Name: live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

1. גידול צמחים
<ol><li>לזרוע זרעי Arabidopsis המביעים תחום מחייב microtubule התמזגו עם חלבון פלורסנט ירוק (MBD-GFP)10 על הקרקע ולשמור ביום ארוך (16 שעות יום / 8 שעות בלילה), 20 מעלות C / 6 ° C תנאים במשך שבוע אחד לנביטה.</li>
	<li>לאחר הנביטה, להעביר שתילים סירים חדשים עם שטח צמיחה מספיק כדי לאפשר צמיחה צ...

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly.">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li><li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+cellulose+synthesis.">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li><li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls.">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li><li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules.">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem.">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport.">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).</li><li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis:+a+quantitative+pipeline.">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li><li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth.">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li><li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells.">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li><li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX.">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+SurfCut:+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks.">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FibrilTool,+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis.">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells.">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036 (2019).</li><li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis.">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li><li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis.">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li></ol>

ההערכה של אירועי תמרת אותות מכניים היא קריטית לזיהוי רגולטורים מולקולריים המעורבים במסלולי התפיסה והמתמר המכנו. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תצוגה כמותית של אירועים כאלה באמצעות תגובת microtubule קליפתי כקריאה עבור תהליך כזה ב- Arabidopsis SAMs. ההליך המתואר כאן משמש באופן שגרתי במספר מחקרים בסוגי...

תאי הצמח מוקפים מטריצה חוץ תאית של פוליסכרידים ו גליקופרוטינים הדומה מכנית לחומר מרוכב מחוזק סיבים המסוגל לשנות באופן דינמי את תכונותיו המכניות1. צמיחה בתאי הצמח מונעת על ידי ספיגת מים לתוך התא, מה שופך הצטברות במקביל של כוחות מתיחה על קיר התא. בתגובה לכוחות כאלה, שינויים במצב הפיזי של קיר התא מאפשרים התרחבות תאים. תאים עם קירות ראשיים מסוגלים לעבור צמיחה מהירה לעומת קיר תא משני המכיל תאים בעיקר בשל הבדלים בהרכב הכימי של הפוליסכרידים בפנים. תאי קיר ראשיים מורכבים תאית, hemicellulose, פקטין, בנוסף גליקופרוטינים, וחסר ליגנין, רכיב כי הוא קיים בקיר התא המשני2. תאית, פולימר גלוקוז מקושר באמצעות β-1,4 אג"ח, הוא המרכיב העיקרי של קירות התא. הוא מאורגן לתוך מבנים fibrillar המסוגלים לעמוד כוחות מתיחה גבוהה חוו במהלך צמיחת התא3. בנוסף לכוחות מתיחה עומדים, חיזוק מכני לאורך כיוון מועדף תוצאתו התרחבות מונעת טורגור לאורך ציר ניצב לכיוון נטו של מיקרופיבריל תאית. הארגון של מיקרופיבריל תאית מושפע microtubule קליפתי cytoskeleton, כפי שהם מנחים את התנועה הכיוונית של תאית סינתזה מורכבים הממוקמים קרום פלזמה4. לכן, ניטור ארגון microtubule קליפתי באמצעות חלבון או צינור הקשורים microtubule התמזגו עם מולקולת פלורסנט משמש פרוקסי לתצפית על דפוסים של תאית בתאי הצמח.
התבניות של השלד ציטוסק microtubule קליפתי נמצא תחת שליטה של מורפולוגיה תא ורקמות נגזר כוחות מכניים. ארגון microtubule קליפתי אין כל ארגון מועדף לאורך זמן בתאים הממוקמים בשיאו של SAM, בעוד תאים בפריפריה ואת הגבול בין SAM האיבר המתעוררים יש יציב, מערך סופר-גולגולתי מאורגן מאוד של מיקרוטובולותקליפתיות 5. מספר גישות פותחו כדי לפגוע פיזית במצב המכני של התאים. שינויים במצב osmotic, כמו גם טיפול עם תרכובות פרמקולוגיות אנזימטיות המשפיעות על הנוקשות של קיר התא יכול לגרום לשינויים הבאים בכוחות מתיחהשחוו תא 6,7. השימוש במתקן המאפשר עלייה הדרגתית בכוחות הלחץ שחוו רקמות הוא חלופה נוספת8. יישום של כוחות צנטריפוגליים גם הופק להשפיע על הכוחות המכניים ללא כל מגע פיזי עם התאים9. עם זאת, האמצעים הנפוצים ביותר של שינוי כוחות כיווניים בקבוצת תאים לנצל את העובדה כי כל התאים האפידרמיס נמצאים תחת מתח אבלציה פיזית של תאים יבטל את לחץ turgor באופן מקומי, כמו גם לשבש הדבקה מתא לתא, ובכך לשנות את כוחות מתיחה שחוו התאים השכנים. זה מבוצע או על ידי מיקוד לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה או באמצעות מחט בסדר.
כאן אנו מפרטים על תהליך ההדמיה וההערכה של התנהגות מיקרוטובולה קליפתית עבור סטייה מכנית ב SAM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FibrilTool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04201.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP4-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore tape</td>
			<td>Leukopor</td>
			<td>02482-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MorphographX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-benzyladenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hinged box</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>64312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
			<td>Plant Cell Technology</td>
			<td>PPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFCUT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem

