Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
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Les travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health (NIH/NINDS) Subventions: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 à M.G.C.; (NIH/NINDS) Subventions R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 à P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; le Département de neurochirurgie, le Rogel Cancer Center de l’Université du Michigan, la ChadTough Foundation et la Happy Hearts Foundation de Leah à M.G.C. et P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 à M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 pour le Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Le projet F049768 à l’Institut forbes de recherche sur le cancer de l’Université du Michigan, un prix médecin-scientifique de la recherche pour prévenir la cécité, Inc. (RPB), accorde R01 EY022633 de l’ONI des NIH (AK) et une subvention sans restriction de la RPB au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles. Cette recherche a utilisé le Centre de recherche de la vision (P30 EY007003) et le Centre de recherche du Centre de cancérologie (P30 CA046592). AK est soutenu par le Prix De la recherche émergente Mme William Davidson de l’Institut de recherche médicale A. Alfred Taubman.

Toutes les méthodes décrites ici qui utilisent des animaux expérimentaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Michigan.
REMARQUE : Les néurosphères de Glioma générées à partir d’un GEMM ou de lignes stables peuvent être employées pour l’engraftment intracrânien de tumeur chez les souris10 et traitées pour le séquençage de LMD et d’ARN. Ces cellules expriment constit...

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	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’hétérogénéité et à l’invasion du gliome sont d’une importance cruciale pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques13. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode détaillée et optimisée pour analyser le paysage moléculaire de l’hétérogénéité et de l’invasion du gliome à l’aide de la microdissection de capture laser (LMD) suivie d’une analyse transcriptomique.
La microdiss...

