Name: live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

कोई नहीं।

1. पौधों का विकास
<ol><li>मिट्टी पर10 हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमबीडी-जीएफपी) के साथ जुड़े माइक्रोट्यूबुले बाध्यकारी डोमेन को व्यक्त करते हुए अरबीडोप्सिस बीज बोएं और अंकुरण के लिए 1 सप्ताह के लिए ...

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly.">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li><li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+cellulose+synthesis.">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li><li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls.">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li><li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules.">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem.">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport.">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).</li><li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis:+a+quantitative+pipeline.">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li><li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth.">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li><li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells.">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li><li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX.">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+SurfCut:+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks.">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FibrilTool,+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis.">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells.">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036 (2019).</li><li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis.">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li><li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis.">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li></ol>

मेकानो-परसेप्शन और ट्रांसडक्शन रास्तों में शामिल आणविक नियामकों की पहचान करने के लिए यांत्रिक सिग्नल ट्रांसडक्शन इवेंट्स का आकलन महत्वपूर्ण है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल अरबीडोप्सिस एसएएमएस में ?...

पौधों की कोशिकाएं पॉलीसैकराइड्स और ग्लाइकोप्रोटीन के एक बाहरी मैट्रिक्स से घिरी होती हैं जो यांत्रिक रूप से फाइबर प्रबलित समग्र सामग्री जैसा दिखता है जो गतिशील रूप से अपने यांत्रिक गुणों को बदलने में सक्षम है1। पौधों की कोशिकाओं में वृद्धि कोशिका में पानी के तेज से प्रेरित होती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका की दीवार पर तन्य बलों का सहवर्ती बिल्डअप होता है। ऐसी ताकतों के जवाब में, सेल दीवार की भौतिक स्थिति में संशोधन सेल विस्तार की अनुमति देता है। प्राथमिक दीवारों वाली कोशिकाएं मुख्य रूप से पॉलीसैकराइड्स की रासायनिक संरचना में अंतर के कारण कोशिकाओं वाली माध्यमिक कोशिका दीवार की तुलना में तेजी से विकास के दौर से गुजर रही हैं। प्राथमिक दीवार कोशिकाएं ग्लाइकोप्रोटीन के अलावा सेल्यूलोज, हेमीसेलुलोज और पेक्टिन से बनी होती हैं, और लिग्निन की कमी होती है, एक घटक जो माध्यमिक सेल दीवार2में मौजूद है। सेल्यूलोज, β-1,4 बांड के माध्यम से जुड़ा एक ग्लूकोज बहुलक, सेल दीवारों का प्रमुख घटक है। इसे फिब्रिलर संरचनाओं में व्यवस्थित किया जाता है जो सेल विकास के दौरान अनुभव की जाने वाली उच्च तन्य ताकतों को सहन करने में सक्षम हैं3. तन्य बलों को बर्दाश्त करने के अलावा, एक तरजीही दिशा के साथ यांत्रिक सुदृढीकरण के परिणामस्वरूप सेल्यूलोज माइक्रोफिब्रिल के शुद्ध अभिविन्यास के लिए एक धुरी लंबवत के साथ टर्गर-चालित विस्तार होता है। सेल्यूलोज माइक्रोफिब्रिल्स का संगठन कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन से प्रभावित होता है, क्योंकि वे प्लाज्मा झिल्ली4पर स्थित सेल्यूलोज-संश्लेषण परिसरों के दिशात्मक आंदोलन का मार्गदर्शन करते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट अणु के साथ जुड़े माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन या ट्यूबलिन का उपयोग करके कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन की निगरानी करना पौधों की कोशिकाओं में सेल्यूलोज के ओवरलाइंग पैटर्न के अवलोकन के लिए प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है।
कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन का पैटर्निंग सेल और ऊतक आकृति विज्ञान व्युत्पन्न यांत्रिक बलों के नियंत्रण में है। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन में सैम के शीर्ष पर स्थित कोशिकाओं में समय के साथ कोई तरजीही संगठन नहीं है, जबकि परिधि में कोशिकाओं और सैम और उभरते अंग के बीच की सीमा में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स5की एक स्थिर, अत्यधिक संगठित सुप्रासेलर सरणी है। कोशिकाओं की यांत्रिक स्थिति को शारीरिक रूप से परेशान करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। ऑस्मोटिक स्थिति में परिवर्तन, साथ ही कोशिका की दीवार की कठोरता को प्रभावित करने वाले औषधीय यौगिकों के साथ उपचार के परिणामस्वरूप सेल6,7द्वारा अनुभवी तन्य बलों में बाद में परिवर्तन हो सकते हैं। ऊतकों द्वारा अनुभव की जाने वाली संपीड़न बलों में क्रमिक वृद्धि की अनुमति देने वाले कॉन्ट्रापशन का उपयोग एक औरविकल्पहै । कोशिकाओं के साथ बिना किसी शारीरिक संपर्क के यांत्रिक बलों को प्रभावित करने के लिए अपकेंद्रित्रबलोंका उपयोग भी दिखाया गया है । हालांकि, कोशिकाओं के एक समूह में दिशात्मक ताकतों को बदलने का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला साधन इस तथ्य का लाभ उठाते हैं कि सभी एपिडर्मल कोशिकाएं तनाव में हैं और कोशिकाओं का शारीरिक एब्लेशन स्थानीय रूप से टर्गर दबाव को खत्म करेगा और साथ ही सेल-टू-सेल आसंजन को बाधित करेगा, जिससे पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा अनुभवी तन्य बलों को संशोधित किया जा सकेगा। यह या तो एक उच्च स्तरीय स्पंदित पराबैंगनी लेजर को लक्षित करके या एक ठीक सुई के माध्यम से किया जाता है।
यहां हम एसएएम में यांत्रिक क्षोभ के लिए कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल व्यवहार की इमेजिंग और आकलन की प्रक्रिया के बारे में विस्तार से बताते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FibrilTool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04201.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP4-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore tape</td>
			<td>Leukopor</td>
			<td>02482-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MorphographX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-benzyladenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hinged box</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>64312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
			<td>Plant Cell Technology</td>
			<td>PPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFCUT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem

ग्रोथ और मॉर्फोजेनेसिस के सेल और टिश्यू लेवल रेगुलेशन को समझना कई दशकों से बायोलॉजिकल रिसर्च में सबसे आगे रहा है । आणविक और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने हमें इस बारे में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति दी कि जैव रासायनिक संकेत मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं को कैसे प्रभावित करते हैं। हालांकि, यह तेजी से स्पष्ट है कि जैव रासायनिक संकेतों के अलावा, यांत्रिक संकेत कोशिका और ऊतक विकास के कई पहलुओं को भी प्रभावित करते हैं। अरबीडोप्सिस शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) एक गुंबद के आकार की संरचना है जो उपरोक्त सभी अंगों की पीढ़ी के लिए जिम्मेदार है। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन का संगठन जो पौधों की कोशिकाओं में एपोप्लास्टिक सेल्यूलोज जमाव को मध्यस्थता करता है, स्थानिक रूप से अलग है। सैम में कोशिकाओं की जैव भौतिक प्रकृति को समझने के लिए कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स के पैटर्न का विज़ुअलाइज़ेशन और मात्रात्मक मूल्यांकन आवश्यक है, क्योंकि सेल्यूलोज पौधे की कोशिका दीवार का सबसे कठोर घटक है। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन का टकसाली रूप भी सैम में मौजूद ऊतक-व्यापी शारीरिक बलों का परिणाम है। इन भौतिक ताकतों का क्षुभव और कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन की बाद की निगरानी मशीनो-धारणा और मध्यस्थता मध्यस्थता में शामिल उम्मीदवार प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देती है। यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो ऐसी प्रक्रियाओं की जांच करने में मदद करता है।

चित्रा 1 गुंबद के केंद्र में कोशिकाओं के साथ एमबीडी-जीएफपी लाइनों से प्राप्त विशिष्ट प्रक्षेपण छवियों को दिखाता है जिसमें अव्यवस्थित कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं, और प?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

यहां हम शूट एपिकल मेरिस्टेम में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और भौतिक ताकतों में परिवर्तन के प्रति इसकी प्रतिक्रिया की निगरानी करते हैं।

माइक्रोटुबुल साइटोस्केलेटन की लाइव सेल इमेजिंग और अरबीडोप्सिस शूट एपिकल मेरिस्टेम के माइक्रोमैकेनिकल हेरफेर

