Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Het werk werd ondersteund door national institutes of health, (NIH/NINDS) Subsidies: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 naar M.G.C.; (NIH/NINDS) Subsidies R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 aan P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; het Department of Neurosurgery, Rogel Cancer Center aan de Universiteit van Michigan, ChadTough Foundation, en Leah's Happy Hearts Foundation naar M.G.C. en P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 aan M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 voor Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) grant, Project F049768 aan A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, een Physician-Scientist Award van Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), grant R01 EY022633 from the NEI of the NIH (AK), and a unrestricted grant from RPB to the Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Dit onderzoek maakte gebruik van de Vision Research Core (P30 EY007003) en de Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK wordt ondersteund door de Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award van het A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

Alle hier beschreven methoden die gebruik maken van proefdieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
OPMERKING: Glioma neurosferen gegenereerd uit een GEMM of stabiele lijnen kunnen worden gebruikt voor intracraniale tumor engraftment bij muizen10 en verwerkt voor LMD en RNA sequencing. Deze cellen vormen constitutief firefly luciferase en GFP eiwitten, die verder zal worden gebruikt voor tumorgr...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan glioom heterogeniteit en invasie zijn van cruciaal belang om nieuwe therapeutische doelen bloot te leggen13. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerde en geoptimaliseerde methode om het moleculaire landschap van glioom heterogeniteit en invasie te analyseren met behulp van lasercapture microdissectie (LMD), gevolgd door transcriptieanalyse.
Laser capture microdissectie (LMD) kan worden gebruikt...

Gliomen zijn de meest agressieve primaire tumoren van het centrale zenuwstelsel. Ze zijn zeer invasief en heterogeen1. Analyse van cellulaire en moleculaire componenten van de tumor zal nieuwe therapeutische doelen onthullen.
Onder verschillende methoden die momenteel beschikbaar zijn, laser capture microdissectie (LMD) van bevroren hersentumor weefsel is een kosteneffectieve, betrouwbare techniek die het mogelijk maakt de isolatie van discrete anatomische gebieden of specifieke celpopulaties van tumorweefsels om hun moleculairprofiel te bestuderen2,3. LMD maakt de analyse van mRNA-genexpressieprofielen van geselecteerde enkele cellen of meercellige structuren4,5. LMD kan worden gebruikt om diepgaande mechanistische kennis op te doen over de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens tumorprogressie. Verbetering in de verwerking van tumorweefsels is noodzakelijk om een optimale optische resolutie van weefselmorfologie en RNA-kwaliteit te verkrijgen6. Hoewel paraformaldehyde fixatie de beste optie is voor morfologische analyse, wordt de RNA-kwaliteit onder deze omstandigheden aangetast en afgebroken, wat resulteert in een slechte RNA-kwaliteit voor RNA-seq-analyse. Het gebruik van bevroren weefselsecties vermijdt ijskristalvorming, die celmembranen kan breken en gaten in cellen kan produceren, en blijft de beste optie voor RNA-Seq analyse7.