Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

העבודה נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות, (NIH/NINDS) מענקים: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 ל M.G.C.; (NIH/NINDS) מענקים R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 ל-P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; המחלקה לנוירוכירורגיה, רוגל מרכז הסרטן באוניברסיטת מישיגן, קרן חדלקשוחה, וקרן לבבות שמח של לאה ל M.G.C. ו P.R.L. RNA ביודיקטטין גרנט F046166 M.G.C. המכונים הלאומיים לבריאות, UL1 TR002240 עבור מכון מישיגן לחקר קליני ובריאות (MICHR), פוסט דוקטורט מלומדים התוכנית (PTSP פית) להעניק, פרויקט F049768 לאוניברסיטת מישיגן פורבס מכון לחקר הסרטן, מדען רופא פרס ממחקר כדי למנוע עיוורון, Inc. (RPB), להעניק R01 EY022633 מן ניי של NIH (AK), ומענק בלתי מוגבל מ RPB למחלקה של עיניים ומדעי הראייה. מחקר זה ניצל את הליבה מחקר חזון (P30 EY007003), ואת מרכז הסרטן מחקר ליבה (P30 CA046592). ה-AK תומך בפרס המלומד של גב' ויליאם דוידסון ממכון המחקר הרפואי א. אלפרד טאובמן.

כל השיטות המתוארות כאן המשתמשות בבעלי חיים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
הערה: מחלות המוח Glioma שנוצרו מקווים GEMM או יציבה ניתן להשתמש עבור הגידול בתוך התוך העור בתוך הבית בעכברים10 מעובד עבור lmd ו-RNA רצפי. תאים אל...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

הבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים glioma טרוגניות ופלישה הם בעלי חשיבות קריטית לחשוף מטרות טיפוליות הרומן13. בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה מפורטת וממוטבת כדי לנתח את הנוף המולקולרי של glioma טרוגניות ו הפלישה באמצעות מיקרו לכידת לייזר (LMD) ואחריו ניתוח טרנססקריפט.
לכ?...

Gliomas הם הגידולים העיקריים האגרסיביים ביותר של מערכת העצבים המרכזית. הם פולשניים מאוד והטרוגנית1. ניתוח של רכיבים סלולריים ומולקולריים של הגידול יגלה מטרות טיפוליות הרומן.
בין שיטות שונות הזמינות כרגע, לכידת לייזר מיקרודיסקציה (lmd) של רקמת סרטן קפואה המוח היא טכניקה חסכונית, אמין המאפשר בידוד של אזורים אנטומיים דיסקרטית או אוכלוסיות תאים ספציפיות מרקמות הגידול לחקור את הפרופיל המולקולרי שלהם2,3. Lmd מאפשר ניתוח של פרופילי mrna ביטוי גנים של תאים בודדים נבחרים או מבנים רב-תאיים4,5. LMD יכול להיות מנוצל כדי לקבל מעמיק ידע מכונאי על האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך התקדמות הגידול. שיפור בעיבוד של רקמות הגידול הוא הכרחי כדי לקבל רזולוציה אופטית אופטימלית של מורפולוגיה רקמות ו-RNA באיכות6. למרות קיבוע פאראפורמלדהיד היא האופציה הטובה ביותר עבור ניתוח מורפולוגית, איכות ה-RNA מושפע ומושפל תחת תנאים אלה, וכתוצאה מכך איכות ה-RNA העני עבור ניתוח של RNA-seq. השימוש בסעיפים רקמות קפואות ימנע היווצרות גביש קרח, אשר יכול לשבור את קרום התא ולייצר חורים בתוך תאים, והוא נשאר האופציה הטובה ביותר לניתוח RNA-Seq7.
כאן, אנו מתארים קיבעון מקטע אופטימיזציה ושיטת הצביעת לעבד העכבר הקפוא רקמות סרטן המוח עבור LMD. כדי למנוע את היווצרות גבישי הקרח ברקמה, אנו מקימים עכברים בתמיסה של 30% סוכרוז. פתרון זה משבש את האינטראקציות בין מולקולות מים קוטביים ומונע היווצרות גבישי קרח, שמירה על מורפולוגיה של רקמות. מכתים רקמות הכרחי כדי להבדיל ולהשיג אוכלוסיה ספציפית של תאים או אזורים ברורים מבחינה אנטומית בתוך הגידול. חיוני לתקן ולהכתים את הרקמה עם צבעים לא מזיק כדי לשמור על שלמות RNA. זה כבר הוכח כי הצביעת רקמות עם המטאוקסילין/אאוזין (H & E) מתדרדר RNA שלמות ה-8. סידרנו והכתים את רקמת העניין עם אתנול, Cresyl סגול 4% ו אאוזין Y 0.5% פתרונות. קרסיל ויולט הוא צבע מאסיאני הכתמים על גרעין התא בצבע כחול כהה. אאוזין Y הוא צבע בסיסי הכתמים על המרכיבים הבסיסיים של התאים, ומספק הבחנה בין ציטופלסמה לבין מבנים סלולאריים אחרים8. שתי הצבעים הם מסיסים אתנול ואינם מידרדר איכות RNA. כדי למנוע נזק לרקמות ולשמור על רזולוציה אופטית גבוהה של המבנים הסלולריים, היינו רכוב על סעיפים הרקמה לפני LMD9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

