Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
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Die Arbeiten wurden von den National Institutes of Health,(NIH/NINDS) Grants: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 to M.G.C.; (NIH/NINDS) Zuschüsse R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 an P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; das Department of Neurosurgery, Rogel Cancer Center an der University of Michigan, ChadTough Foundation, und Leah es Happy Hearts Foundation an M.G.C. und P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 an M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Grant, Project F049768 an A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, ein Physician-Scientist Award von Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), Stipendium R01 EY022633 von der NEI des NIH (AK) und ein uneingeschränktes Stipendium des RPB an das Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Diese Forschung nutzte den Vision Research Core (P30 EY007003) und den Cancer Center Research Core (P30 CA046592). Die AK wird durch den Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award des A. Alfred Taubman Medical Research Institute unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden, die Versuchstiere verwenden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Michigan zugelassen.
HINWEIS: Gliom-Neurosphären, die aus einem GEMM oder stabilen Linien erzeugt werden, können zur intrakraniellen Tumorengraftierung bei Mäusen10 verwendet und für die LMD- und RNA-Sequenzierung verarbeitet werden. Diese Zellen exprimieren konstitutiv Grüfly-Luziferase und GFP-Proteine, die weiter für di...

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	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. 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Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Gliomheterogenität und -invasion zugrunde liegen, ist von entscheidender Bedeutung, um neue therapeutische Ziele aufzudecken13. In diesem Manuskript beschreiben wir eine detaillierte und optimierte Methode zur Analyse der molekularen Landschaft der Gliomheterogenität und Invasion mittels Laser capture microdissection (LMD) gefolgt von transkriptomischer Analyse.
Lasercapture Microdissection (LMD) kann verwendet wer...

Gliome sind die aggressivsten Primärtumoren des zentralen Nervensystems. Sie sind hochinvasiv und heterogen1. Die Analyse zellulärer und molekularer Komponenten des Tumors wird neue therapeutische Ziele aufzeigen.
Unter verschiedenen derzeit verfügbaren Methoden ist die Lasercapture-Mikrodissektion (LMD) von gefrorenem Hirntumorgewebe eine kostengünstige, zuverlässige Technik, die die Isolierung diskreter anatomischer Bereiche oder spezifischer Zellpopulationen aus Tumorgeweben ermöglicht, um ihr molekulares Profil zu untersuchen2,3. LMD ermöglicht die Analyse von mRNA-Genexpressionsprofilen ausgewählter Einzelzellen oder multizellulärer Strukturen4,5. LMD kann genutzt werden, um tiefgehendes mechanistisches Wissen über die molekularen Ereignisse zu gewinnen, die während der Tumorprogression stattfinden. Eine Verbesserung der Verarbeitung von Tumorgeweben ist notwendig, um eine optimale optische Auflösung der Gewebemorphologie und der RNA-Qualität6zu erhalten. Obwohl paraformaleDehyd-Fixierung die beste Option für die morphologische Analyse ist, wird die RNA-Qualität unter diesen Bedingungen beeinflusst und herabgestuft, was zu einer schlechten RNA-Qualität für die RNA-Seq-Analyse führt. Die Verwendung von gefrorenen Gewebeabschnitten vermeidet die Bildung von Eiskristallen, die Zellmembranen brechen und Löcher in Zellen produzieren könnten, und bleibt die beste Option für die RNA-Seq-Analyse7.
