Name: live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

1. Bitki büyümesi
<ol><li>Ekek Arabidopsis tohumları toprakta yeşil floresan protein (MBD-GFP)10 ile erimiş mikrotübül bağlayıcı etki alanı ifade ve çimlenme için 1 hafta boyunca uzun gün (16 h gün / 8 saat gece), 20 °C/6 °C koşullarda tutmak.</li>
	<li>Çimlenme den sonra, sağlam bitkisel büyüme sağlamak için yeterli büyüme alanı ile yeni tencere için fide transferi. Bitkileri kısa bir gün (8 saat gün /16 saat gece), 20 °C/16 °C koşullarda 3-5 hafta bek...

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly.">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li><li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+cellulose+synthesis.">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li><li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls.">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li><li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules.">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem.">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport.">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).</li><li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis:+a+quantitative+pipeline.">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li><li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth.">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li><li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells.">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li><li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX.">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+SurfCut:+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks.">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).</li><li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FibrilTool,+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images.">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li><li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis.">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells.">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967 (2014).</li><li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth.">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036 (2019).</li><li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis.">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li><li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis.">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li></ol>

Mekanik sinyal transdüksiyon olaylarının değerlendirilmesi, mekano-algılama ve transdüksiyon yollarında yer alan moleküler düzenleyicileri belirlemek için çok önemlidir. Burada açıklanan protokol Arabidopsis SAM böyle bir süreç için bir okuma olarak kortikal mikrotübül yanıtı kullanarak bu tür olayların nicel bir görünüm sağlar. Burada açıklanan prosedür rutin çeşitli doku tipleri çeşitli çalışmalarda kullanılır16,17</su...

Bitki hücreleri, mekanik özelliklerini dinamik olarak değiştirebilen fiber takviyeli kompozit malzemeye mekanik olarak benzeyen polisakkaritler ve glikoproteinlerin hücre dışı bir matrisi ile çevrilidir1. Bitki hücrelerindeki büyüme, hücreiçine su alımı ile kaynaklanır, bu da hücre duvarında eşlik eden çekme kuvvetlerinin birikmesine neden olur. Bu tür kuvvetlere yanıt olarak, hücre duvarının fiziksel durumuna değişiklikler hücre genişlemesi için izin verir. Birincil duvarları olan hücreler, esas olarak içindeki polisakkaritlerin kimyasal bileşimindeki farklılıklar nedeniyle hücreleri içeren ikincil hücre duvarına göre hızlı büyüme yeteneğine sahiptir. Birincil duvar hücreleri glikoproteinlere ek olarak selüloz, hemiselüloz ve pektin oluşur, ve lignin eksikliği, ikincil hücre duvarı mevcut bir bileşeni2. Selüloz, β-1,4 bağları ile birbirine bağlı bir glikoz polimer, hücre duvarlarının ana bileşenidir. Hücre büyümesi sırasında yaşanan yüksek çekme kuvvetlerine dalabilen fibriller yapılar halinde organize edilir3. Çekme kuvvetlerine dayanmanın yanı sıra, tercihli yönde mekanik takviye selüloz mikrofibril net yönünü dik bir eksen boyunca turgor tahrikli genişleme ile sonuçlanır. Selüloz mikrofibrillerin organizasyonu kortikal mikrotübül sitoiskeletinden etkilenir, çünkü plazma zarında bulunan selüloz sentezleyici komplekslerin yön hareketini yönlendirirler4. Bu nedenle, bir floresan molekül ile erimiş bir mikrotübül ilişkili protein veya tubulin kullanarak kortikal mikrotübül organizasyonu izleme bitki hücrelerinde selüloz örten desenlerin gözlem için bir proxy olarak hizmet vermektedir.
Kortikal mikrotübül sitoiskeletinin desenlemi hücre ve doku morfolojisi kaynaklı mekanik kuvvetlerin kontrolü altındadır. Kortikal mikrotübül organizasyonu SAM'in tepesinde bulunan hücrelerde zaman içinde herhangi bir tercihli organizasyona sahip değildir, oysa SAM ve gelişmekte olan organ arasındaki çevre ve sınırdaki hücreler kortikalmikrotübüllerin kararlı, son derece organize suprasellüler dizilimine sahiptir 5 . Hücrelerin mekanik durumunu fiziksel olarak rahatsız etmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Ozmotik durum değişiklikleri, hücre duvarının sertliğini etkileyen farmakolojik ve enzimatik bileşikler ile tedavi hücre tarafından deneyimli çekme kuvvetlerinde sonraki değişikliklere neden olabilir6,7. Dokuların yaşadığı kompresif kuvvetlerde kademeli artışa olanak sağlayan mekanizmaların kullanımı başka bir alternatif8. Santrifüj kuvvetlerinin uygulanması da hücreleri ile herhangi bir fiziksel temas olmadan mekanik kuvvetleri etkilemek için gösterilmiştir9. Ancak, bir grup hücrede yön kuvvetlerini değiştirmenin en yaygın olarak kullanılan araçları, tüm epidermal hücrelerin gerilim altında olduğu ve hücrelerin fiziksel ablasyonunun yerel olarak turgor basıncını ortadan kaldıracağı ve hücreden hücreye yapışmasını bozacağı ve komşu hücrelerin yaşadığı çekme kuvvetlerini değiştireceği gerçeğinden yararlanır. Bu ya yüksek güçlü darbeli ultraviyole lazer hedefleyerek ya da ince bir iğne ile gerçekleştirilir.
Burada, SAM'de mekanik pertürbasyon için kortikal mikrotübül davranışının görüntülenmesi ve değerlendirilmesi süreci hakkında ayrıntılı bilgi ve regülasyon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FibrilTool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04201.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM6000 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP4-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropore tape</td>
			<td>Leukopor</td>
			<td>02482-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MorphographX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-benzyladenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicotinic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hinged box</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>64312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
			<td>Plant Cell Technology</td>
			<td>PPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFCUT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of microtubule cytoskeleton and micromechanical manipulation of the arabidopsis shoot apical meristem

