Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Arbejdet blev støttet af National Institutes of Health, (NIH/NINDS) Tilskud: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 til M.G.C.; (NIH/NINDS) Tilskud R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 til P.R.L. (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Institut for Neurokirurgi, Rogel Cancer Center ved University of Michigan, ChadTough Foundation, og Leah's Happy Hearts Foundation til M.G.C. og P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 til M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) tilskud, Projekt F049768 til AC University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, en læge-Scientist Award fra Forskning for at forebygge blindhed, Inc. (RPB), tilskud R01 EY022633 fra NEI af NIH (AK), og en ubegrænset tilskud fra RPB til Institut for Oftalmologi og Visual Sciences. Denne forskning udnyttede Vision Research Core (P30 EY007003), og Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK er støttet af Mrs William Davidson Emerging Scholar Award fra A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

Alle metoder, der er beskrevet her, at bruge forsøgsdyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Michigan.
BEMÆRK: Gliomneurosfærer genereret fra en GEMM eller stabile linjer kan bruges til intrakraniel tumor engraftment i mus10 og behandles for LMD og RNA sekventering. Disse celler konstituerende udtrykke firefly luciferase og GFP proteiner, som vil blive yderligere udnyttet til tumorvækst analyse og lokalisering.<...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for gliom heterogenitet og invasion, er af afgørende betydning for at afdække nye terapeutiske mål13. I dette manuskript beskriver vi en detaljeret og optimeret metode til at analysere det molekylære landskab af gliom heterogenitet og invasion ved hjælp af laser capture microdissection (LMD) efterfulgt af transskriptionsanalyse.
Laser capture microdissection (LMD) kan bruges til at identificere forskell...

Gliomer er de mest aggressive primære tumorer i centralnervesystemet. De er meget invasive og heterogene1. Analyse af cellulære og molekylære komponenter af tumoren vil afsløre nye terapeutiske mål.
Blandt forskellige metoder i øjeblikket til rådighed, laser capture microdissection (LMD) af frosne hjernetumor væv er en omkostningseffektiv, pålidelig teknik, der gør det muligt at isolation af diskrete anatomiske områder eller specifikke cellepopulationer fra tumorvæv til at studere deres molekylære profil2,3. LMD gør det muligt at analysere mRNA-genekspressionsprofiler for udvalgte enkeltceller eller flercellede strukturer4,5. LMD kan udnyttes til at få dybdegående mekanistisk viden om de molekylære begivenheder, der finder sted under tumorprogression. Forbedring i behandlingen af tumorvæv er nødvendig for at opnå optimal optisk opløsning af vævmorfologi og RNA-kvalitet6. Selvom paraformaldehydfiksering er den bedste løsning til morfologisk analyse, påvirkes RNA-kvaliteten og nedbrydes under disse forhold, hvilket resulterer i dårlig RNA-kvalitet til RNA-seq-analyse. Brugen af frosne vævssektioner undgår iskrystaldannelse, som kan bryde cellemembraner og producere huller i cellerne, og forbliver den bedste løsning for RNA-Seq-analyse7.
