width:411px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">CompactStar CS 4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral</td>
			<td style="width:411px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifier</td>
			<td style="width:411px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Dnase I</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EarI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Environmental shaker incubator ES-20</td>
			<td style="width:411px;">Biosan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Filter supports</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glass plates</td>
			<td style="width:411px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycerol Proteomics Grade</td>
			<td style="width:411px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Glycin</td>
			<td style="width:411px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">H4-Azido-Phe-OH</td>
			<td style="width:411px;">Bachhem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Heat plate MR HeiTec</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HindIII</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">HisTrap FF crude column</td>
			<td style="width:411px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nickel column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator ix 20</td>
			<td style="width:411px;">INTAS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Illuminator LAS-4000</td>
			<td style="width:411px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Imidazole</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Immersions oil for microscopy</td>
			<td style="width:411px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Incubators shakers Unimax 1010</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Inkubator 1000</td>
			<td style="width:411px;">Heidolph</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">IPTG, &#62;99%</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Kanamycinsulfate</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">L(+)-Arabinose</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE</td>
			<td style="width:411px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">LB-Medium</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lyophilizer Alpha 2-4 LSC</td>
			<td style="width:411px;">Christ</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Lysozyme, 20000 U/mg</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope CM 100</td>
			<td style="width:411px;">Philips</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscope Eclipse TS 100</td>
			<td style="width:411px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Microwave</td>
			<td style="width:411px;">Studio</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Mini-Extruder Set</td>
			<td style="width:411px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">NaCl, &#62;99.5%, p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Natriumhydroxid pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ni-NTA Agarose, PerfectPro</td>
			<td style="width:411px;">5 Prime</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Nucleopore Track-Etch Membrane</td>
			<td style="width:411px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PH meter 766 calimatic</td>
			<td style="width:411px;">Knick</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Polypropylene Columns (1 mL)</td>
			<td style="width:411px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">PowerPac basic</td>
			<td style="width:411px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Propanol-2-ol</td>
			<td style="width:411px;">Emplura</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Protein ladder 10-250 kDa</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Recirculating cooler F12</td>
			<td style="width:411px;">Julabo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Reinforcement rings</td>
			<td style="width:411px;">Herma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SacI HF</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">SDS Pellets</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TEMED</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">TexasRed Dextran-Conjugate</td>
			<td style="width:411px;">MolecularProbes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Thermomix comfort</td>
			<td style="width:411px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">THF, &#62;99.5% p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Trypton/Pepton from Casein</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:411px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Urea p.a.</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Vacuum pump 2.5</td>
			<td style="width:411px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XbaI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">XhoI</td>
			<td style="width:411px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td>
			<td style="width:411px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed assembly of elastin-like proteins into defined supramolecular structures and cargo encapsulation in vitro

Skräddarsydda proteinhaltiga byggstenar är mångsidiga kandidater för montering av supramolekylära strukturer som minimala celler, drug delivery-fordon och enzymställningar. På grund av deras biokompatibilitet och tunabilitet på genetisk nivå är Elastin-liknande proteiner (ELP) idealiska byggstenar för biotekniska och biomedicinska tillämpningar. Ändå är montering av proteinbaserade supramolekylära strukturer med distinkta fysiokemiska egenskaper och god inkapsling potential fortfarande utmanande.
Här erbjuder vi två effektiva protokoll för guidad självmontering av amfifila ELPs i supramolekylära proteinarkitekturer som sfäriska coacervates, fibrer och stabila blåsor. De presenterade monteringsprotokollen genererar PROTEINMembranbaserade fack (PMBCs) baserade på ELPs med anpassningsbara fysikaliska kemiska egenskaper. PMBC:er demonstrerar fasseparationsbeteende och avslöjar metodberoende membranfusion och kan kapsla in kemiskt olika fluorescerande lastmolekyler. De resulterande PMBCs har en hög applikationspotential som en läkemedelsformulering och leveransplattform, artificiell cell och uppdelade reaktionsutrymme.

Protokollutveckling för vesikelproduktion Figur 1 beskriver de två olika vesikelberedningsmetoderna. THF svullnad metoden på vänster sida består av tre på varandra följande steg och resulterar i olika supramolekylära församlingar av ELP beroende på temperaturen. I figur 1A epifluorescensmikroskopi bilder visar blåsor monterade från BDP-R20F20 och fibrillary strukturer monterade från BDP-R40F20. BuOH-m...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro at JoVE.com

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

I gränssnittet mellan organiska och vattenhaltiga lösningsmedel samlas skräddarsydda amphifila elastinliknande proteiner till komplexa supramolekylära strukturer som blåsor, fibrer och coacervater som utlöses av miljöparametrar. De beskrivna monteringsprotokollen ger proteinmembranbaserade fack (PMBCs) med avstämbara egenskaper, vilket möjliggör inkapsling av olika laster.