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sectie fixatie en kleuring methode om bevroren muis hersentumor weefsels voor LMD te verwerken. Om te voorkomen dat ijskristallen zich in het weefsel vormen, hebben we muizen geperfundeerd met een oplossing van 30% sacharose. Deze oplossing verstoort de interacties tussen polaire watermoleculen en voorkomt de vorming van ijskristallen, waardoor de weefselmorfologie behouden blijft. Weefselkleuring is noodzakelijk om specifieke populaties cellen of anatomisch verschillende gebieden binnen de tumor te onderscheiden en te verkrijgen. Het is essentieel om het weefsel te fixeren en te bevlekken met onschadelijke kleurstoffen om de RNA-integriteit te behouden. Eerder is aangetoond dat kleurweefsel met hematoxyline/eosine (H&E) de RNA-integriteitverslechtert 8. We vasten en bevlekten het weefsel van belang met ethanol, Cresyl violet 4% en eosiny Y 0,5% oplossingen. Cresylviolet is een acidophilic kleurstof die vlekken de celkern met een donkerblauwe kleur. Eosiny Y is een basophilic kleurstof die vlekken basiscomponenten van de cellen, waardoor een onderscheid tussen cytoplasma en andere cellulaire structuren8. Beide kleurstoffen zijn oplosbaar in ethanol en verslechteren de RNA-kwaliteit niet. Om weefselschade te voorkomen en een hoge optische resolutie van de cellulaire structuren te behouden, hebben we de weefselsecties voorafgaand aan LMD9gemonteerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliomen zijn primaire hersentumoren gekenmerkt door hun invasieve en heterogeniteit. Specifieke histologische patronen zoals pseudopalissades, microvasculaire proliferatie, mesenchymale transformatie en necrose karakteriseren de histologische heterogeniteit van hoogwaardige gliomen. Ons laboratorium heeft aangetoond dat de aanwezigheid van hoge dichtheden van mesenchymale cellen, genaamd oncostreams, correleren met tumor maligniteit. We hebben een unieke aanpak ontwikkeld om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de groei en invasie van glioom. Hier beschrijven we een uitgebreid protocol dat gebruik maakt van laser capture microdissectie (LMD) en RNA sequencing om differentiële mRNA-expressie van intratumorale heterogene meercellige structuren (d.w.z. mesenchymale gebieden of gebieden van tumorinvasie) te analyseren. Deze methode handhaaft goede weefselhistologie en RNA integriteit. Perfusie, bevriezing, inbedding, doorsnede en kleuring werden geoptimaliseerd om morfologie te behouden en hoogwaardige lasermicrodissectiemonsters te verkrijgen. De resultaten geven aan dat perfusie van glioom dragende muizen met behulp van 30% sacharose een goede morfologie en RNA-kwaliteit biedt. Bovendien, kleuring tumor secties met 4% Cresyl violet en 0,5% eosine resulteert in een goede nucleaire en cellulaire kleuring, met behoud van RNA integriteit. De beschreven methode is gevoelig en zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt om tumormorfologie te bestuderen in verschillende tumormodellen. Samengevat beschrijven we een complete methode om LMD uit te voeren die morfologie en RNA-kwaliteit behoudt voor sequencing om de moleculaire kenmerken van heterogene meercellige structuren binnen vaste tumoren te bestuderen.

Ons laboratorium heeft een genetisch gemanipuleerde muis modellen (GEMMs) met behulp van de doornroosje transposase systeem (Figuur 1A). Dit systeem bevat specifieke genetische veranderingen in het genoom van neurale voorlopercellen in neonatale muizen. Deze veranderde voorlopercellen vormen endogene glioomtumoren. Plasmid sequenties gebruikt om de tumoren te genereren waren: (1) pT2C-LucPGK-SB100X voor Doornroosje transposon & luciferase exp...