Her beskriver vi en optimeret sektion fiksering og farvning metode til at behandle frosne mus hjernetumor væv til LMD. For at forhindre iskrystaller i at danne i vævet, perfunderes vi mus med en opløsning på 30% saccharose. Denne løsning forstyrrer samspillet mellem polarvandmolekyler og forhindrer dannelsen af iskrystaller, bevare væv morfologi. Væv farvning er nødvendig for at differentiere og opnå specifikke population af celler eller anatomisk adskilte områder inden for tumoren. Det er vigtigt at fastsætte og plette vævet med uskadelige farvestoffer for at opretholde RNA-integritet. Det har tidligere været påvist, at farvningsvæv med hæmatoxylin/eosin (H&E) forringer RNA-integritet8. Vi fast og farves væv af interesse med ethanol, Cresyl violet 4% og eosin Y 0,5% opløsninger. Cresyl violet er en acidophilic farvestof, pletter cellekernen med en mørkeblå farve. Eosin Y er en basofile farvestof, pletter grundlæggende komponenter i cellerne, giver en sondring mellem cytoplasma og andre cellulære strukturer8. Begge farvestoffer er opløselige i ethanol og forringer ikke RNA-kvaliteten. For at undgå vævsskader og opretholde en høj optisk opløsning af de cellulære strukturer monterede vi vævssektionerne før LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliomer er primære hjernetumorer karakteriseret ved deres invasiv og heterogenitet. Specifikke histologiske mønstre såsom pseudopalisader, mikrovaskulær spredning, mesenkymale transformation og nekrose karakteriserer den histologiske heterogenitet af højkvalitet gliomer. Vores laboratorium har vist, at tilstedeværelsen af høje tætheder af mesenkymale celler, navngivet oncostreams, korrelerer med tumor malignitet. Vi har udviklet en unik tilgang til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for gliomas vækst og invasion. Her beskriver vi en omfattende protokol, der udnytter laser capture microdissection (LMD) og RNA sekventering til at analysere differentialmRNA udtryk for intra-tumorheterogene multicellulære strukturer (dvs. mesenkymale områder eller områder af tumor invasion). Denne metode opretholder god væv histologi og RNA integritet. Perfusion, frysning, indlejring, skæring og farvning blev optimeret til at bevare morfologi og opnå høj kvalitet laser mikrodissektion prøver. Resultaterne viser, at perfusion af gliombærende mus ved hjælp af 30% saccharose giver god morfologi og RNA-kvalitet. Desuden, farvning tumor sektioner med 4% Cresyl violet og 0,5% eosin resulterer i god nuklear og cellulære farvning, samtidig med at RNA integritet. Den beskrevne metode er følsom og meget reproducerbar, og det kan udnyttes til at studere tumor morfologi i forskellige tumor modeller. Sammenfattende beskriver vi en komplet metode til at udføre LMD, der bevarer morfologi og RNA-kvalitet til sekventering for at studere de molekylære træk ved heterogene flercellede strukturer inden for solide tumorer.

