Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

ودعمت المنح التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني للصحة): R37-NS094804، R01-NS105556، R21-NS107894 إلى M.G.C.؛ (المعاهد القومية الوطنية للصحة / NINDS) المنح R01-NS076991، R01-NS096756، R01-NS082311 إلى P.R.L.; (المعاهد القومية الوطنية للصحة/المعهد الوطني للبناء القومي): R01-EB022563؛ (المعاهد القومية للصحة/NCI) U01CA224160; قسم جراحة الأعصاب، مركز روجل للسرطان في جامعة ميشيغان، مؤسسة تشادترو، ومؤسسة ليا قلوب سعيدة إلى M.G.C. و P.R.L. الحمض النووي الريبي منحة الطب الحيوي F046166 إلى المعاهد الوطنية للصحة M.G.C. ، UL1 TR002240 لمعهد ميشيغان للبحوث السريرية والصحية (MICHR)، بعد الدكتوراه برنامج علماء الترجمة (PTSP) منحة، مشروع F049768 إلى جامعة ميشيغان فوربس معهد أبحاث السرطان، وجائزة الطبيب والعالم من البحوث لمنع العمى، وشركة (RPB)، منحة R01 EY022633 من NEI من المعاهد القومية للصحة (AK)، ومنحة غير مقيدة من RPB إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية. استخدم هذا البحث نواة أبحاث الرؤية (P30 EY007003) ، ونواة أبحاث مركز السرطان (P30 CA046592). ويدعم AK من قبل السيدة وليام ديفيدسون جائزة الباحث الناشئة من معهد أ. ألفريد تاوبمان للبحوث الطبية.

وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات (IACUC) التابعة لجامعة ميشيغان على جميع الطرق الموصوفة هنا التي تستخدم الحيوانات التجريبية.
ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا العصبية الدبقي المتولدة من خطوط GEMM أو مستقرة لتطعيم الورم داخل الجمجمة في الفئران10 ومع?...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدم تجانس الورم الدبقي والغزو ذات أهمية حاسمة للكشف عن الأهداف العلاجية الجديدة13. في هذه المخطوطة، نصف طريقة مفصلة ومحسنة لتحليل المشهد الجزيئي لعدم تجانس الورم الدبقي والغزو باستخدام المجهر التقاط الليزر (LMD) يليه تحليل النسخ.
<p class="jove_conte...

الأورام الدبقية هي الأورام الأولية الأكثر عدوانية في الجهاز العصبي المركزي. فهي شديدة التوغل وغير متجانسة1. تحليل المكونات الخلوية والجزيئية للورم سوف تكشف عن أهداف علاجية جديدة.
من بين الطرق المختلفة المتاحة حاليا، ليزر التقاط microdissection (LMD) من أنسجة ورم الدماغ المجمدة هو تقنية فعالة من حيث التكلفة، موثوق بها التي تسمح لعزل المناطق التشريحية منفصلة أو مجموعات خلايا محددة من أنسجة الورم لدراسة ملفها الجزيئي2,,3. LMD يسمح بتحليل ملامح التعبير الجيني مرنا من خلايا واحدة مختارة أو هياكل متعددة الخلايا4,5. يمكن استخدام LMD لاكتساب معرفة ميكانيكية متعمقة حول الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء تطور الورم. تحسين في معالجة أنسجة الورم ضروري للحصول على الدقة البصرية المثلى لمورفولوجيا الأنسجة وRNA-الجودة6. على الرغم من أن تثبيت بارافورمالديهايد هو الخيار الأفضل للتحليل المورفولوجي ، تتأثر جودة الحمض النووي الريبي وتتدهور في ظل هذه الظروف ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الحمض النووي الريبي لتحليل RNA-seq. استخدام أقسام الأنسجة المجمدة يتجنب تكوين الكريستال الجليد، والتي يمكن أن تكسر أغشية الخلايا وتنتج ثقوب داخل الخلايا، ويبقى الخيار الأفضل لتحليل الحمض النووي الريبي-Seq7.
هنا، ونحن نصف تثبيت قسم الأمثل وطريقة تلطيخ لمعالجة الأنسجة المجمدة ورم الدماغ الماوس لLMD. لمنع بلورات الثلج من تشكيل في الأنسجة، ونحن perpering الفئران مع حل من السكروز 30٪. هذا الحل يعطل التفاعلات بين جزيئات الماء القطبي ويمنع تشكيل بلورات الجليد، والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. تلطيخ الأنسجة ضروري للتمييز والحصول على مجموعة محددة من الخلايا أو مناطق متميزة تشريحيا داخل الورم. من الضروري إصلاح ووصمة عار الأنسجة مع الأصباغ حميدة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وقد ثبت سابقا أن تلطيخ الأنسجة مع الهيماتوكسيلين / إيوسين (H & E) يتدهور سلامة الحمض النووي الريبي8. قمنا بإصلاح وتلطيخ الأنسجة ذات الأهمية مع الإيثانول، كريسيلي البنفسجي 4٪ وإيوسين Y 0.5٪ حلول. كريسل البنفسجي هو صبغة حمضية تلطخ نواة الخلية بلون أزرق داكن. إيوسين Y هو صبغة بازوفيلية تلطخ المكونات الأساسية للخلايا ، مما يوفر التمييز بين السيتوبلازم والهياكل الخلوية الأخرى8. كلا الأصباغ قابلة للذوبان في الإيثانول ولا تتدهور نوعية الحمض النووي الريبي. لتجنب تلف الأنسجة والحفاظ على دقة بصرية عالية من الهياكل الخلوية ، قمنا بتركيب أقسام الأنسجة قبل LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

