Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों( NIH/NINDS) अनुदान: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 से M.G.C. द्वारा समर्थित किया गया था; (NIH/NINDs) अनुदान R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 को P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (एनआईएच/एनसीआई) U01CA224160; न्यूरोसर्जरी विभाग, मिशिगन विश्वविद्यालय में रोगेल कैंसर केंद्र, चैडकड़ा फाउंडेशन, और लिआ के हैप्पी हार्ट्स फाउंडेशन को एमजीसी और पी.आर.एल. आरएनए बायोमेडिसिन ग्रांट F046166 को एमजीसी नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, UL1 TR002240 मिशिगन इंस्टीट्यूट फॉर क्लीनिकल एंड हेल्थ रिसर्च (MICHR), पोस्टडॉक्टोरल ट्रांसलेशनल स्कॉलर्स प्रोग्राम (पीटीएसपी) अनुदान, पोस्टडॉक्टोरल ट्रांसलेशनल स्कॉलर्स प्रोग्राम (पीटीएसपी) अनुदान, परियोजना F049768 मिशिगन फोर्ब्स कैंसर अनुसंधान संस्थान के ईसा पूर्व विश्वविद्यालय के लिए, एक चिकित्सक-अनुसंधान से वैज्ञानिक पुरस्कार अंधापन को रोकने के लिए, इंक (RPB), एनआईएच (एके) के NEI से अनुदान R01 EY022633, और आरपीबी से नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान । इस शोध ने विजन रिसर्च कोर (P30 EY007003), और कैंसर सेंटर रिसर्च कोर (P30 CA046592) का उपयोग किया। एके को ए अल्फ्रेड तौबमैन मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट से मिसेज विलियम डेविडसन इमर्जिंग स्कॉलर अवॉर्ड का समर्थन प्राप्त है ।

यहां वर्णित सभी तरीकों कि प्रयोगात्मक जानवरों का उपयोग मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
नोट: जेम या स्थिर लाइनों से उत्पन्न ग्लि?...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

ग्लियोमा विषमता और आक्रमण अंतर्निहित आणविक तंत्रों को समझना उपन्यास चिकित्सीयलक्ष्यों कोउजागर करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व पूर्ण है । इस पांडुलिपि में, हम लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एल?...

ग्लियोमास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सबसे आक्रामक प्राथमिक ट्यूमर हैं। वे अत्यधिक आक्रामक और विषम1हैं । ट्यूमर के सेलुलर और आणविक घटकों का विश्लेषण उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट करेगा।
वर्तमान में उपलब्ध विभिन्न तरीकों में, जमे हुए ब्रेन ट्यूमर ऊतक के लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय तकनीक है जो ट्यूमर ऊतकों से असतत शारीरिक क्षेत्रों या विशिष्ट कोशिका आबादी के अलगाव को उनके आणविक प्रोफ़ाइल2,,3का अध्ययन करने की अनुमति देती है। एलएमडी चयनित एकल कोशिकाओं या बहुकोशिकीय संरचनाओं4,5के एमआरएनए जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के विश्लेषण की अनुमति देता है । एलएमडी का उपयोग ट्यूमर प्रगति के दौरान होने वाली आणविक घटनाओं के बारे में गहराई से यंत्रवादी ज्ञान प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए-गुणवत्ता6के इष्टतम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए ट्यूमर ऊतकों के प्रसंस्करण में सुधार आवश्यक है। यद्यपि पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण रूपात्मक विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा विकल्प है, इन शर्तों के तहत आरएनए गुणवत्ता प्रभावित और अपमानित होती है, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए-सीक्यू विश्लेषण के लिए खराब आरएनए गुणवत्ता होती है। जमे हुए ऊतक वर्गों का उपयोग बर्फ क्रिस्टल गठन से बचा जाता है, जो कोशिका झिल्ली को तोड़ सकता है और कोशिकाओं के भीतर छेद का उत्पादन कर सकता है, और आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण7के लिए सबसे अच्छा विकल्प बना हुआ है।
यहां, हम एलएमडी के लिए जमे हुए माउस ब्रेन ट्यूमर ऊतकों को संसाधित करने के लिए एक अनुकूलित अनुभाग निर्धारण और धुंधला विधि का वर्णन करते हैं। ऊतक में बनाने से बर्फ क्रिस्टल को रोकने के लिए, हम 30% सुक्रोज के समाधान के साथ चूहों को व्याप्त करते हैं। यह समाधान ध्रुवीय पानी के अणुओं के बीच बातचीत को बाधित करता है और ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए बर्फ क्रिस्टल के गठन को रोकता है। ट्यूमर के भीतर कोशिकाओं या शारीरिक रूप से विशिष्ट क्षेत्रों की विशिष्ट आबादी को अलग करने और प्राप्त करने के लिए ऊतक धुंधला करना आवश्यक है। आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए ऊतक को अहानिकर रंगों से ठीक करना और दाग देना आवश्यक है। यह पहले दिखाया गया है कि हेमेटक्सीलिन/eosin (एच & ई) के साथ धुंधला ऊतक आरएनए अखंडता8बिगड़ती है । हमने इथेनॉल, क्रेसिल वायलेट 4% और eosin Y 0.5% समाधानों के साथ ब्याज के ऊतकों को ठीक और दाग दिया। क्रेसिल वायलेट एक एसिडोफिलिक डाई है जो कोशिका नाभिक को गहरे नीले रंग से दाग देता है। Eosin Y एक basophilic रंग है जो कोशिकाओं के बुनियादी घटकों को दाग देता है, जो साइटोप्लाज्म और अन्य सेलुलर संरचनाओं8के बीच अंतर प्रदान करता है। दोनों रंग इथेनॉल में घुलनशील हैं और आरएनए गुणवत्ता को खराब नहीं करते हैं। ऊतक क्षति से बचने और सेलुलर संरचनाओं के उच्च ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन को बनाए रखने के लिए, हमने एलएमडी9से पहले ऊतक वर्गों पर मुहिम शुरू की।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