הבנת רגולציה ברמת התא והרקמות של צמיחה ומורחוגנזה כבר בחזית המחקר הביולוגי במשך עשורים רבים. ההתקדמות בטכנולוגיות מולקולריות והדמיה אפשרה לנו לקבל תובנות כיצד אותות ביוכימיים משפיעים על אירועים מורפוגנטיים. עם זאת, זה יותר ויותר ברור כי מלבד אותות ביוכימיים, רמזים מכניים גם להשפיע על מספר היבטים של צמיחת תאים ורקמות. Arabidopsis לירות meristem apical (SAM) הוא מבנה בצורת כיפה אחראי על הדור של כל האיברים מעל פני הקרקע. הארגון של השלד ציטוסק המיקרוטובולה קליפתית כי מתווכת תצהיר תאית אפופלסטית בתאי הצמח הוא ייחודי מרחבית. הדמיה והערכה כמותית של דפוסים של מיקרוטובוליות קליפתיות נחוצים להבנת האופי הביופיזי של תאים ב SAM, כמו תאית הוא המרכיב הנוקשה ביותר של קיר התא צמח. הצורה הסטריאוטיפית של ארגון מיקרוטובולה קליפתית היא גם תוצאה של כוחות פיזיים רחבים רקמות הקיימים ב-SAM. סטייה של כוחות פיזיים אלה וניטור עוקבות של ארגון מיקרוטובולה קליפתית מאפשר זיהוי של חלבונים מועמד מעורב בתיווך תפיסה מכנו ותזוזה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המסייע לחקור תהליכים כאלה.

איור 1 מציג תמונות הקרנה אופייניות המתקבלות מקווי MBD-GFP עם תאים במרכז הכיפה המכילים מיקרוטובולות קליפתיות לא מאורגנות, ותאים בפריפריה בעליהתפלגות היקף (איור 1A,B), בעודשתאי תחום הגבול מכילים מיקרוטובולות קליפתיות המיושרות במקביל ל...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