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Dit protocol maakt gebruik van lasermicrodissection en RNA sequencing om het differentiële mRNA-expressie van intratumor heterogeniteit te analyseren, zoals gebieden van accumulatie van mesenchymale cellen of gebieden van tumorinvasie. Deze methode is geoptimaliseerd om een goede kwaliteit weefsel histologie en RNA integriteit te behouden om de verwerving van hoge kwaliteit laser microdissection monsters te vergemakkelijken. Deze methode is gevoelig en zeer reproduceerbaar.Het kan worden gebruikt om tumormorfologie en heterogeniteit te bestuderen in verschillende tumormodellen. Laser microdissection van bevroren hersentumorweefsel is een kosteneffectieve, betrouwbare techniek voor de isolatie van discrete anatomische gebieden van celpopulaties uit tumorweefsels om hun moleculaire profielen te bestuderen. LMD kan worden gebruikt om diepgaande mechanistische kennis over de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens tumorprogressie te krijgen, en kan nieuwe therapeutische doelen onthullen.Een in vivo bioluminescentie van de muistumorlast bereikt een signaal tussen één keer 10 aan zes en één keer 10 aan de 7de fotonen. Spoel zuurstofhoudende tyrode oplossing door de bloedsomloop van de geëuthanaseerde tumordragende muis totdat de lever en longen volledig zijn gewist van bloed. Blijf het dier met 30% sacharoseoplossing nog 15 minuten oplossen in tyrodeoplossing.Om het succes van de perfusie te evalueren, bevestig dan dat de nek, staart en benen stijf zijn aan het einde van de circulatie. Oogst dan de hersenen volgens standaard protocollen en bewaar de hersenen 's nachts in verse 30% sacharose oplossing. Ter voorbereiding op de cryopreservatie, vul een pot met koude isopentane-2-methylbutaan en plaats de pot in een container gevuld met vloeibare stikstof.Terwijl het oplosmiddel is koelen, dep de hersenen droog op een stuk filter papier en plaats de hersenen in een gelabeld Cryomold. Voorzichtig bij ongeveer vijf milliliter van optimale temperatuur snijden medium naar het centrum van de Cryomold en plaats de hersenen in de mal in de gewenste oriëntatie. Met behulp van schone tangen, plaats de Cryomold snel in de gekoelde isopentane-2-methylbutaan gedurende 30 tot 40 seconden.Zodra het snijmedium is gestold, breng de Cryomold op droog ijs en wikkel de Cryomold en snap bevroren hersenweefsel in aluminiumfolie voor min 80 graden Celsius opslag. Om bevroren hersentumorweefselsecties te verwerven, stel u eerst de temperatuur van een cryostat in tussen min 20 en min 24 graden Celsius en plaatst u het monsterblok gedurende 30 tot 60 minuten in de cryostatkamer. Terwijl het monster in evenwicht is, reinigt u de kamer- en messenhouder met 100% ethanol en spuit u de sectieborstels met RNase reinigingsoplossing.Wanneer het monster klaar is, verwijder de mal en gebruik vers snijmedium om het bevroren weefselblok aan de monsterschijf van de cryostat te bevestigen. Plaats het blok in de schijfhouder en lijn het blok uit met het mes. Verkrijg 10 micrometersecties van de hersenen met behulp van een van de Rnase-vrije borstels om de weefselstukken zorgvuldig af te vlakken en te ontwierpen op het snijoppervlak.Om de hersenweefselsecties op de dia's te monteren, drukt u soepel op de positief geladen kant van een gelabelde RNase-vrije PEN-glasschaars op de sectie en plaatst u de schuif in een opbergvak in de kamer. Wanneer alle dia's zijn verzameld, plaatst u de opbergdoos op min 80 graden Celsius. Om het snijmedium op te lossen voor lasermicro dissectie, dompel de dia's onder in 30-seconden sequentiële aflopende ethanol onderdompelingen, gevolgd door kristal violette oplossing vlekken gedurende 20 seconden en vijf seconden in 0,5% eosine Y oplossing.Gebruik aan het einde van de eosine Y-incubatiefilterpapier om de dia's droog te blokkeren en de dia's te dehydrateren in opeenvolgende opgaande ethanolonderdompelingen. Na de onderdompeling van 60 seconden spoelt u de glijbanen drie minuten in een container met xyleen. Droog vervolgens de glijbanen op het RNase-vrije oppervlak op kamertemperatuur gedurende 10 seconden voordat u de monsters in montagemedium monteert die is bereid met RNase-vrij water.Breng na 10 tot 20 seconden de dia's over op het microdissectionplatform. Voor laserafvang microdissection, zet de macht voordat u op de laser. Schakel vervolgens de microscoopcontroller in de computer in en start de laser capture microdissection