Hier beschreiben wir eine optimierte Abschnittsfixierungs- und Färbemethode zur Verarbeitung von gefrorenem Hirntumorgewebe der Maus für LMD. Um zu verhindern, dass sich Eiskristalle im Gewebe bilden, haben wir Mäuse mit einer Lösung von 30% Saccharose durchdrungen. Diese Lösung stört Wechselwirkungen zwischen polaren Wassermolekülen und verhindert die Bildung von Eiskristallen, wodurch die Gewebemorphologie erhalten bleibt. Gewebefärbung ist notwendig, um zu differenzieren und spezifische Population von Zellen oder anatomisch unterschiedliche Bereiche innerhalb des Tumors zu erhalten. Es ist wichtig, das Gewebe mit harmlosen Farbstoffen zu fixieren und zu färben, um die RNA-Integrität zu erhalten. Es wurde bereits gezeigt, dass Färbegewebe mit Hämatoxylin/Eosin (H&E) die RNA-Integrität verschlechtert8. Wir fixierten und färbten das Gewebe von Interesse mit Ethanol, Cresyl violett 4% und Eosin Y 0,5% Lösungen. Cresylviolett ist ein acidophiler Farbstoff, der den Zellkern mit einer dunkelblauen Farbe färbt. Eosin Y ist ein basophiler Farbstoff, der grundlegende Bestandteile der Zellen färbt und eine Unterscheidung zwischen Zytoplasma und anderen zellulären Strukturen bietet8. Beide Farbstoffe sind in Ethanol löslich und verschlechtern die RNA-Qualität nicht. Um Gewebeschäden zu vermeiden und eine hohe optische Auflösung der zellulären Strukturen zu erhalten, haben wir die Gewebeabschnitte vor LMD9montiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliome sind primäre Hirntumoren, die sich durch ihre Invasivität und Heterogenität auszeichnen. Spezifische histologische Muster wie Pseudopalisaden, mikrovaskuläre Proliferation, mesenchymale Transformation und Nekrose charakterisieren die histologische Heterogenität hochwertiger Gliome. Unser Labor hat gezeigt, dass das Vorhandensein von hohen Dichten von mesenchymalen Zellen, die Oncostreams genannt werden, mit Tumormalignität korreliert. Wir haben einen einzigartigen Ansatz entwickelt, um die Mechanismen zu verstehen, die dem Wachstum und der Invasion von Glioma zugrunde liegen. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll, das Lasercapture Microdissection (LMD) und RNA-Sequenzierung nutzt, um die differenzielle mRNA-Expression intratumoraler heterogener multizellulärer Strukturen (d. h. mesenchymale Bereiche oder Bereiche der Tumorinvasion) zu analysieren. Diese Methode bewahrt eine gute Gewebehistologie und RNA-Integrität. Perfusion, Einfrieren, Einbetten, Schnitt und Färbung wurden optimiert, um die Morphologie zu erhalten und hochwertige Lasermikrodissektionsproben zu erhalten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Perfusion von Gliom-tragenden Mäusen mit 30% Saccharose eine gute Morphologie und RNA-Qualität bietet. Darüber hinaus führt die Färbung von Tumorabschnitten mit 4% Cresylviolett und 0,5% Eosin zu einer guten kern- und zellulären Färbung unter Beibehaltung der RNA-Integrität. Die beschriebene Methode ist empfindlich und hochreproduzierbar und kann verwendet werden, um Tumormorphologie in verschiedenen Tumormodellen zu studieren. Zusammenfassend beschreiben wir eine vollständige Methode zur Durchführung von LMD, die Morphologie und RNA-Qualität für die Sequenzierung bewahrt, um die molekularen Merkmale heterogener multizellulärer Strukturen innerhalb solider Tumoren zu untersuchen.

Unser Labor hat eine gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) mit dem Schlafschönheitstransposase-System(Abbildung 1A) erstellt. Dieses System integriert spezifische genetische Veränderungen in das Genom von neuronalen Vorläuferzellen bei neonatalen Mäusen. Diese veränderten Vorläuferzellen bilden endogene Gliom-Tumoren. Plasmidsequenzen zur Generierung der Tumoren waren: (1) pT2C-LucPGK-SB100X für Dornröschentransposon & lucifera...