الأورام الدبقية هي أورام الدماغ الأولية التي تتميز الغازية وعدم التجانس. أنماط النسيج محددة مثل pseudopalisades، وانتشار الأوعية الدموية الدقيقة، والتحول mesenchymal ونخر تميز عدم التجانس النسيجي من الأورام الدبقية عالية الجودة. وقد أثبت مختبرنا أن وجود كثافات عالية من الخلايا الميسنشيمال، واسمه oncostreams، يرتبط مع ورم خبيث. لقد طورنا نهجًا فريدًا لفهم الآليات التي يقوم عليها نمو الورم الدبقي وغزوه. هنا، نحن نصف بروتوكول شامل يستخدم الليزر التقاط microdissection (LMD) وتسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير mRNA التفاضلية من الهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة داخل الورم (أي المناطق mesenchymal أو مناطق غزو الورم). تحافظ هذه الطريقة على أنسجة جيدة وسلامة الحمض النووي الريبي. تم تحسين التبرّق والتجميد والتضمين والأقسام وتلطيخ الخلايا للحفاظ على المورفولوجيا والحصول على عينات ميكرودية ليزر عالية الجودة. تشير النتائج إلى أن توبر الفئران التي تحمل الورم الدبقي باستخدام السكروز بنسبة 30٪ يوفر مورفولوجيا جيدة وجودة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي تلطيخ أقسام الورم مع 4٪ كريسيلي بنفسجي و0.5٪ من الإيوسين إلى تلطيخ نووي وخلوي جيد، مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. الطريقة الموصوفة حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية ويمكن استخدامها لدراسة مورفولوجيا الورم في نماذج الأورام المختلفة. باختصار، نحن نصف طريقة كاملة لأداء LMD التي تحافظ على مورفولوجيا وRNA الجودة لتسلسل لدراسة السمات الجزيئية للهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة داخل الأورام الصلبة.

وقد ولدت مختبرنا نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) باستخدام نظام transposase الجمال النائم(الشكل 1A). يتضمن هذا النظام تعديلات وراثية محددة في جينوم الخلايا السلف العصبي في الفئران الوليدية. تشكل هذه الخلايا السلف المعدلة أورام الورم الدبقي الذاتي. وك...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

الليزر المجهري (LMD) هو تقنية حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية التي يمكن استخدامها للكشف عن المسارات التي تتوسط عدم تجانس الورم الدبقي والغزو. هنا، نحن نصف بروتوكول الأمثل لعزل المناطق المنفصلة من أنسجة الورم الدبقي باستخدام الليزر LMD تليها تحليل النسخ.

الليزر التقاط Microdissection من المناطق دون الإقليمية ديوموما للتوصيف المكاني والجزيئي للتغاير داخل الورم، Oncostreams، والغزو