Büyüme ve morfogenezin hücre ve doku düzeyinde ki düzenlenmesini anlamak uzun yıllardır biyolojik araştırmaların ön saflarında yer almaktadır. Moleküler ve görüntüleme teknolojilerinde ki gelişmeler, biyokimyasal sinyallerin morfogenetik olayları nasıl etkilediğine dair bilgi edinmemizi sağladı. Ancak, biyokimyasal sinyaller dışında, mekanik ipuçları da hücre ve doku büyüme çeşitli yönlerini etkilediği giderek daha belirgindir. Arabidopsis shoot apikal meristem (SAM), tüm yer üstü organlarının oluşumundan sorumlu kubbe şeklinde bir yapıdır. Bitki hücrelerinde apoplastik selüloz birikimine aracılık eden kortikal mikrotübül sitoiskeletinin organizasyonu mekansal olarak farklıdır. Selüloz bitki hücre duvarının en sert bileşeni olduğu için, kortikal mikrotübüllerin desenlerinin görselleştirilmesi ve kantitatif değerlendirilmesi SAM'deki hücrelerin biyofiziksel doğasını anlamak için gereklidir. Kortikal mikrotübül organizasyonunun basmakalıp formu da SAM'de var olan doku çapındaki fiziksel güçlerin bir sonucudur. Bu fiziksel güçlerin pertürbasyonu ve kortikal mikrotübül organizasyonunun daha sonra izlenmesi, mekano algısı ve transdüksiyona aracılık eden aday proteinlerin belirlenmesine olanak sağlar. Burada, bu tür işlemlerin araştırılmasına yardımcı olan bir protokol açıklıyoruz.