software.Selecteer in het deelvenster Microscoopbediening de 10 keer vergroting. Stel onder Laser Control de laserparameters voor weefseldissectie in en selecteer een laserfrequentie van 120 hertz en een laserstroom van 100%Voor nauwkeurige lasermicrodissection, stel de snelheid in op 10 en stel het diafragma in op 10 micrometer. Stel dan de stroom in op 53.Laad de weefselcollector die het weefsel na de sectie zal vastleggen en klik op de tweede ontlaadknop. Vervang de lege collector door DNase en Rnase-vrije 0,5 milliliter PCR flathead buizen met 30 microliter lyse buffer per buis. Breng de collector terug naar de machine en klik verder.Laad het verwerkte monster op de microscoop en klik op Lossen in de lasermicrodissection software. Het monster op de schuifhouder omhoog en de schuifhouder op het podium plaatsen. Klik op Doorgaan om door te gaan en selecteer Knippen in het venster Shapes knippen.Gebruik de microscoop controles om het gebied van belang te vinden en een overzicht te trekken rond het gebied van belang. Selecteer vervolgens een buis van de bestemmingscollector en klik op Knippen starten om de weefselmicrodissection te laten verlopen. Wanneer alle gebieden van belang zijn ontleed, breng de collector buizen van de houder op droog ijs totdat ze downstream verwerking.Om weefsels met een superieure morfologie en RNA-integriteit te verwerven, werden verschillende perfusiebenaderingen geëvalueerd. Om de gebieden van belang te ontleden, is het noodzakelijk om de weefsels te bevlekken met onschadelijke kleurstoffen voor RNA. De daaropvolgende perfusie van tumordragende muizen met tyrode oplossing en 30% sacharose gevolgd door een nachtelijke incubatie in 30%sucrose resulteert in het behoud van de morfologie en RNA-integriteit van het muizenweefsel.Hoewel paraformaldehyde weefselfixatie resulteert in een hoogwaardige weefselmorfologie, wordt de RNA-integriteit negatief beïnvloed. Andere benaderingen, zoals het gebruik van een tyrode oplossing incubatie, of tyrode oplossing plus 30% sacharose oplossing incubaties hebben geen invloed op de RNA-kwaliteit, maar een verminderde resolutie in de weefselmorfologie wordt waargenomen. Als de weefsels niet zijn gemonteerd met montagemedium, worden de secties uitgedroogd en verslechtert de morfologie tijdens de montage van de weefselmonsters met 15% montagemedium opgelost in water een hoogwaardige weefselmorfologie.Laser vangen microdissectie microdiscopentie microbeeldvorming maakt selectie van het tumorweefsel voor dissectie. Deze regio van belang selectie maakt dan dissectie van gebieden van belang binnen elk weefsel monster voor RNA integriteit analyse. Het handhaven van een hoge kwaliteit tumorweefsel morfologie en RNA integriteit is van cruciaal belang.Tyrode-oplossing en 30%sucroseperfusie met nachtelijke bewaring in 30% sacharose verbeteren de weefselmorfologie voor LMD aanzienlijk. Snelle lyomafixatie, kleuring en montage met GAN-oplossing is een cruciale stap in het behoud van de RNA-kwaliteit en het voorkomen van scheuren in het weefsel. We raden aan om ten minste 2,5 keer 10 tot de 6e vierkante micrometer totale tumor per weefselgebied te sectioneren om de juiste hoeveelheden RNA te verkrijgen voor zowel RNA-kwaliteitscontrole als transcriptieanalyse.LMD maakt de analyse mogelijk van de moleculaire signaleringstrajecten die glioomheterogeniteit en invasie reguleren, die nieuwe potentiële doelen voor toekomstige translationele ontwikkeling in preklinische glioommodellen kunnen onthullen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactische Atlas-geleide Laser vangt Microdissection van hersengebieden beïnvloed door traumatisch letsel

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Een RVS Protocol voor hoge kwaliteit RNA isolatie van Laser vangen Microdissected Purkinje cellen in het menselijke Post Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...