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

यह प्रोटोकॉल हमें यह समझने में मदद करता है कि पौधों में माइक्रोटुबुल साइटोस्केलेटन व्यवहार कैसे होता है। साथ ही, यह हमें यह समझने में भी मदद करता है कि कोशिका और अंग आकार को प्रभावित करने वाले ये संरचनात्मक घटक यांत्रिक बलों में परिवर्तन का जवाब कैसे देते हैं। हालांकि, इस विधि को थोड़ा परिष्कार की आवश्यकता होती है, यह विभिन्न जीनोटाइप और शर्तों के बीच यांत्रिक प्रतिक्रिया अंतर को मजबूत, मात्रात्मक रूप से पढ़ने के बाद प्रदान करता है।एक सप्ताह के लिए लंबे दिन की स्थितियों के तहत 20 और 6 डिग्री सेल्सियस पर मिट्टी में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े माइक्रोट्यूबुले बाध्यकारी डोमेन व्यक्त करने वाले अरबीडोप्सिस बीजों को बढ़ाकर शुरू करें। अंकुरण के बाद, मजबूत वनस्पति विकास की अनुमति देने के लिए पर्याप्त विकास स्थान के साथ नए बर्तनों में रोपण स्थानांतरित करें, और पौधों को कम दिन की स्थितियों के तहत 20 और 16 डिग्री सेल्सियस पर रखें। तीन से पांच सप्ताह के बाद, पौधों को एक ही तापमान पर लंबे दिन की स्थिति में वापस स्थानांतरित करें जब तक कि पौधे बोल्ट न हो जाएं, जिससे फूलों की कमी दो से पांच सेंटीमीटर तक बढ़ जाए।शूट एपिकल मेरिस्टेम विच्छेदन के लिए, फूलों को पुट करें, और फूलों को पीडंकल्स के आधार पर छीलने के लिए तेज संदंश का उपयोग करें, जब तक कि पुराने फूलों की कलियों को हटाने के लिए नग्न आंखों से पेडनकल्स देखना मुश्किल न हो। एक विच्छेदन पकवान में एग्रो में एक भट्ठा बनाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और मोटी शुभ संकेत में पुष्पन आधार संयंत्र । डिश को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।सबसे पुराने फूल कली के साथ शुरू, पौधे से फूल की कली को हटाने के लिए संदंश के साथ पुश करें। शूट एपिकल मेरिस्टेम आमतौर पर तब सामने आते हैं जब छह से सात चरण तक पुराने फूल हटा दिए जाते हैं। और प्रत्येक फूल कली को नीचे धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें जब तक कि शूट एपिकल मेरिस्टेम दिखाई न दे।जैसे ही शूट एपिकल मेरिस्टेम उजागर होता है, एक इथेनॉल-निष्फल आयताकार प्लास्टिक टिका संस्कृति बॉक्स में विकास माध्यम में हौसले से विच्छेदित नमूना को मध्यम सतह के ऊपर उजागर शूट एपिकल मेरिस्टेम के साथ दें। संस्कृति बॉक्स के किनारों पर बाँझ deionized पानी की कुछ बूंदें जोड़ें और बॉक्स के अंदर आर्द्रता बनाए रखने के लिए ढक्कन बंद करें। बॉक्स को माइक्रोपोर टेप के साथ लपेटें, और विकास बॉक्स को 12 से 24 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर लंबे या निरंतर दिन की स्थिति में रखें।जब पौधे विच्छेदन प्रक्रिया से बरामद हो जाता है, तो नमूने को बाँझ डिएकोनाइज्ड पानी से कवर करें और विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत हवा के बुलबुले की जांच करें। संस्कृति बॉक्स को एक ईमानदार कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें, और 40 या 60X पानी सूई लेंस का चयन करें। उद्देश्य को पानी में कम करें और वस्तु के सामने के लेंस पर हवा के बुलबुले की जांच करें।बुलबुले को हटाने के लिए, मंच को कम करें और धीरे-धीरे लेंस को ऑप्टिकल ऊतक से पोंछें। फिर पानी में लेंस को फिर से विसर्जित करने से पहले उद्देश्य के सामने के लेंस में पानी की एक छोटी मात्रा जोड़ने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इसके बाद, नमूने का पता लगाने के लिए XY नियंत्रक को समायोजित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के जीएफपी फिल्टर और एपीई-रोशनी मॉड्यूल का उपयोग करें।नेत्र की स्थिति को समायोजित करना, शूट एपिकल मेरिस्टेम को सीधे प्रकाश स्रोत के नीचे रखें, और शीर्ष स्थित होने तक जेड-एक्सिस के साथ ध्यान केंद्रित करें। नमूना रोशन करने के लिए रोमांचक GFP में सक्षम लेजर का प्रयोग करें, और माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल ज़ूम को समायोजित करें, ताकि पूरे शूट एपिकल मेरिस्टेम और स्टेज वन फ्लोरल प्राइमोर्डिया दृश्य के क्षेत्र में हों। फिर, शोर अनुपात के लिए एक इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए लेजर आउटपुट और लाभ सेटिंग्स की शक्ति को समायोजित करें।