ग्लियोमास प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर हैं जो उनकी आक्रामकता और विषमता की विशेषता है। विशिष्ट हिस्टोलॉजिकल पैटर्न जैसे छद्मपालीसेड्स, माइक्रोवैस्कुलर प्रसार, मेसेंचिमल परिवर्तन और परिगलन उच्च ग्रेड ग्लियोमा की हिस्टोलॉजिकल विषमता की विशेषता है। हमारी प्रयोगशाला ने दिखा दिया है कि ऑनकोस्ट्रीम नाम की मेसेनचिमल कोशिकाओं के उच्च घनत्व की उपस्थिति ट्यूमर द्रोह से सहसंबंधित है। हमने ग्लियोमा के विकास और आक्रमण को रेखांकित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण विकसित किया है । यहां, हम एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग अंतर-ट्यूमर विषम बहुकोशिकीय संरचनाओं (यानी, मेसेंचिमल क्षेत्रों या ट्यूमर आक्रमण के क्षेत्रों) की अंतर mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए करता है। यह विधि अच्छे ऊतक हिटोलॉजी और आरएनए अखंडता को बनाए रखता है। परफ्यूजन, ठंड, एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और धुंधला को आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और उच्च गुणवत्ता वाले लेजर माइक्रोडिसेक्शन नमूने प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। परिणामों से संकेत मिलता है कि 30% सुक्रोज का उपयोग करके ग्लियोमा असर चूहों का परफ्यूजन अच्छी आकृति विज्ञान और आरएनए गुणवत्ता प्रदान करता है। इसके अलावा, आरएनए अखंडता को संरक्षित करते समय, 4% क्रेसिल वायलेट और 0.5% eosin के साथ ट्यूमर वर्गों को धुंधला करना अच्छा परमाणु और सेलुलर धुंधला होता है। वर्णित विधि संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य है और इसका उपयोग विभिन्न ट्यूमर मॉडलों में ट्यूमर आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, हम एलएमडी करने के लिए एक पूर्ण विधि का वर्णन करते हैं जो ठोस ट्यूमर के भीतर विषम बहुकोशिकीय संरचनाओं की आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए अनुक्रमण के लिए आकृति विज्ञान और आरएनए गुणवत्ता को बरकरार रखता है।

हमारी प्रयोगशाला ने स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसेज सिस्टम(चित्रा 1ए)का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जेम्स) उत्पन्न किया है। इस प्रणाली नवजात चूहों में तं?...