Vores laboratorium har genereret en genetisk manipuleret mus modeller (GEMM' er) ved hjælp af sovende skønhed transposase system (Figur 1A). Dette system indeholder specifikke genetiske ændringer i genomet af neurale progenitor celler i neonatal mus. Disse ændrede stamdømmeceller danner endogene gliomtumorer. Plasmid sekvenser bruges til at generere tumorer var: (1) pT2C-LucPGK-SB100X for Sleeping Beauty transposon & luciferase udtryk, (...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Laser microdissection (LMD) er en følsom og meget reproducerbar teknik, der kan bruges til at afdække veje, der mægle gliom heterogenitet og invasion. Her beskriver vi en optimeret protokol til at isolere diskrete områder fra gliomvæv ved hjælp af laser LMD efterfulgt af transskriptionsanalyse.

Laser Capture Microdissection af Glioma subregions for rumlige og molekylære karakterisering af intratumoral heterogenitet, Oncostreams, og Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Denne protokol bruger laser mikrodissektion og RNA sekventering til at analysere differentialmRNA udtryk for intratumor heterogenitet, såsom områder af ophobning af mesenkymale celler eller områder af tumor invasion. Denne metode er blevet optimeret til at bevare god kvalitet væv histologi og RNA integritet for at lette erhvervelsen af høj kvalitet laser mikrodissektion prøver. Denne metode er følsom og meget reproducerbar.Det kan udnyttes til at studere tumor morfologi og heterogenitet i forskellige tumormodeller. Laser mikrodissektion af frosne hjernetumorvæv er en omkostningseffektiv, pålidelig teknik til isolering af diskrete anatomiske områder af cellepopulationer fra tumorvæv til at studere deres molekylære profiler. LMD kan udnyttes til at få dybdegående mekanistisk viden om de molekylære begivenheder, der finder sted under tumor progression, og kunne afsløre nye terapeutiske mål.En in vivo bioluminescens af musen tumor byrde når et signal mellem en gange 10 til de seks og en gange 10 til 7th fotoner. Flush iltet tyrode løsning gennem kredsløbet af aflivede tumor-bærende mus, indtil leveren og lungerne er blevet fuldstændig ryddet for blod. Dyret fortsættes med 30 % saccharoseopløsning opløst i tyrodeopløsning i yderligere 15 minutter.For at vurdere succes perfusion, bekræfte, at hals, hale og ben er stive i slutningen af cirkulationen. Derefter høste hjernen i henhold til standard protokoller og gemme hjernen natten over i frisk 30% saccharose løsning. For at forberede kryopræservering, fylde en krukke med kold isopentan-2-methylbutan og placere krukken i en beholder fyldt med flydende nitrogen.Mens opløsningsmidlet er nedkøling, skamplet hjernen tør på et stykke filterpapir og placere hjernen i en mærket Cryomold. Forsigtigt ved ca. fem milliliter optimal temperaturskæremed til midten af Cryomold og placer hjernen i formen i den ønskede orientering. Brug rene vicesser, hurtigt placere Cryomold i den kølede isopentan-2-methylbutan i 30 til 40 sekunder.Når skæremediet er størknet, overføres Cryomold til tøris og pak Kryosolret og fastgør frosset hjernevæv i aluminiumsfolie til minus 80 grader Celsius opbevaring. For at erhverve frosne hjernetumor væv sektioner, først indstille temperaturen af en kryostat mellem minus 20 og minus 24 grader Celsius, og placere prøven blok i kryostat kammer i 30 til 60 minutter. Mens prøven er ligevægt, rengøres kammeret og knivholderen med 100%ethanol, og sektionsbørsterne sprøjtes med RNase-rengøringsopløsning.Når prøven er klar, skal formen fjernes, og der anvendes et friskt skæremedium til at fastgøre den frosne vævsblok til kryostatens prøveskive. Anvend blokken i skiveholderen, og sæt blokken på linje med knivbladet. Erhverve 10 mikrometer dele af hjernen ved hjælp af en af de Rnase-fri børster til omhyggeligt flade og uncurl væv stykker på skærefladen.For at montere hjernevævssektionerne på objektglassene skal du trykke jævnt på den positivt ladede side af et mærket RNase-frit PEN-glasrør på sektionen og placere diaset i en opbevaringsboks inde i kammeret. Når alle objektglassene er indsamlet, skal opbevaringsboksen opbevares på minus 80 grader Celsius. For at opløse skæremediet før lasermikrodissektion nedsænkes diasene i 30 sekunder sekventiel faldende ethanolnedsænkning efterfulgt af krystal violet opløsning farvning i 20 sekunder og fem sekunder i 0,5% eosin Y opløsning.I slutningen af eosin Y inkubationen, skal du bruge filterpapir til at blokere dias tørre og dehydrere dias i sekventielle stigende ethanol nedsænkning. Efter 60-sekunders ethanol nedsænkning skylles objektglassene i en beholder med xylen i tre minutter. Dernæst tørres objektglassene på RNase-fri overflade ved stuetemperatur i 10 sekunder, før prøverne monteres i monteringsmedium, der er forberedt med RNase-frit vand.Efter 10 til 20 sekunder overføres diasene til