Şekil 1, kubbenin merkezinde dağınık kortikal mikrotübüller içeren hücrelerle MBD-GFP çizgilerinden elde edilen tipik projeksiyon görüntülerini ve çevredeki hücreler(Şekil 1A,B),sınır etki alanı hücrelerinde ise hücrenin uzun eksenine paralel olarak hizalanmış kortikal mikrotübüller içerir. Bu gözlemler, KORTİKAL mikrotübüllerin SAM'in farklı etki alanlarındaki mekansal dağılımı...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem at JoVE.com

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Burada, ateş apikal meristem'deki kortikal mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve fiziksel kuvvetlerdeki değişikliklere tepkisini izleme protokolünü anlatıyoruz.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Bu protokol, mikrotübüle Sitoiskelet davranışının bitkilerde nasıl oluştuğunu anlamamıza yardımcı olur. Aynı zamanda, hücre ve organ şeklini etkileyen bu yapısal bileşenlerin mekanik kuvvetlerdeki değişikliklere nasıl tepki verdiğini anlamamıza da yardımcı olur. Her ne kadar, bu yöntem çok az gelişmişlik gerektirir, sağlam, nicel okuma-sonra, farklı genotipler ve koşullar arasındaki mekanik yanıt farklılıkları sağlar.Bir hafta boyunca uzun gün koşullarında 20 ve 6 santigrat derece, toprakta yeşil floresan protein ile erimiş mikrotübül bağlayıcı etki gösteren arabidopsis tohumları büyüyen ile başlayın. Çimlenme den sonra, sağlam bitkisel büyüme sağlamak için yeterli büyüme alanı ile yeni tencere içine fide transfer ve kısa gün koşullarında 20 ve 16 derece santigrat bitkiler yerleştirin. Üç ila beş hafta sonra, bitkiler inişinceye kadar bitkileri aynı sıcaklıkta uzun gün koşullarına geri aktarın, çiçeklenmenin 2 ila 5 santimetre uzunluğunu aşmasını sağlar.Shoot Apikal Meristem diseksiyonu için, çiçeklenme koymak ve yaşlı çiçek tomurcukları kaldırmak için çıplak gözle peduncles görmek zor olana kadar, peduncles tabanında çiçek soymak için keskin forseps kullanın. Bir diseksiyon çanak içinde agros bir yarık oluşturmak için forceps kullanın ve kalın Augur içine çiçeklenme tabanı bitki. Bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin.En eski çiçek tonucu ile başlayarak, bitki çiçek tomurcuk kaldırmak için forceps ile itin. Ateş apikal meristem genellikle sahne altı ila yedi kadar eski çiçekler kaldırıldığında maruz kalır. Ve çekim apikal meristem görünür olana kadar her çiçek tomurcuk aşağı itmek için forseps kullanın.En kısa sürede ateş apikal meristem maruz kalmaktadır, sadece orta yüzeyin üzerinde maruz ateş apikal meristem ile bir etanol sterilize dikdörtgen plastik menteşeli kültür kutusunda büyüme orta taze diseksiyon örnek sağlar. Kültür kutusunun kenarlarına birkaç damla steril deiyonize su ekleyin ve kutunun içindeki nemi korumak için kapağı kapatın. Mikropore bandı ile kutuyu sarın ve büyüme kutusunu 12 ila 24 saat boyunca 22 santigrat derecede uzun veya sürekli gün koşullarında yerleştirin.Bitki diseksiyon prosedüründen kurtulduğunda, numuneyi steril deiyonize suyla kaplayın ve diseksiyon mikroskobu altında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Kültür kutusunu dik bir konfokal mikroskop aşamasına aktarın ve 40 veya 60X su daldırma lensini seçin. Suya amacı düşürün ve nesnenin ön lens üzerinde hava kabarcıkları kontrol