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Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Dieses Protokoll verwendet Laser-Mikrodissektion und RNA-Sequenzierung, um die differenzielle mRNA-Expression der Intratumorheterogenität zu analysieren, wie z. B. Bereiche der Akkumulation von mesenchymalen Zellen oder Bereiche der Tumorinvasion. Diese Methode wurde optimiert, um hochwertige Gewebehistologie und RNA-Integrität zu erhalten, um die Erfassung von hochwertigen Lasermikrosektionsproben zu erleichtern. Diese Methode ist empfindlich und sehr reproduzierbar.Es kann verwendet werden, um Tumormorphologie und Heterogenität in verschiedenen Tumormodellen zu studieren. Die Lasermikrodissektion von gefrorenem Hirntumorgewebe ist eine kostengünstige, zuverlässige Technik zur Isolierung diskreter anatomischer Bereiche von Zellpopulationen aus Tumorgeweben, um ihre molekularen Profile zu untersuchen. LMD kann genutzt werden, um tiefgehendes mechanistisches Wissen über die molekularen Ereignisse zu gewinnen, die während der Tumorprogression stattfinden, und könnte neue therapeutische Ziele offenbaren.Eine In-vivo-Biolumineszenz der Maustumorbelastung erreicht ein Signal zwischen einem mal 10 bis sechs und einmal 10 bis 7. Photonen. Spülen Sie sauerstoffreiche Tyrode-Lösung durch das Kreislaufsystem der eingeschläferten tumortragenden Maus, bis Leber und Lunge vollständig von Blut befreit sind. Setzen Sie das Tier mit 30%Saccharoselösung in Tyrode-Lösung für weitere 15 Minuten gelöst durch.Um den Erfolg der Perfusion zu bewerten, bestätigen Sie, dass Hals, Schwanz und Beine am Ende des Kreislaufs starr sind. Dann ernten Sie das Gehirn nach Standardprotokollen und speichern Sie das Gehirn über Nacht in einer frischen 30%Saccharose-Lösung. Um sich auf die Kryokonservierung vorzubereiten, füllen Sie ein Glas mit kaltem Isopentan-2-Methylbutan und legen Sie das Glas in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt.Während das Lösungsmittel kühlt, bleben Sie das Gehirn auf einem Stück Filterpapier trocken und legen Sie das Gehirn in einen markierten Cryomold. Bei etwa fünf Millilitern optimaler Temperaturschnittmedium bis zur Mitte des Cryomolds vorsichtig und das Gehirn in die Form in der gewünschten Ausrichtung legen. Mit sauberen Zangen den Cryomold schnell 30 bis 40 Sekunden in das gekühlte Isopentan-2-Methylbutan geben.Sobald das Schneidmedium erstarrt ist, übertragen Sie den Cryomold auf Trockeneis und wickeln Sie den Cryomold und schnappen Sie gefrorenes Hirngewebe in Aluminiumfolie für minus 80 Grad Celsius Speicher. Um gefrorene Hirntumorgewebeabschnitte zu erhalten, stellen Sie zunächst die Temperatur eines Kryostats zwischen minus 20 und minus 24 Grad Celsius ein und legen Sie den Probenblock für 30 bis 60 Minuten in die Kryostatkammer. Während die Probe ausgeglichen ist, reinigen Sie den Kammer- und Messerhalter mit 100% Ethanol und sprühen Sie die Schnittbürsten mit RNase Reinigungslösung.Wenn die Probe fertig ist, entfernen Sie die Form und verwenden Sie frisches Schneidmedium, um den gefrorenen Gewebeblock an der Probenscheibe des Kryostats zu befestigen. Legen Sie den Block in den Scheibenhalter und richten Sie ihn an der Messerklinge aus. Erwerben Sie 10 Mikrometer Abschnitte des Gehirns mit einer der Rnase-freien Bürsten, um die Gewebeteile vorsichtig abzuflachen und auf die Schnittfläche zu entwirn.Um die Hirngewebeabschnitte auf die Dias zu montieren, drücken Sie die positiv geladene Seite einer beschrifteten RNase-freien PEN-Glasrutsche problemlos auf den Abschnitt und legen Sie die Rutsche in eine Aufbewahrungsbox innerhalb der Kammer. Wenn alle Dias gesammelt sind, legen Sie die Aufbewahrungsbox bei minus 80 Grad Celsius. Um das Schneidmedium vor der Lasermikrosektion aufzulösen, tauchen Sie die Dias in 30-Sekunden-Sequenzabsenkungen in Ethanol ein, gefolgt von kristallvioletter Lösungsfärbung für 20 Sekunden und fünf Sekunden in 0,5%eosin Y-Lösung.Verwenden Sie am Ende der Eosin-Y-Inkubation Filterpapier, um die Dias zu blockieren, die in sequenziellen aufsteigenden Ethanol-Eintauchen trocknen und dehydrieren. Nach dem 60-Sekunden-Ethanol-Eintauchen die Dias in einem Behälter mit Xylol für drei Minuten abspülen. Als nächstes trocknen Sie die Dias auf RNase-freier Oberfläche bei Raumtemperatur für 10 Sekunden, bevor Sie die Proben in Montagemedium mit RNase-freiem Wasser aufbereiten.