Les gliomes sont les tumeurs primaires les plus agressives du système nerveux central. Ils sont très envahissants et hétérogènes1. L’analyse des composants cellulaires et moléculaires de la tumeur révélera de nouvelles cibles thérapeutiques.
Parmi les différentes méthodes actuellement disponibles, la microdissection de capture laser (LMD) du tissu tumoral congelé est une technique rentable et fiable qui permet l’isolement des zones anatomiques discrètes ou des populations cellulaires spécifiques des tissus tumoraux pour étudier leur profil moléculaire2,3. LMD permet l’analyse des profils d’expression des gènes de l’ARNm de certaines cellules individuelles ou structures multicellulaires4,5. LMD peut être utilisé pour acquérir des connaissances mécanistes approfondies sur les événements moléculaires qui ont lieu pendant la progression tumorale. Amélioration dans le traitement des tissus tumoraux est nécessaire pour obtenir une résolution optique optimale de la morphologie tissulaire et de la qualité de l’ARN6. Bien que la fixation du paraformaldéhyde soit la meilleure option pour l’analyse morphologique, la qualité de l’ARN est affectée et dégradée dans ces conditions, ce qui entraîne une mauvaise qualité d’ARN pour l’analyse ARN-seq. L’utilisation de sections de tissu congelé évite la formation de cristaux de glace, qui pourrait briser les membranes cellulaires et produire des trous dans les cellules, et reste la meilleure option pour l’analyse ARN-Seq7.
Ici, nous décrivons une méthode optimisée de fixation et de coloration de section pour traiter les tissus congelés de tumeur de cerveau de souris pour LMD. Pour empêcher la formation de cristaux de glace dans le tissu, nous avons perfusé les souris avec une solution de saccharose de 30%. Cette solution perturbe les interactions entre les molécules d’eau polaire et empêche la formation de cristaux de glace, préservant la morphologie tissulaire. La coloration des tissus est nécessaire pour différencier et obtenir une population spécifique de cellules ou des zones anatomiquement distinctes dans la tumeur. Il est essentiel de fixer et de tacher le tissu avec des colorants inoffensifs pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Il a été précédemment montré que le tissu de coloration avec l’hématoxyline/eosine (H et E) détériore l’intégrité de l’ARN8. Nous avons fixé et taché le tissu d’intérêt avec l’éthanol, Cresyl violet 4% et eosin Y 0.5% solutions. La violette de cresyl est un colorant acidophile qui tache le noyau cellulaire avec une couleur bleu foncé. Eosin Y est un colorant basophile qui tache les composants de base des cellules, offrant une distinction entre le cytoplasme et d’autres structures cellulaires8. Les deux colorants sont solubles dans l’éthanol et ne détériorent pas la qualité de l’ARN. Pour éviter les lésions tissulaires et maintenir une haute résolution optique des structures cellulaires, nous avons monté les sections tissulaires avant LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primaires caractérisées par leur invasivité et leur hétérogénéité. Des modèles histologiques spécifiques tels que les pseudopalisades, la prolifération microvasculaire, la transformation mésenchymale et la nécrose caractérisent l’hétérogénéité histologique des gliomes de haute qualité. Notre laboratoire a démontré que la présence de densités élevées de cellules mésenchymales, nommées oncostreams, corrèlent avec la malignité de tumeur. Nous avons développé une approche unique pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la croissance et l’invasion du gliome. Ici, nous décrivons un protocole complet qui utilise la microdissection de capture de laser (LMD) et le séquençage d’ARN pour analyser l’expression différentiele d’ARNm des structures multicellulaires intra-tumorales (c.-à-d. les secteurs mésenchymal ou les secteurs de l’invasion de tumeur). Cette méthode maintient une bonne histologie tissulaire et l’intégrité de l’ARN. La perfusion, la congélation, l’intégration, la section et la coloration ont été optimisées pour préserver la morphologie et obtenir des échantillons de microdissection laser de haute qualité. Les résultats indiquent que la perfusion de souris porteuses de gliome utilisant 30% de saccharose fournit une bonne morphologie et la qualité d’ARN. En outre, les sections de tumeur de coloration avec 4% de violette de Cresyl et 0.5% d’éosine a comme conséquence la bonne coloration nucléaire et cellulaire, tout en préservant l’intégrité d’ARN. La méthode décrite est sensible et hautement reproductible et elle peut être employée pour étudier la morphologie de tumeur dans divers modèles de tumeur. En résumé, nous décrivons une méthode complète pour effectuer LMD qui préserve la morphologie et la qualité d’ARN pour le séquençage pour étudier les dispositifs moléculaires des structures multicellulaires hétérogènes dans les tumeurs solides.

Notre laboratoire a généré un modèle de souris génétiquement modifié (GEMM) à l’aide du système de transposase de beauté endormie(figure 1A). Ce système intègre des altérations génétiques spécifiques dans le génome des cellules progénitrices neurales chez les souris néonatales. Ces cellules progénitrices altérées forment des tumeurs endogènes de glioma. Les séquences plasmides utilisées pour générer les tumeurs é...