Gliomas הם גידולים המוח העיקרי המאופיינת בטרוגניות שלהם והחלטיות. דפוסי היסטולוגית ספציפיים כגון פסבדו, התפשטות microvascular, המרה mesenchymal ונמק לאפיין את טרוגניות היסטולוגית של gliomas בדרגה גבוהה. המעבדה שלנו הוכיחה כי נוכחות של צפיפות גבוהה של תאי mesenchymal, בשם אוננטים, לתאם עם ממאירות הגידול. פיתחנו גישה ייחודית כדי להבין את המנגנונים כי בחסר הצמיחה של glioma ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף המבצע לכידת לייזר מיקרודיסקציה (LMD) ו-RNA רצף כדי לנתח את הביטוי mRNA הדיפרנציאלי של מבנים הטרוגנית בתוך הסביבה מוסרי (כלומר, אזורים mesenchymal או אזורים של הפלישה הגידול). שיטה זו שומרת על היסטולוגיה רקמה טובה ושלמות RNA. Perfusion, הקפאת, הטבעה, הפחתת וכתמים היו ממוטבים כדי לשמור על המבנה ולהשיג דגימות באיכות גבוהה לייזר מיקרולייזר. התוצאות מצביעות על כך שפרזיה של עכברים הנושאים glioma באמצעות 30% סוכרוז מספק טוב מורפולוגיה ו-RNA איכות. בנוסף, צביעת סעיפים הגידול עם 4% Cresyl סגול ו 0.5% התוצאות האאוזין הגרעין טוב והסלולר, תוך שמירה על שלמות RNA. השיטה המתוארת היא רגישה מאוד מיויית והיא יכולה להיות מנוצל כדי ללמוד מורפולוגיה של הגידול במודלים סרטניים שונים. לסיכום, אנו מתארים שיטה מלאה לבצע LMD השומרת על מורפולוגיה ואיכות ה-RNA עבור רצף כדי ללמוד את התכונות המולקולריות של מבנים רב-תאיים הטרוגנית בתוך גידולים מוצקים.

המעבדה שלנו יצרה מודלים מהונדסים גנטית העכבר (GEMMs) באמצעות מערכת היופי שינה transposase (איור 1א). מערכת זו משלבת שינויים גנטיים ספציפיים לתוך הגנום של תאי קדמון עצביים בעכברים. אלה תאים שהשתנו מחולל בצורת גידולים glioma בצורה אנדוגניים. רצפי פלמיד השתמשו ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