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Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) एक संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य तकनीक है जिसका उपयोग ग्लियोमा विषमता और आक्रमण में मध्यस्थता करने वाले रास्तों को उजागर करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम ट्रांसपोमिक विश्लेषण के बाद लेजर एलएमडी का उपयोग करके ग्लियोमा ऊतक से असतत क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

इंटेरामोरल विषमता, ओंकोस्ट्रीम और आक्रमण के स्थानिक और आणविक लक्षण वर्णन के लिए ग्लियोमा उपक्षेत्रों का लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

यह प्रोटोकॉल इंट्राट्यूमर विषमता की अंतर एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है, जैसे कि मेसेंकिमल कोशिकाओं के संचय के क्षेत्र या ट्यूमर आक्रमण के क्षेत्र। इस विधि को उच्च गुणवत्ता वाले लेजर माइक्रोडिसेक्शन नमूनों के अधिग्रहण को सुविधाजनक बनाने के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले ऊतक हिसटोलॉजी और आरएनए अखंडता को संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया है। यह विधि संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य है।इसका उपयोग विभिन्न ट्यूमर मॉडलों में ट्यूमर आकृति विज्ञान और विषमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जमे हुए ब्रेन ट्यूमर ऊतकों के लेजर microdissection ट्यूमर ऊतकों से सेल आबादी के असतत शारीरिक क्षेत्रों के अलगाव के लिए एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय तकनीक उनके आणविक प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए है । एलएमडी का उपयोग ट्यूमर प्रगति के दौरान होने वाली आणविक घटनाओं के बारे में गहराई से मशीनी ज्ञान हासिल करने के लिए किया जा सकता है, और उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट कर सकता है।माउस ट्यूमर बोझ के वीवो बायोल्यूमिनेसेंस में एक बार 10 से छह और एक बार 10 से 7 फोटॉन के बीच एक संकेत तक पहुंचता है । जब तक यकृत और फेफड़ों को रक्त से पूरी तरह से साफ नहीं किया गया है तब तक इच्छामृत्यु ट्यूमर-असर माउस की संचार प्रणाली के माध्यम से ऑक्सीजनयुक्त टाइरोड समाधान फ्लश करें। अतिरिक्त 15 मिनट के लिए टायरोड समाधान में भंग 30% सुक्रोज समाधान के साथ जानवर को काबू करना जारी रखें।परफ्यूजन की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए, पुष्टि करें कि परिसंचरण के अंत में गर्दन, पूंछ और पैर कठोर हैं। फिर मानक प्रोटोकॉल के अनुसार मस्तिष्क की कटाई करें और मस्तिष्क को रात भर ताजा 30% सुक्रोज समाधान में स्टोर करें। क्रायोप्रिजर्वेशन की तैयारी के लिए, एक जार को ठंडे आइसोपेन-2-मिथाइलबुटेन के साथ भरें और जार को तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में रखें।जबकि विलायक हल्का है, फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर मस्तिष्क सूखी दाग और एक लेबल Cryomold में मस्तिष्क जगह है । क्रायोमोल्ड के केंद्र में मध्यम काटने वाले इष्टतम तापमान के लगभग पांच मिलीलीटर पर ध्यान से और वांछित अभिविन्यास में मस्तिष्क को मोल्ड में रखें। साफ संदंश का उपयोग करके, क्रायोमोल्ड को ठंडा आइसोपेन-2-मिथाइलबुटेन में 30 से 40 सेकंड के लिए रखें।