Riktad montering av Elastin-liknande proteiner i definierade supramolekylära strukturer och lastinkapsling In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Den effektiva monteringen av supramolekylära strukturer för minimal celldesign och läkemedelsleverans är fortfarande utmanande. Här visar vi effektiva protokoll som ger supramolekylära strukturer baserade på amfifila elastin-liknande proteiner. De presenterade monteringsprotokollen genererar mångsidiga supramolekylära strukturer med anpassningsbara fysikalkemiska egenskaper, såsom vesiklar, fibrer och coacervates.Proteinmembranbaserade avdelningar visar fassepareringsbeteende och möjliggör inkapsling av kemiskt olikartade lysrörslastmolekyler. För uttryck av F20E20-mEGFP och F20E20-mCherry, inokulerar den huvudsakliga uttryckskulturen från över natten pre-kultur till en OD600 av 0.3. Inkubera den i 400 milliliter sterilt LB-medium kompletterat med lämpliga antibiotika vid 37 grader Celsius och 200 rpm.När uttrycket kulturen når OD600 av 0,5 till 0,8, lägg IPTG till en slutlig koncentration av en millimolar, och minska inkubation temperaturen till 20 grader Celsius. För uttryck av amfifil ELP med den onaturliga aminosyran, inokulera huvuduttryckskulturen från över natten E.coli pre-kultur som innehåller de lämpliga plasmiderna till en OD på 0,3. Inkubera den i 400 milliliter sterilt LB-medium kompletterat med kanamycin och kloramfenikol vid 37 grader Celsius och 200 rpm.För att förbereda 100-millimolar onaturliga aminosyra lager, tillsätt 206,2 milligram onaturlig aminosyra till åtta milliliter ultrarent vatten. Höj pH-värdet i lösningen med tre-molar natriumhydroxid, och blanda kraftigt. När den onaturliga aminosyran är upplöst, sänk pH-värdet till ungefär 10,5, och tillsätt ultrapure vatten till en volym av 10 milliliter.Filtrera lösningen med ett sterilt 0,22-mikrometerfilter, och alikvotera det i två milliliter reaktionsrör. När uttrycket kulturen når OD600 av 0,5 till 0,8, tillsätt den onaturliga aminosyran till en slutlig koncentration av två millimolar. Inkubera den i 10 minuter till.Inducera sedan uttryck av målproteinet och den nödvändiga tRNA-synteeta via samtidig tillsats av IPTG och arabinos. Minska inkubationstemperaturen till 20 grader Celsius, och låt uttrycket fortsätta i cirka 20 timmar. Efter inkubationen, skörda cellerna genom centrifugation vid fyra grader Celsius och 4, 000 gånger g i 40 minuter.Resuspend cell pelleten i lysbuffert med lysozym och PMSF. Inkubera lösningen i 30 minuter på is. Sedan frysa och tina den två gånger genom att dränka i flytande kväve.Sonikera suspensionen, och rensa lysate genom centrifugeringen vid 10, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 40 minuter. Sedan rena proteinet med hjälp av affinitetkromatografi. Efter protein eluering, lagra den i fyra grader Celsius tills vidare användning.Tillsätt en mikroliter fluorescerande färgämne till 500 mikroliter ELP-lösning, och inkubera reaktionen i ca 10 timmar vid 15 grader Celsius medan du skakar i en ThermoMixer, se till att skydda den från ljus. För att avlägsna överdrivet fluorescerande färgämne, jämvikt en dialys membran i ultrarent vatten i 10 minuter. Skär membranet i rätt storlek för att placeras ovanpå reaktionsrörets öppning med den klickade ELP-lösningen.Fixera sedan membranet till öppningen genom att stänga röret med ett lock som inte har någon kärna. Fyll utrymmet mellan lock och membran med buffert för att förhindra svällning av luft. Placera sedan reaktionsröret i den valda bufferten, tryck det under ytan och vänd det upp och ner.Utför dialys i minst tre timmar vid fyra grader Celsius, vilket gör att dialysen kan fortsätta i minst tre timmar till efter varje buffertbyte. För THF svullnad, dialyze den homogena ELP lösningen mot fosfat eller Tris buffert med stabilt pH 7.5. Förbered lyofilisatorn, och kyl den till starttemperatur för frystorkning.Alikvoten den dialyserade proteinlösningen i 1,5-milliliter reaktionsrör, och förslut med lock med ett litet hål för att undvika att förlora det fasta provet på grund av tryckförändringar i loppet av frystorkning. Chockfrysa proverna i flytande kväve. Ta ut de frysta proteinproverna ur det flytande kvävet, och placera dem omedelbart i lyofilisen för att börja frysa torkningen.Efter provet är helt torrt, ventilera den med torrt kväve, och stäng omedelbart reaktionsröret lock för att undvika kontakt med luftfukt. Lägg till ren THF till lyofilaterade prover, och placera lösningen i ett vattenbad sonicator med isvatten i 15 minuter. Förvärm en termocyklare till 30 till 60 grader Celsius för vesikelbildning eller upp till 90 grader Celsius för fiberbildning, och förbered nya reaktionsrör med antingen ultrarent vatten eller buffert.Efter