פרוטוקול זה משתמש במיקרו-דיסקציה בלייזר ולריצוף RNA כדי לנתח את ביטוי ה-mRNA המהידול של הטרוגניות תוך-גולגולתית, כגון אזורי הצטברות של תאים מזנצ'ימליים או אזורים של פלישת גידולים. שיטה זו עברה אופטימיזציה כדי לשמר היסטולוגיה של רקמות באיכות טובה ושלמות RNA כדי להקל על רכישת דגימות מיקרו-דיסקטיות לייזר באיכות גבוהה. שיטה זו רגישה ובלתי ניתנת לשחזור.זה יכול להיות מנוצל כדי לחקור מורפולוגיה הגידול הטרוגניות במודלים שונים של הגידול. מיקרו-דיסקט של רקמת גידול במוח קפואה היא טכניקה חסכונית ואמינה לבידוד אזורים אנטומיים נפרדים של אוכלוסיות תאים מרקמות הגידול כדי לחקור את הפרופילים המולקולריים שלהם. LMD יכול להיות מנוצל כדי להשיג ידע מכני מעמיק על האירועים המולקולריים המתבצעים במהלך התקדמות הגידול, והוא יכול לחשוף מטרות טיפוליות חדשניות.ביולומינציה ב-vivo של נטל הגידול בעכבר מגיעה לאות בין 10 ל-6 ו-10 ל-7. לשטוף פתרון טירוד מחומצן דרך מערכת הדם של העכבר נושא הגידול המתת דם עד הכבד והריאות נוקו לחלוטין מדם. המשך מושלם את החיה עם תמיסת סוכרוז 30% מומס בתמיסת טירוד במשך 15 דקות נוספות.כדי להעריך את ההצלחה של תפוצה, לאשר כי הצוואר, הזנב והרגליים נוקשים בסוף זרימת הדם. ואז לקצור את המוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולאחסן את המוח לילה בתסכול סוכרוז טרי 30%. כדי להתכונן להקפאה, ממלאים צנצנת עם isopentane-2-מתילבוטן קר ומ מניחים את הצנצנת לתוך מיכל מלא חנקן נוזלי.בעוד הממס מצמרר, להניף את המוח יבש על פיסת נייר מסנן ולמקם את המוח לתוך Cryomold שכותרתו. בזהירות כחמישה מיליליטר של טמפרטורה אופטימלית חיתוך בינוני למרכז Cryomold וממקמים את המוח לתוך התבנית בכיוון הרצוי. באמצעות מדפים נקיים, מניחים במהירות את הקריומאולד לתוך isopentane-2-מתילבוטן מצונן במשך 30 עד 40 שניות.לאחר שמדיום החיתוך התגבש, מעבירים את הקריומאלד לקרח יבש ועוטפים את הקריומולד ומצמידים רקמת מוח קפואה בנייר אלומיניום לאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לרכוש חלקי רקמת גידול במוח קפואים, תחילה להגדיר את הטמפרטורה של קריוסטט בין מינוס 20 למינוס 24 מעלות צלזיוס, ולה למקם את בלוק המדגם לתוך תא cryostat במשך 30 עד 60 דקות. בעוד המדגם הוא שיווי משקל, לנקות את התא ואת מחזיק הסכין עם 100% אתנול לרסס את מברשות החלק עם פתרון ניקוי RNase.כאשר המדגם מוכן, להסיר את התבנית ולהשתמש בינוני חיתוך טרי כדי לחבר את בלוק הרקמה הקפואה לדיסק הדגימה של cryostat. מניחים את הבלוק במחזיק הדיסק ומיישרים את הבלוק עם להב הסכין. לרכוש 10 חלקים מיקרומטר של המוח באמצעות אחת מברשות ללא Rnase כדי לשטח בזהירות uncurl חתיכות הרקמה על משטח החיתוך.כדי להרכיב את מקטעי רקמת המוח על השקופיות, לחץ בצורה חלקה על הצד הטעון באופן חיובי של שקופית זכוכית PEN ללא תווית RNase על החלקה על החלקה ולמקום את השקופית לתוך תיבת אחסון בתוך התא. לאחר איסוף כל השקופיות, מניחים את תיבת האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להמיס את מדיום החיתוך לפני ניתוח מיקרו לייזר, להטביע את השקופיות 30 שניות רציף יורד טבילות אתנול ואחריו כתם פתרון סגול קריסטל במשך 20 שניות וחמש שניות ב 0.5%eosin Y פתרון.