mikroskopmikroskopplatformen. Hvis du vil have mikrodissektion af laseropsamling, skal du tænde for strømmen, før du tænder for laseren. Tænd derefter for mikroskopcontrolleren i computeren, og start laserfangstmikrodissektionssoftwaren.Vælg forstørrelsen på 10 gange i panelet Mikroskopkontrol. Under Laser Control skal du indstille laserparametrene for vævsdissektion og vælge en laserfrekvens på 120 hertz og en laserstrøm på 100% For nøjagtig lasermikrodissektion skal du indstille hastigheden til 10 og indstille blænden til 10 mikrometer. Sæt derefter strømmen til 53.Læg vævsamleren, der fanger vævet efter sektionen, og klik på den anden aflæsseknap. Den tomme opsamler er erstattet med DNase og Rnase-fri 0,5 milliliter PCR flatheadrør indeholdende 30 mikroliter lysisbuffer pr. rør. Returner samleren til maskinen, og klik fortsat på at fortsætte.Læg den behandlede prøve på mikroskopet, og klik på Aflæs i lasermikrodissektionssoftwaren. Prøven op på skydeholderen og sæt lysdiasholderen på scenen. Klik på Fortsæt for at fortsætte, og vælg Tegn klip i vinduet Klip figurer.Brug mikroskopkontrolpkontrolelementerne til at finde interesseområdet og tegne en skitse rundt om interesseområdet. Vælg derefter et destinationssamlerrør, og klik på Start klip for at fortsætte vævsmikrodissektionen. Når alle de områder af interesse er blevet dissekeret, overføres opsamlerrørene fra indehaveren til tøris, indtil de er under nedstrøms.For at erhverve væv med en overlegen morfologi og RNA-integritet blev forskellige perfusionsmetoder evalueret. For at dissekere de områder af interesse, er det nødvendigt at plette væv med harmløse farvestoffer til RNA. Den efterfølgende perfusion af tumorbærende mus med tyrodeopløsning og 30% saccharose efterfulgt af en overnight inkubation i 30% saccharose resulterer i bevarelsen af morfologi og RNA integritet af musevævet.Selvom paraformaldehyd vævsfiksering resulterer i en vævsmorfologi af høj kvalitet, påvirkes RNA-integriteten negativt. Andre tilgange såsom brug af en tyrodeopløsnings inkubation eller tyrodeopløsning plus 30% saccharoseopløsnings inkubationer påvirker ikke RNA-kvaliteten, men der observeres en reduceret opløsning i vævsmorfologien. Hvis vævet ikke er monteret med monteringsmedium, bliver sektionerne dehydreret, og morfologien forringes, mens monteringen af vævsprøverne med 15% monteringsmedium opløst i vand opretholder en vævsmorfologi af høj kvalitet.Laser fange mikrodissektion mikroskop billeddannelse giver mulighed for udvælgelse af tumorvæv til dissektion. Denne region af interesse udvælgelse derefter tillader dissektion af områder af interesse inden for hver vævsprøve for RNA integritet analyse. Fastholdelse af en høj kvalitet tumorvæv morfologi og RNA integritet er kritisk.Tyrode opløsning og 30% saccharose perfusion med natten konservering i 30% saccharose væsentligt forbedrer væv morfologi for LMD. Hurtig lyomafiksering, farvning og montering med GAN-opløsning er afgørende skridt til at bevare RNA-kvaliteten og forhindre revner i at danne sig i vævet. Vi anbefaler, at du afsnitter mindst 2,5 gange 10 til det 6.LMD gør det muligt at analysere de molekylære signalveje, der regulerer gliom heterogenitet og invasion, som kan afsløre nye potentielle mål for fremtidig translationel udvikling i prækliniske gliommodeller.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Ikke-Laser Capture Mikroskopi Tilgang til mikrodissektion af diskrete Mouse Brain Regioner for Total RNA Isolation og downstream næste generation sekventering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodissektion af beriget populationer af neuroner eller enkelte neuroner til genekspression analyse efter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture mikrodissektion af neuroner fra differentierede humane Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion af RNA til transskriptionsanalyse fra Mus Rygmarv Motor Neuron Cell Organer ved Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Olfaktoriske Neuroner opnået ved nasal biopsi Kombineret med Laser-Capture mikrodissektion: En Potentiel tilgang til Uddannelse behandlingsrespons i Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodissektion - en demonstration af Isolering af Individual dopaminneuroner og hele Ventral tegmentalområde

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactic Atlas-styrede Laser fange Microdissection af hjerneregioner ramt af traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimering af Laser-Capture Microdissection til isolering af entero ganglier fra frisk frosset menneskeligt væv

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

En rustfri protokol for høj kvalitet RNA isolering fra Laser fange Microdissected Purkinje celler i den menneskelige Post Mortem lillehjernen

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...