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

يستخدم هذا البروتوكول ميكروديساكشن الليزري وتسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير التفاضلي للرنا عن التغايرية داخل الذاكرة، مثل مناطق تراكم الخلايا الليسنيمالية أو مناطق غزو الورم. وقد تم تحسين هذه الطريقة للحفاظ على نوعية جيدة الأنسجة الأنسجة وسلامة الحمض النووي الريبي لتسهيل الحصول على عينات ميكروديسكشن الليزر عالية الجودة. هذا الأسلوب حساس و إعادة إنتاج عالية.ويمكن استخدامه لدراسة مورفولوجيا الورم وعدم تجانس في نماذج مختلفة من الأورام. مجهرية الليزر من أنسجة ورم الدماغ المجمدة هي تقنية فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها لعزل المناطق التشريحية المنفصلة من مجموعات الخلايا من أنسجة الورم لدراسة ملفاتهم الجزيئية. يمكن استخدام LMD للحصول على معرفة ميكانيكية متعمقة حول الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء تطور الورم ، ويمكن أن تكشف عن أهداف علاجية جديدة.في التخمة الحيوية في الجسم الحي من عبء ورم الماوس تصل إلى إشارة بين مرة واحدة 10 إلى 6 و 10 مرات واحدة إلى الفوتونات 7. تدفق حل تيرودي أكسجين من خلال نظام الدورة الدموية من الماوس تحمل الورم القتل الرحيم حتى تم تطهير الكبد والرئتين تماما من الدم. مواصلة perfusing الحيوان مع 30٪ محلول السكروز حل في حل التيرود لمدة 15 دقيقة إضافية.لتقييم نجاح الضخ ، تأكد من أن الرقبة والذيل والساقين جامدة في نهاية الدورة الدموية. ثم حصاد الدماغ وفقا للبروتوكولات القياسية وتخزين الدماغ بين عشية وضحاها في حل السكروز 30٪. للتحضير للتبريد، وملء جرة مع isopentane الباردة-2-ميثيلبوتان ووضع جرة في وعاء مملوءة النيتروجين السائل.في حين أن المذيب هو تقشعر لها الأبدان، لطخة الدماغ الجافة على قطعة من ورقة التصفية ووضع الدماغ في Cryomold المسمى. بعناية في حوالي خمسة ملليلتر من درجة الحرارة المثلى قطع المتوسطة إلى مركز Cryomold ووضع الدماغ في القالب في الاتجاه المطلوب. باستخدام ملقط نظيفة، ضع بسرعة Cryomold في إيسوبينتان-2-ميثيلبوتان المبرد لمدة 30 إلى 40 ثانية.مرة واحدة وقد توطدت المتوسطة القطع، ونقل Cryomold على الجليد الجاف والتفاف Cryomold وانجذاب أنسجة الدماغ المجمدة في رقائق الألومنيوم للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. للحصول على أقسام أنسجة ورم الدماغ المجمدة ، قم أولاً بتعيين درجة حرارة التبريد بين ناقص 20 ونيقص 24 درجة مئوية ، ووضع كتلة العينة في غرفة التبريد لمدة 30 إلى 60 دقيقة. في حين أن العينة هو اكويريبراتينغ، وتنظيف الغرفة وحامل سكين مع 100٪ الإيثانول ورش فرش المقطع مع RNase محلول التنظيف.عندما تكون العينة جاهزة، قم بإزالة القالب واستخدم وسيلة قطع جديدة لإرفاق كتلة الأنسجة المجمدة على قرص العينة في cryostat. ضع الكتلة في حامل القرص ومحاذاة الكتلة مع شفرة السكين. الحصول على 10 أقسام ميكرومتر من الدماغ باستخدام واحدة من فرش Rnase خالية من لتسطيح بعناية وفك قطع الأنسجة على سطح القطع.لتركيب أقسام أنسجة الدماغ على الشرائح، اضغط بسلاسة على الجانب المشحون بشكل إيجابي من شريحة زجاجية PEN الخالية من RNase على القسم ووضع الشريحة في مربع تخزين داخل الغرفة. عندما يتم تجميع كافة الشرائح، ضع مربع التخزين عند ناقص 80 درجة مئوية. لإذابة وسيطة القطع قبل تشريح الليزر الجزئي، غمر الشرائح في 30 ثانية متتابعة تنازلية الإيثانول الغمر متبوعة حل البنفسجي الكريستال تلطيخ لمدة 20 ثانية وخمس ثوان في 0.5٪ محلول إيوسين Y.في نهاية حاضنة eosin Y، استخدم ورق التصفية لمنع الشرائح الجافة وتجفيف الشرائح في غمرات الإيثانول التصاعدية المتتابعة. بعد غمر الإيثانول لمدة 60 ثانية، شطف الشرائح في حاوية من الزيلين لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بتجفيف الشرائح على سطح خال من RNase في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوانٍ قبل تركيب العينات في وسط التركيب المعد مع مياه خالية من RNase.بعد 10 إلى 20 ثانية، قم بنقل الشرائح إلى منصة ميكروديستيكشن المجهر. لالتقاط الليزر microdissection، تشغيل الطاقة قبل تشغيل الليزر. المقبل، بدوره على وحدة تحكم المجهر في الكمبيوتر وبدء برنامج التقاط الليزر microdissection.