नमूना दो से पांच मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति देने के बाद, 0.25 से 0.5 माइक्रोमीटर जेड स्लाइस अंतराल पर नमूने के कॉन्फोकल जेड स्टैक प्राप्त करें, लगभग 0.3 माइक्रो मीटर पिक्सेल आकार का रिज़ॉल्यूशन जोड़ते हैं। अधिग्रहण के अंत में, तुरंत पानी को हटा दें और संस्कृति बॉक्स को वापस विकास कक्ष में स्थानांतरित करें। माइक्रोमैकेनिकल शूट एपिकल मेरिस्टेम क्षतुर्भवण के लिए, कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन के प्री-एब्लेशन इमेज स्टैक प्राप्त करें, जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है, और संस्कृति बॉक्स से पानी को संस्कृति पकवान में डिकैफ करें।एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत शूट एपिकल मेरिस्टेम को स्थानांतरित करें, और धीरे-धीरे शूट एपिकल मेरिस्टेम से 20 मिलीमीटर सिरिंज सुई द्वारा एक साफ 0.4 के साथ संपर्क किया। संक्षेप में सुई टिप के साथ शूट एपिकल मेरिस्टेम के गुंबद की परिधि से संपर्क करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि एब्लेशन पूरा हो गया है। और बाँझ deionized पानी के साथ संस्कृति पकवान फिर से भरना।फिर पकवान के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड के मिलीलीटर प्रति 10 माइक्रोग्राम जोड़ें और तुरंत छवि ढेर प्राप्त के रूप में छह घंटे के लिए हर दो घंटे का प्रदर्शन किया, हर समय बिंदु के बीच इनक्यूबेशन के लिए संस्कृति पकवान लौट । डेटा विश्लेषण के लिए, एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके छवि ढेर के सतह अनुमानों को उत्पन्न करें, और फिजी में फिब्रिल टूल मैक्रो का उपयोग करके कॉर्टिकल माइक्रोटुबुल एनिसोट्रोपी का निष्कर्षण करें। यहां, सूक्ष्मतुबुले बाध्यकारी डोमेन जीएफपी लाइनों से प्राप्त विशिष्ट प्रक्षेपण छवियां, जिसमें अव्यवस्थित कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स, परिधि में कोशिकाएं, परिधि में कोशिकाएं, एक परिधि वितरण और सीमा डोमेन कोशिकाओं वाली कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल्स युक्त कोशिकाओं को कोशिका की लंबी धुरी के समानांतर गठबंधन किया जा सकता है।समय-चूक इमेजिंग, एब्लेशन के छह घंटे के भीतर एक अत्यधिक अव्यवस्थित सरणी से अधिक संगठित सरणी में बदलने वाले कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल अलाइनमेंट को दिखाता है। Tensors कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल छवियों पर आरोपित किया जा सकता है, और निकाला जानकारी समय के साथ मतलब एनिसोट्रोपी की साजिश रचने से प्रतिनिधित्व किया जा सकता है । लेजर आउटपुट पावर और गेन सेटिंग्स को समायोजित करते समय, हमें यह सुनिश्चित करना चाहिए कि यह तंतुओं का स्पष्ट अवलोकन हो और अतिअसंप्ध से बचने की कोशिश करे, क्योंकि संतृप्त संकेतों पर बाद के विश्लेषण में तन्य दिशा को पूर्वाग्रह हो सकता है।परमाणु बल माइक्रोस्कोपी भी कैसे यांत्रिक बलों में परिवर्तन वास्तव में सेल की दीवार की भौतिक स्थिति को प्रभावित करने का आकलन करने के लिए किया जा सकता है ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

लार्वा zebrafish त्वचा में एक inducible Gal4 / यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए सहज प्रतिरक्षा और Preneoplastic सेल बातचीत का लाइव इमेजिंग

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

का लाइव-इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; पोटा संबंधी नेत्र

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

लाइव Arabidopsis फूल विकास की confocal इमेजिंग

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

लाइव इमेजिंग द्वारा माउस और उनके विज़ुअलाइज़ेशन में मानवहित अस्थि मरो माइक्रोएवावरमेंट्स बायोइंजिनिअरिंग

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

इन विट्रो Arabidopsis थालियाना में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए बीजांड खेती

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

बँटवारा के दौरान गुणसूत्र अलगाव की लाइव सेल इमेजिंग

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

अलग पौधों की प्रजातियों से गोली मार के एक प्रकार का पौधा की Confocal लाइव इमेजिंग

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

विच्छेदन और देर से भ्रूण ड्रोसोफिला गोनाड के लाइव-इमेजिंग

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

लाइव इमेजिंग के लिए फिब्रिन क्लॉट्स के साथ ड्रोसोफिला ऊतकों के स्थिरीकरण के अनुप्रयोग

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...