Übertragen Sie die Dias nach 10 bis 20 Sekunden auf die Mikroskop-Mikrodissektionsplattform. Schalten Sie die Stromversorgung ein, bevor Sie den Laser einschalten, um die Mikrosektion zu erfassen. Schalten Sie als Nächstes den Mikroskop-Controller im Computer ein und starten Sie die Laser-Capture-Mikrodissektionssoftware.Wählen Sie im Bedienfeld "Mikroskop" die 10-fache Vergrößerung aus. Legen Sie unter Lasersteuerung die Laserparameter für die Gewebesektion fest und wählen Sie eine Laserfrequenz von 120 Hertz und einen Laserstrom von 100%Für eine genaue Lasermikrosektion, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 10 und die Blende auf 10 Mikrometer ein. Stellen Sie dann die Leistung auf 53 ein.Laden Sie den Gewebekollektor, der das Gewebe nach dem Abschnitt erfasst, und klicken Sie auf die zweite Schaltfläche Entladen. Ersetzen Sie den leeren Kollektor durch DNase und Rnase-freie 0,5 Milliliter PCR-Flachkopfrohre, die 30 Mikroliter Lysepuffer pro Tube enthalten. Geben Sie den Kollektor an die Maschine zurück, und klicken Sie auf Fortfahren, um fortzufahren.Laden Sie die verarbeitete Probe auf das Mikroskop und klicken Sie in der Laser-Mikrodissektionssoftware auf Entladen. Die Probe auf den Schiebehalter aufsteigen und den Schiebehalter auf die Bühne stellen. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren, und wählen Sie Im Fenster Schnittformen ausschneiden aus.Verwenden Sie die Mikroskopsteuerung, um den Interessenbereich zu finden und einen Überblick über die Interessenregion zu zeichnen. Wählen Sie dann ein Zielkollektorrohr aus und klicken Sie auf Schnitt starten, um die Gewebemikrodissektion fortzusetzen. Wenn alle Interessengebiete seziert sind, übertragen Sie die Kollektorrohre vom Halter auf Trockeneis, bis sie nachgelagert werden.Um Gewebe mit einer überlegenen Morphologie und RNA-Integrität zu erfassen, wurden verschiedene Perfusionsansätze evaluiert. Um die Interessensgebiete zu sezieren, ist es notwendig, das Gewebe mit harmlosen Farbstoffen für rna zu färben. Die anschließende Perfusion tumortragender Mäuse mit Tyrodelösung und 30%Saccharose gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in 30%Saccharose führt zur Erhaltung der Morphologie und RNA-Integrität des Mausgewebes.Obwohl die Paraformaldehydgewebefixierung zu einer qualitativ hochwertigen Gewebemorphologie führt, wird die RNA-Integrität negativ beeinflusst. Andere Ansätze wie die Verwendung einer Tyrode-Lösungsinkubation oder eine Tyrodenlösung plus 30%Saccharose-Lösungsinkubationen beeinflussen die RNA-Qualität nicht, aber es wird eine reduzierte Auflösung in der Gewebemorphologie beobachtet. Wenn die Gewebe nicht mit Montagemedium montiert sind, werden die Abschnitte dehydriert und die Morphologie verschlechtert sich, während die Montage der Gewebeproben mit 15%Montagemedium in Wasser gelöst eine hochwertige Gewebemorphologie aufrechterhält.Lasercapture Mikrodissektion smikroskopische Bildgebung ermöglicht die Auswahl des Tumorgewebes für die Zerlegung. Diese Interessensbereich-Auswahl ermöglicht dann die Zerlegung von Interessengebieten innerhalb jeder Gewebeprobe für die RNA-Integritätsanalyse. Die Aufrechterhaltung einer hochwertigen Tumorgewebemorphologie und RNA-Integrität ist entscheidend.Tyrode-Lösung und 30%Saccharose-Perfusion mit über Nacht Konservierung in 30%Saccharose verbessert signifikant Gewebemorphologie für LMD. Die schnelle Lyomafixierung, Färbung und Montage mit GAN-Lösung ist ein entscheidender Schritt, um die RNA-Qualität zu erhalten und Risse im Gewebe zu verhindern. Wir empfehlen, mindestens 2,5-mal 10 bis zum 6. Quadratmikrometer Gesamttumor pro Gewebebereich zu sektionieren, um angemessene MENGEN an RNA sowohl für die RNA-Qualitätskontrolle als auch für die transkriptomische Analyse zu erhalten.LMD ermöglicht die Analyse der molekularen Signalwege, die die Heterogenität und Invasion von Gliom regulieren und neue potenzielle Ziele für die zukünftige translationale Entwicklung in präklinischen Gliommodellen aufzeigen könnten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Riechzellen durch nasale Biopsie Combined Erhalten mit Laser-Mikrodissektion: Ein möglicher Ansatz zum Behandlungserfolg bei Mental Disorders Studieren

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...