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Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Ce protocole utilise la microdissection laser et le séquençage de l’ARN pour analyser l’expression différentielle de l’ARNm de l’hétérogénéité intratumorale, comme les zones d’accumulation de cellules mésenchymales ou les zones d’invasion tumorale. Cette méthode a été optimisée pour préserver l’histologie des tissus de bonne qualité et l’intégrité de l’ARN afin de faciliter l’acquisition d’échantillons de microdissection laser de haute qualité. Cette méthode est sensible et hautement reproductible.Il peut être utilisé pour étudier la morphologie tumorale et l’hétérogénéité dans divers modèles tumoraux. La microdissection au laser du tissu gelé de tumeur de cerveau est une technique rentable et fiable pour l’isolement des secteurs anatomiques discrets des populations cellulaires des tissus de tumeur pour étudier leurs profils moléculaires. LMD peut être utilisé pour acquérir des connaissances mécanistes approfondies sur les événements moléculaires qui ont lieu au cours de la progression tumorale, et pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques.Une bioluminescence in vivo de la charge tumorale de la souris atteint un signal entre une fois 10 à six et une fois 10 au 7ème photons. Rincer la solution oxygénée de tyrode par le système circulatoire de la souris tumeur-roulement euthanasiée jusqu’à ce que le foie et les poumons aient été complètement dégagés du sang. Continuer à perfuser l’animal avec une solution de saccharose à 30 % dissoute dans la solution tyrode pendant 15 minutes supplémentaires.Pour évaluer le succès de la perfusion, confirmez que le cou, la queue et les jambes sont rigides à la fin de la circulation. Puis récoltez le cerveau selon les protocoles standard et stockez le cerveau pendant la nuit dans la solution fraîche de saccharose de 30%. Pour préparer la cryopréservation, remplissez un bocal d’isopentane-2-méthylbutane froid et placez le bocal dans un récipient rempli d’azote liquide.Pendant que le solvant refroidit, épongez le cerveau à sec sur un morceau de papier filtre et placez le cerveau dans un Cryomold étiqueté. Soigneusement à environ cinq millilitres de température optimale de coupe moyenne au centre du Cryomold et placer le cerveau dans le moule dans l’orientation désirée. À l’aide de forceps propres, placez rapidement le Cryomold dans l’isopentane-2-méthylbutane réfrigéré pendant 30 à 40 secondes.Une fois que le milieu de coupe s’est solidifié, transférez le Cryomold sur de la glace sèche et enveloppez le Cryomold et enroulez le tissu cérébral congelé dans du papier d’aluminium pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour acquérir des sections congelées de tissu de tumeur de cerveau, réglez d’abord la température d’un cryostat entre moins 20 et moins 24 degrés Celsius, et placez le bloc d’échantillon dans la chambre de cryostat pendant 30 à 60 minutes. Pendant que l’échantillon est en équilibre, nettoyez la chambre et le porte-couteau avec 100 % d’éthanol et vaporisez les brosses de section avec la solution de nettoyage RNase.Lorsque l’échantillon est prêt, retirez le moule et utilisez un milieu de coupe frais pour fixer le bloc de tissu congelé au disque du spécimen du cryostat. Placez le bloc dans le support du disque et alignez le bloc avec la lame du couteau. Acquérir 10 sections de micromètres du cerveau à l’aide de l’une des brosses sans arnse pour aplatir et décharger soigneusement les morceaux de tissu sur la surface de coupe.Pour monter les sections de tissu cérébral sur les glissières, appuyez en douceur sur le côté chargé positivement d’une glissière en verre PEN sans RNase étiquetée sur la section et placez la glissière dans une boîte de rangement à l’intérieur de la chambre. Lorsque toutes les diapositives ont été recueillies, placez la boîte de stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour dissoudre le milieu de coupe avant la microsection laser, submergez les glissières en immersions séquentielles d’éthanol descendant de 30 secondes suivies d’une coloration de solution violette cristalline pendant 20 secondes et de cinq secondes dans la solution Y d’éosine de 0,5 %.