في لوحة التحكم بالمجهر، حدد التكبير 10 مرات. تحت التحكم الليزر، تعيين المعلمات الليزر لتشريح الأنسجة وحدد تردد ليزر من 120 هرتز وتيار ليزر من 100٪ ل الدقيقة microdissection الليزر، تعيين السرعة إلى 10 وتعيين الفتحة إلى 10 ميكرومتر. ثم تعيين السلطة إلى 53.تحميل جامع الأنسجة التي سوف القبض على الأنسجة التالية للقسم وانقر فوق زر التفريغ الثاني. استبدال جامع فارغة مع DNase و رناز خالية من 0.5 ملليلتر PCR أنابيب مسطحة الرأس تحتوي على 30 ميكرولترات من عازلة تحلل لكل أنبوب. ارجع جامع إلى الجهاز وانقر فوق متابعة المتابعة.تحميل العينة المجهزة على المجهر وانقر فوق إفراغ في برنامج microdissection الليزر. حتى العينة على حامل الشريحة ووضع حامل الشريحة على المسرح. انقر فوق متابعة للمتابعة وحدد رسم قص في إطار قص الأشكال.استخدام الضوابط المجهر للعثور على منطقة الاهتمام ورسم مخطط حول المنطقة من الاهتمام. ثم حدد أنبوب جامع الوجهة وانقر فوق ابدأ قص للمضي قدما microdissection الأنسجة. عندما تم تشريح جميع المناطق ذات الاهتمام، نقل أنابيب جامع من حامل على الجليد الجاف حتى انهم معالجة المصب.للحصول على الأنسجة مع مورفولوجيا متفوقة وسلامة الحمض النووي الريبي، تم تقييم مختلف النهج في التسريب. لتشريح المناطق ذات الاهتمام ، فمن الضروري وصمة عار الأنسجة مع الأصباغ غير ضارة للرنا. في وقت لاحق من الغشاء العصبي للورم الفئران مع حل التيرود و 30 ٪ سكروز تليها حضانة بين عشية وضحاها في 30 ٪ من السكروز النتائج في الحفاظ على مورفولوجيا وسلامة الحمض النووي الريبي من أنسجة الماوس.على الرغم من أن تثبيت الأنسجة شبه الشكلية يؤدي إلى مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة، تتأثر سلامة الحمض النووي الريبي سلبا. لا تؤثر الأساليب الأخرى مثل استخدام حضانة حل التيرود، أو حل التيرود بالإضافة إلى 30٪ من حضانات محلول السكروز على جودة الحمض النووي الريبي ، ولكن يتم ملاحظة دقة مخفضة في مورفولوجيا الأنسجة. إذا لم يتم تركيب الأنسجة مع تصاعد المتوسطة، وتصبح أقسام المجففة والمرفرفات يتدهور في حين تصاعد عينات الأنسجة مع 15٪ تصاعد المتوسطة الذائبة في الماء يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة ذات جودة عالية.الليزر التقاط microdissection المجهر التصوير يسمح اختيار أنسجة الورم لتشريح. هذه المنطقة من اختيار الفائدة ثم يسمح تشريح المناطق ذات الاهتمام داخل كل عينة الأنسجة لتحليل سلامة الحمض النووي الريبي. الحفاظ على وجودة عالية مورفولوجيا الأنسجة الورم وسلامة الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية.حل التيرود و 30٪ السكروز perfusion مع الحفاظ بين عشية وضحاها في 30٪ السكروز يحسن بشكل كبير مورفولوجيا الأنسجة لLMD. تثبيت سريع للووما، تلطيخ وتركيب مع حل GAN هو خطوة حاسمة للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي ومنع الشقوق من تشكيل داخل الأنسجة. نوصي بالقطعة على الأقل 2.5 مرة 10 إلى 6 ميكرومتر مربع مجموع الورم لكل منطقة الأنسجة للحصول على كميات مناسبة من RNA لمراقبة الجودة RNA وتحليل النسخ.LMD تمكن من تحليل مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم عدم تجانس الورم الدبقي والغزو الذي يمكن أن يكشف عن أهداف جديدة محتملة للتنمية الانتقالية في المستقبل في نماذج الورم الدبقي قبل الكلينيكي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

القبض على الليزر Microdissection ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

الخلايا العصبية الشمية التي يتم الحصول عليها من خلال الأنف خزعة جنبا إلى جنب مع الليزر والتقاط تسليخ مجهري: نهج المحتملين لدراسة الاستجابة للعلاج في اضطرابات العقلية

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

ميكروديسيكشن التقاط المناظير باستخدام الأشعة الليزر الموجهة بأطلس الدماغ المناطق المتأثرة بالإصابات الرضية

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

بروتوكول غير القابل للصدأ لعزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الليزر التقاط خلايا ميكروديسيكتيد بوركنجي في المخيخ تشريح الإنسان

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...