edin.Kabarcıkları çıkarmak için, sahneyi düşürün ve optik bir doku ile merceği nazikçe silin. Daha sonra pasteur pipetini kullanarak objektifi suya yeniden batırmadan önce hedefin ön merceğine küçük bir hacim su ekleyin. Ardından, örneği bulmak için XY denetleyicisini ayarlamak için konfokal mikroskobun GFP filtresini ve epi-aydınlatma modülünü kullanın.Okülerin konumunu ayarlayın, ateş apikal meristem'i doğrudan ışık kaynağının altına yerleştirin ve apeks bulunana kadar Z ekseni boyunca odaklanın. Örneği aydınlatmak için heyecan verici GFP özelliğine sahip bir lazer kullanın ve mikroskobun optik zumuna uyum, böylece tüm çekim apikal meristem ve sahne bir çiçek primordia görüş alanında bulunmaktadır. Ardından, gürültü oranına en uygun sinyali almak için lazer çıkışının gücünü ve kazanç ayarlarını ayarlayın.Numunenin iki ila beş dakika yada yerleşmesine izin vererek, yaklaşık 0,3 mikro metre piksel boyutu çözünürlüğü ekleyerek, numunenin 0,25 ila 0,5 mikrometre Z dilim aralıklarında konfokal Z yığınlarını elde edin. Satın alma sonunda, hemen su kaldırmak ve büyüme odasına geri kültür kutusu aktarın. Mikromekanik Shoot Apikal Meristem Perturbation için, kortikal mikrotübül organizasyonunun ablasyon öncesi görüntü yığınlarını az önce gösterildiği gibi edinin ve kültür kutusundan suyu bir kültür yemeğine dönüştürün.Bir diseksiyon mikroskobu altında ateş apikal meristem aktarın ve yavaş yavaş temiz bir 0.4 tarafından 20 milimetre şırınga iğne ile ateş apikal meristem yaklaştı. Ablasyonun tamamlandığını doğrulamak için çekim apical meristem'in kubbesinin çevresine iğne ucu ile kısaca başvurun. Ve steril deiyonize su ile kültür çanak doldurun.Sonra çanak propidium iyodür mililitre başına 10 mikrogram ekleyin ve hemen altı saat boyunca her iki saatte bir gösterildiği gibi görüntü yığınları elde, her zaman noktası arasında kuluçka için kültür çanak dönen. Veri analizi için, uygun bir görüntü analizi yazılım programı kullanarak görüntü yığınlarının yüzey projeksiyonlarını oluşturun ve Fiji'deki Fibril Tool Macro'yu kullanarak kortikal mikrotübül anizotropisinin çıkarılmasını gerçekleştirin. Burada, dağınık kortikal mikrotübüller içeren kubbenin merkezindeki hücrelerle mikrotübül bağlama etki alanı GFP çizgileri, çevredeki hücreler, hücrenin uzun eksenine paralel hizalanmış kortikal mikrotübüller içeren çevresel dağılım ve sınır etki alanı hücreleri ile elde edilen tipik projeksiyon görüntüleri gözlemlenebilir.Hızlandırılmış görüntüleme, kortikal mikrotübül hizalamanın çok düzensiz bir diziden ablasyondan sonraki altı saat içinde daha organize bir diziye değiştiğini gösteriyor. Tensörler kortikal mikrotübül görüntüleriüzerine üst üste bindirilebilir ve çıkarılan bilgiler zaman içinde ortalama anizotropi çizilerek temsil edilebilir. Lazer çıkış gücü ve kazanç ayarlarını ayarlarken, filamentlerin net bir şekilde gözlemlendiğinden emin olmalı ve aşırı maruz kalmaktan kaçınmaya çalışmalıyız, çünkü doymuş sinyaller insaedilen sinyaller daha sonraki analizlerde çekme yönünü saptırabilir.Atomik kuvvet mikroskobu da mekanik kuvvetlerdeki değişikliklerin hücre duvarının fiziksel durumunu nasıl etkilediğini değerlendirmek için de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...