בסוף הדגירה eosin Y, להשתמש בנייר מסנן כדי לחסום את השקופיות לייבש ולייבש את השקופיות ברצף עולה אתנול טבילות. לאחר טבילת אתנול של 60 שניות, שוטפים את השקופיות במיכל של קצילן במשך שלוש דקות. לאחר מכן, ייבשו את המגלשות על משטח נטול RNase בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות לפני שתתפסו את הדגימות במדיום הרכבה מוכן עם מים נטולי RNase.לאחר 10 עד 20 שניות, העבר את השקופיות לפלטפורמת המיקרו-דיסקטוריה של המיקרוסקופ. למיקרו-דיסקטה ללכידת לייזר, הפעל את הכוח לפני הפעלת הלייזר. לאחר מכן, הפעל את בקר המיקרוסקופ במחשב והתחל את תוכנת המיקרו-דיסקטוריה ללכידת לייזר.בחלונית 'בקרת מיקרוסקופ', בחרו בהגדלה של פי 10. תחת בקרת לייזר, הגדר את פרמטרי הלייזר עבור ניתוח רקמות ובחר תדר לייזר של 120 הרץ זרם לייזר של 100% עבור מיקרודיסציט לייזר מדויק, להגדיר את המהירות ל 10 ולהגדיר את הצמצם ל 10 מיקרומטר. ואז להגדיר את הכח ל53.טען את מלקט הרקמות שילכוד את הרקמה שלאחר המקטע ולחץ על לחצן ביטול הטעינה השני. החלף את האספן הריק בצינורות שטוחים נטולי DNase ו- Rnase 0.5 מיליליטר PCR המכילים 30 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לכל צינור. החזר את האספן למחשב ולחץ על המשך כדי להמשיך.טען את הדגימה המעובדת על המיקרוסקופ ולחץ על בטל טעינה בתוכנת המיקרו-דיסקטיקציה בלייזר. במעלה הדגימה אל מחזיק השקופית והצב את מחזיק השקופית על הבמה. לחץ על המשך כדי להמשיך ובחר צייר גזור בחלון גזור צורות.השתמש בפקדי המיקרוסקופ כדי למצוא את אזור העניין ולצייר חלוקה לרמות סביב אזור העניין. לאחר מכן בחר צינור מלקט יעד ולחץ על התחל לחתוך כדי להמשיך את המיקרו-דיסקקט של הרקמה. כאשר כל תחומי העניין נותחו, העבר את צינורות האספנים מהמחזיק לקרח יבש עד שהם יהיו במורד הזרם.כדי לרכוש רקמות עם מורפולוגיה מעולה ושלמות RNA, גישות תדלוק שונות הוערכו. כדי לנתח את אזורי העניין, יש צורך להכתים את הרקמות עם צבעים מזיקים עבור RNA. זיוף הבא של עכברים נושאי גידול עם פתרון טירוד ו 30% סוכרוז ואחריו דגירה לילה ב 30% סוכרוז תוצאות בשימור המורפולוגיה ושלמות RNA של רקמת העכבר.למרות קיבוע רקמת paraformaldehyde תוצאות מורפולוגיה רקמות באיכות גבוהה, שלמות RNA מושפע לרעה. גישות אחרות כגון שימוש דגירה פתרון טירוד, או פתרון טירוד בתוספת 30% דגירה פתרון סוכרוז אינם משפיעים על איכות RNA, אבל רזולוציה מופחתת במורפולוגיה רקמה הוא ציין. אם הרקמות אינן מותקנות עם מדיום הרכבה, החלקים מתייבשים והמורפולוגיה מתדרדרת תוך הרכבה של דגימות הרקמה עם 15% הרכבה בינונית מומסת במים שומרת על מורפולוגיה רקמה באיכות גבוהה.הדמיית מיקרוסקופ לכידת לייזר מיקרודיסקציה מאפשרת בחירה של רקמת הגידול עבור ניתוח. אזור זה של בחירת עניין לאחר מכן מאפשר ניתוח של תחומי עניין בתוך כל מדגם רקמה לניתוח שלמות RNA. שמירה על מורפולוגיה של רקמת גידול באיכות גבוהה ושלמות RNA היא קריטית.פתרון Tyrode ו 30% זלוף סוכרוז עם שימור לילה ב 30% סוכרוז משפר באופן משמעותי את מורפולוגיה רקמות עבור LMD. קיבעון ליומה מהיר, כתמים והתהוות עם פתרון GAN הוא צעד קריטי לשמירה על איכות ה-RNA ולמניעת היווים של סדקים בתוך הרקמה. אנו ממליצים חתך לפחות 2.5 פעמים 10 כדי 6 מיקרומטר מרובע הגידול הכולל לכל אזור רקמה כדי להשיג כמויות מתאימות של RNA הן בקרת איכות RNA וניתוח transcriptomic.LMD מאפשר ניתוח של מסלולי איתות מולקולריים המווסתים את הטרוגניות גליומה ופלישה אשר יכול לחשוף מטרות פוטנציאליות חדשניות לפיתוח תרגום עתידי במודלים גליומה פרה-קליניים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...