À la fin de l’incubation de l’éosine Y, utiliser du papier filtre pour bloquer les glissières sèches et déshydrater les glissières dans des immersions d’éthanol ascendantes séquentielles. Après l’immersion de 60 secondes dans l’éthanol, rincer les glissières dans un contenant de xylène pendant trois minutes. Ensuite, séchez les glissières sur une surface exempte de RNase à température ambiante pendant 10 secondes avant de monter les échantillons dans un milieu de montage préparé avec de l’eau sans RNase.Après 10 à 20 secondes, transférez les diapositives sur la plate-forme de microdissection du microscope. Pour la microdissection de capture laser, allumez la puissance avant d’allumer le laser. Ensuite, allumez le contrôleur de microscope dans l’ordinateur et démarrez le logiciel de microdissection de capture laser.Dans le panneau microscope control, sélectionnez le grossissement 10 fois. Sous contrôle laser, définissez les paramètres laser pour la dissection des tissus et sélectionnez une fréquence laser de 120 hertz et un courant laser de 100% pour une microdissection laser précise, réglez la vitesse à 10 et réglez l’ouverture à 10 micromètres. Réglez ensuite la puissance à 53.Chargez le collecteur de tissus qui capturera le tissu suivant la section et cliquez sur le deuxième bouton Déchargement. Remplacez le collecteur vide par des tubes à tête plate PCR sans DNase et Rnase contenant 30 microlitres de tampon de lyse par tube. Retournez le collecteur à la machine et cliquez continuer à procéder.Chargez le spécimen traité sur le microscope et cliquez sur Déchargez dans le logiciel de microdissection laser. Montez l’échantillon sur le support de la glissière et placez le porte-diapositives sur la scène. Cliquez continuer à procéder et sélectionnez Dessiner Cut dans la fenêtre Formes coupées.Utilisez les commandes au microscope pour trouver le domaine d’intérêt et dessiner un aperçu autour de la région d’intérêt. Sélectionnez ensuite un tube collecteur de destination et cliquez sur Démarrer la coupe pour procéder à la microdissection tissulaire. Lorsque tous les domaines d’intérêt ont été disséqués, transférez les tubes collecteurs du support sur de la glace sèche jusqu’à ce qu’ils soient traités en aval.Pour acquérir des tissus avec une morphologie supérieure et l’intégrité de l’ARN, diverses approches de perfusion ont été évaluées. Pour disséquer les zones d’intérêt, il est nécessaire de tacher les tissus avec des colorants inoffensifs pour l’ARN. La perfusion suivante des souris tumorales avec la solution de tyrode et le saccharose de 30%suivi d’une incubation de nuit dans 30% de saccharose a comme résultat la conservation de la morphologie et de l’intégrité d’ARN du tissu de souris.Bien que la fixation des tissus paraformaldéhyde entraîne une morphologie tissulaire de haute qualité, l’intégrité de l’ARN est affectée négativement. D’autres approches telles que l’utilisation d’une solution tyrode incubation, ou la solution tyrode plus 30% incubations de solution saccharose n’affectent pas la qualité de l’ARN, mais une résolution réduite dans la morphologie tissulaire est observée. Si les tissus ne sont pas montés avec le milieu de montage, les sections deviennent déshydratées et la morphologie se détériore tandis que le montage des échantillons de tissu avec le milieu de montage de 15% dissous dans l’eau maintient une morphologie tissulaire de haute qualité.L’imagerie au microscope de microdissection de capture au laser permet la sélection du tissu tumoral pour la dissection. Cette sélection de la région d’intérêt permet ensuite la dissection des zones d’intérêt dans chaque échantillon de tissu pour l’analyse de l’intégrité de l’ARN. Le maintien d’une morphologie de tissu tumoral de haute qualité et de l’intégrité de l’ARN est essentiel.La solution tyrode et la perfusion de saccharose de 30% avec la conservation du jour au lendemain dans 30% saccharose améliore considérablement la morphologie de tissu pour LMD. La fixation rapide de lyoma, la coloration et le montage avec la solution de GAN est étape critique pour préserver la qualité d’ARN et empêcher des fissures de se former dans le tissu. Nous recommandons de sectionner au moins 2,5 fois 10 à la tumeur totale de micromètres carrés par zone de tissu pour obtenir des quantités appropriées d’ARN pour le contrôle de qualité d’ARN et l’analyse transcriptomique.LMD permet l’analyse des voies de signalisation moléculaires qui régulent l’hétérogénéité et l’invasion du gliome qui pourraient révéler de nouvelles cibles potentielles pour le développement translationnel futur dans les modèles précliniques de gliome.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Recherche

Neurosciences

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Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

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Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Neurones olfactifs obtenus à l&#39;aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Un protocole en acier inoxydable pour l’ARN haute qualité laser capturer des cellules de Microdissected Purkinje du cervelet humain Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...