ultraljudsbehandling, placera ELP/ THF lösning och den förberedda vatten eller buffert i thermocycler i fem minuter. Stratifiera sedan ELP-lösningen ovanpå vattnet eller bufferten, och se till att separationen av de två faserna och en distinkt interfas är synlig och placera blandningen tillbaka i termocyklaren. Låt provet svalna i rumstemperatur i 10 minuter, och fortsätt med dialys mot vatten eller buffert eller med fluorescensmikroskopi.Förbered en en-till 50-mikromolar ELP-lösning, och lägg till 10 till 20%1-butanol. Blanda omedelbart lösningen genom att pipettera upp och ner. Grumligheten i lösningen bör öka under blandning, vilket indikerar vesikelbildning.För att uppnå en smal storleksfördelning, extrudera vesicles med en mini extruder genom ett membran med en porstorlek på en mikrometer. För färginkapsling, blanda cirka 40 mikroliter ELP-lösning i 10-millimolar Tris-HCl med en mikroliter av Dextran Texas Röd stamlösning i DMSO. Tillsätt 10 mikroliter av 1-butanol, och extrudera fem till 10 gånger genom en spruta utrustad med en 0,25-by-25-millimeters nål.THF-svällningsmetoden är sammansatt av tre successiva steg och resulterar i olika supramolekylära sammansättningar av ELP beroende på temperaturen. De epifluorescens mikroskopi bilderna visar vesiklar monteras från BDP-R20F20 och fibrillary strukturer monteras från BDP-R40F20. Den 1-butanol extrudering metod leder uteslutande till bildandet av ELP vesicles.Om två storleksordningar fler vesicles produceras jämfört med THF svullnad metoden. BDP-R40F20 blandades med 10 till 15%butanol, och vesicles framställdes via extrudering av blandningen. Olika supramolekylära strukturer var monteras från BDP-R40F20 via THF svullnad protokollet.PH av bufferten och temperaturen i monteringsprocessen justerades för att bilda antingen coacervates, fibriller, eller vesicles. Små misstag i monteringsprotokollet kan leda till bildandet av aggregat. Positivt laddade färgämne ATTO Rho 13 och polysackarid dextran röda 3000 var inkapslade i lumen av vesicles monteras från F20R20-mEGFP via 1-butanol extrudering metod.Confocal mikroskopi bilder visar vesiklarna i den gröna kanalen, lasten i den röda kanalen, och den framgångsrika inkapsling i den resulterande sammanslagna kanalen. Fas separation och fusion beteende ELP amfifiler vid blandning av enda PMBC byggstenar kontra monterade PMBC populationer visades också. Blandning före PMBC-montering leder till homogent fördelade molekyler inom det monterade PMBC-membranet, medan blandning av ihopmonterade vesikelpopulationer leder till membranfläckar av röd eller grön fluorescens som är synliga i minst 20 minuter.När du försöker detta förfarande, är det viktigt att uppmärksamma rätt steg ordning och för skillnaderna mellan THF svullnad metod och butanol extrudering metod. Efter detta protokoll kan ELP-vesiklarna användas som drug delivery shuttles, som plattform för enzymatiska reaktioner, såsom in vitro-transkription och översättning, eller i bildningen av syntetiska minimala celler.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami inspirerade självorganisering av Mönstrade och omkonfigurerbara partiklar

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildning av Beställda Biomolecular Structures av självorganisering av korta peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS och IR-spektroskopi väldefinierade ytor förbehandlade av Soft Landing av Mass-utvalda Joner

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Atomically Defined Templates for Epitaxial Growth of Complex Oxide Thin Films

Atomically definierade mallar för epitaxiell tillväxt av Complex Oxide Thin Films

Atomically defined substrate surfaces are prerequisite for the epitaxial growth of complex oxide thin films. In this protocol, two approaches to obtain ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

Konstruktion och Systematiska Symmetrisk Studier av en serie av Supramolecular Clusters med binära eller ternära Ammonium Triphenylacetates

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

Encapsulation of Cancer Therapeutic Agent Dacarbazine Using Nanostructured Lipid Carrier

Inkapsling av cancer terapeutiskt medel Dakarbazin Använda Nanostrukturerade lipidbärare

The only formula of dacarbazine (Dac) in clinical use is intravenous infusion, presenting a poor therapeutic profile due to the low dispersity of the drug ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Mycket stabil, funktionell Hairy Nanopartiklar och Biopolymerer av träfibrer: Towards Sustainable Nanoteknik

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Från molekyler till material: iscensätta nya Joniska flytande kristaller genom Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...