פרוטוקול זה עוזר לנו להבין כיצד התנהגות ציטוסקלטון Microtubule מתרחשת בצמחים. יחד עם זאת, זה גם עוזר לנו להבין כיצד רכיבים מבניים אלה המשפיעים על צורת התאים והאיברים, מגיבים לשינויים בכוחות מכניים. אמנם, שיטה זו דורשת תחכום מועט, היא מספקת חזק, כמותי לקרוא אחרי, הבדלי התגובה המכנית בין genotypes שונים ותנאים.התחל בגידול זרעי arabidopsis המבטאת תחומים מחייבים microtubule התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק באדמה, ב 20 ו 6 מעלות צלזיוס בתנאי יום ארוכים במשך שבוע. לאחר הנביטה, מעבירים את השתילים לסירים חדשים עם מרחב צמיחה מספיק כדי לאפשר צמיחה צמחית חזקה, וממקמים את הצמחים ב 20 ו 16 מעלות צלזיוס בתנאי יום קצרים. לאחר שלושה עד חמישה שבועות, מעבירים את הצמחים בחזרה לתנאי יום ארוכים באותה טמפרטורה עד שהצמחים בורחים, ומאפשרים לתפרחת לגדול עד לאורך של שניים עד חמישה סנטימטרים.עבור לירות Apical Meristem dissection, לשים את תפרחת, ולהשתמש מלקחיים חדים לקלף את הפרחים בבסיס של peduncles, עד שקשה לראות את peduncles עם עין בלתי כדי להסיר את ניצני הפרחים הישנים. השתמש במקלות כדי ליצור חריץ אגרוס בצלחת חיטוי, ולשתול את בסיס תפרחת לתוך Augur עבה. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ נותח.החל ניצן הפרח העתיק ביותר, לדחוף עם המדפים כדי להסיר את ניצן הפרח מן הצמח. מריסטם apical לירות נחשף בדרך כלל כאשר פרחים ישנים עד שלב שש עד שבע מוסרים. ולהשתמש במקלות כדי לדחוף כל ניצן פרח למטה עד מריסטם apical לירות גלוי.ברגע שהריסתם האפורית תיחשף, תן למדגם הטרי לנתח את מדיום הצמיחה בקופסת תרבות צירי פלסטיק מלבנית מעקרת אתנול עם מריסטם אפיקל לירות רק חשוף מעל פני השטח הבינוניים. מוסיפים כמה טיפות של מים סטריליים deionized לקצוות של תיבת התרבות ולסגור את המכסה כדי לשמור על הלחות בתוך התיבה. עוטפים את הקופסה בקלטת מיקרופור, וממקמים את תיבת הגידול בתנאי יום ארוכים או רציפים ב-22 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות.כאשר הצמח התאושש מהליך הניתוח, לכסות את המדגם עם מים סטריליים deionized ולבדוק בועות אוויר תחת מיקרוסקופ ניתוח. העבר את תיבת התרבות לשלב מיקרוסקופ קונפוקל זקוף, ובחר את עדשת טבילת המים 40 או 60X. מנמיך את המטרה לתוך המים ולבדוק בועות אוויר על העדשה הקדמית של האובייקט.כדי להסיר בועות, להוריד את הבמה בעדינות לנגב את העדשה עם רקמה אופטית. לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר להוסיף נפח קטן של מים לעדשה הקדמית של המטרה לפני מחדש לטבול את העדשה במים. לאחר מכן, השתמש במסנן GFP ובמודול תאורת האפי-אפיון של המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לכוונן את בקר ה- XY כדי לאתר את הדגימה.התאמת המיקום של העין, למקם את meristem apical לירות ישירות מתחת למקור האור, ולהתמקד לאורך ציר Z עד לשיא ממוקם. השתמש בלייזר המסוגל להאיר את הדגימה, ולהתאים את הזום האופטי של המיקרוסקופ, כך שהמריסטם האפורי כולו והפרימורדיה הפרחונית בשלב הראשון נמצאים בשדה המבט. לאחר מכן, התאימו את העוצמה של פלט הלייזר ואת הגדרות הרווח כדי לקבל יחס אות אופטימלי לרעש.לאחר מתן אפשרות לדגימה להסתפק בשתיים עד חמש דקות, רכוש ערימות קונפוקל Z של המדגם במרווחי פרוסת Z של 0.25 עד 0.5 מיקרומטר, והוסיף כ- 0.3 מיקרו פיקסלים בגודל רזולוציה. בסיום הרכישה, יש לפנות מיד את המים ולהעביר את קופסת התרבות בחזרה לתא הצמיחה. עבור Micromechanical לירות Apical Meristem Perturbation, לרכוש ערימות תמונה טרום אבלציה של ארגון microtubule קליפת המוח כפי שהוכח רק, ו decaf את המים מתיבת התרבות לתוך צלחת תרבות.העבר את מריסטם apical לירות תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולאט לאט התקרב meristem אשוחית לירות עם מחט מזרק נקי 0.4 על ידי 20 מילימטר. צרו קשר בקצרה עם הפריפריה של כיפת הכיפה עם קצה המחט כדי לאשר שהאבלציה הושלמה. ול מילוי צלחת התרבות במים סטריליים.לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד למנה ומיד לרכוש ערימות תמונה כפי שהוכח כל שעתיים במשך שש שעות, להחזיר את צלחת התרבות הדגירה בין כל נקודת זמן. לניתוח נתונים, ליצור תחזיות פני השטח של ערימות התמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונה מתאימה, ולבצע חילוץ של אניסוטרופיה microtubule קליפת המוח באמצעות מאקרו כלי Fibril בפיג'י. כאן, תמונות הקרנה טיפוסיות המתקבלות מקווי GFP של תחום איגוד microtubule עם תאים במרכז הכיפה המכילים microtubules קליפת המוח לא מאורגנת, תאים בפריפריה, בעל התפלגות היקפית ותאי תחום גבול המכיל microtubules קליפת המוח מיושר במקביל הציר הארוך של התא ניתן לראות.דימות זמן לשגות, מראה יישור microtubule קליפת המוח משתנה ממערך הפרעה מאוד למערך מאורגן יותר בתוך שש שעות של אבלציה. טנטורים יכולים להיות מובלטים על תמונות microtubule קליפת המוח, ואת המידע שחולץ יכול להיות מיוצג על ידי התוויית anisotropy הממוצע לאורך זמן. בעת התאמת כוח פלט לייזר ולקבל הגדרות, אנחנו צריכים להבטיח את זה תצפית ברורה של תריסים ולנסות למנוע overexposure, כמו מעל אותות רוויים יכול להטות את כיוון מתיחה בניתוח מאוחר יותר.מיקרוסקופ כוח אטומי יכול להתבצע גם כדי להעריך כיצד השינויים בכוחות המכניים למעשה משפיעים על המצב הפיזי של קיר התא.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...