एक बार काटने के माध्यम जम गया है, सूखी बर्फ पर क्रायोमोल्ड हस्तांतरण और शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में क्रायोमोल्ड और स्नैप जमे हुए मस्तिष्क ऊतक लपेटो । जमे हुए ब्रेन ट्यूमर ऊतक वर्गों को प्राप्त करने के लिए, पहले शून्य से 20 और शून्य से 24 डिग्री सेल्सियस के बीच एक क्रायोस्टेट का तापमान निर्धारित करें, और नमूना ब्लॉक को 30 से 60 मिनट के लिए क्रायोस्टेट कक्ष में रखें। जबकि नमूना बराबर है, कक्ष और चाकू धारक को 100% इथेनॉल से साफ करें और आरएनएईई सफाई समाधान के साथ अनुभाग ब्रश स्प्रे करें।जब नमूना तैयार हो जाए, तो मोल्ड को हटा दें और क्रायोस्टेट के नमूना डिस्क में जमे हुए ऊतक ब्लॉक को संलग्न करने के लिए ताजा कटिंग माध्यम का उपयोग करें। डिस्क होल्डर में ब्लॉक रखें और चाकू ब्लेड से ब्लॉक को संरेखित करें। मस्तिष्क के 10 माइक्रोमीटर वर्गों को प्राप्त करें आरएनएएस-मुक्त ब्रश में से एक का उपयोग करके ऊतक के टुकड़ों को काटने की सतह पर सावधानीपूर्वक समतल और अनकरल करें।स्लाइड पर मस्तिष्क ऊतक वर्गों माउंट करने के लिए, आसानी से अनुभाग पर एक लेबल RNase मुक्त कलम ग्लास स्लाइड के सकारात्मक आरोप लगाया पक्ष प्रेस और कक्ष के अंदर एक भंडारण बॉक्स में स्लाइड जगह है । जब सभी स्लाइड एकत्र हो गए हैं, तो भंडारण बॉक्स को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। लेजर माइक्रो विच्छेदन से पहले काटने के माध्यम को भंग करने के लिए, 30 सेकंड अनुक्रमिक उतरते इथेनॉल विसर्जन में स्लाइड जलमग्न क्रिस्टल वायलेट समाधान 20 सेकंड के लिए धुंधला और 0.5% eosin Y समाधान में पांच सेकंड के बाद।eosin Y इनक्यूबेशन के अंत में, स्लाइड सूखी ब्लॉक और अनुक्रमिक आरोही इथेनॉल विसर्जन में स्लाइड निर्जलित करने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें । 60 सेकंड के इथेनॉल विसर्जन के बाद, तीन मिनट के लिए जाइलीन के एक कंटेनर में स्लाइड कुल्ला। आगे की स्लाइड्स में आरनैसे-फ्री पानी से तैयार बढ़ते मीडियम में सैंपल बढ़ने से पहले 10 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर आरएनएसई-फ्री सरफेस को सुखा लें ।10 से 20 सेकंड के बाद, स्लाइड को माइक्रोस्कोप माइक्रोडिसेक्शन प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित करें। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के लिए, लेजर चालू करने से पहले शक्ति चालू करें। इसके बाद, कंप्यूटर में माइक्रोस्कोप नियंत्रक चालू करें और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन सॉफ्टवेयर शुरू करें।माइक्रोस्कोप कंट्रोल पैनल में 10 गुना आवर्धन का चयन करें। लेजर नियंत्रण के तहत, ऊतक विच्छेदन के लिए लेजर पैरामीटर निर्धारित करें और 120 हर्ट्ज की लेजर आवृत्ति और सटीक लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए 100% की लेजर धारा का चयन करें, गति को 10 सेट करें और एपर्चर को 10 माइक्रोमीटर तक सेट करें। फिर 53 करने के लिए शक्ति निर्धारित करते हैं।ऊतक कलेक्टर लोड करें जो अनुभाग के बाद ऊतक को कैप्चर करेगा और दूसरा अनलोड बटन पर क्लिक करेगा। खाली कलेक्टर को DNase और Rnase-मुक्त 0.5 मिलीलीटर पीसीआर फ्लैटहेड ट्यूबों के साथ बदलें जिसमें लाइसिस बफर प्रति ट्यूब के 30 माइक्रोलीटर होते हैं। कलेक्टर को मशीन पर लौटाकर आगे बढ़ने पर क्लिक करें।प्रसंस्कृत नमूने को माइक्रोस्कोप पर लोड करें और लेजर माइक्रोडिसेक्शन सॉफ्टवेयर में अनलोड पर क्लिक करें। स्लाइड धारक पर नमूना ऊपर और मंच पर स्लाइड धारक जगह है । आगे बढ़ने के लिए जारी रखें और कट आकृतियों खिड़की में ड्रा कट का चयन करें ।ब्याज के क्षेत्र को खोजने और ब्याज के क्षेत्र के आसपास एक रूपरेखा आकर्षित करने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण का उपयोग करें। फिर एक गंतव्य कलेक्टर ट्यूब का चयन करें और ऊतक माइक्रोडिसेक्शन को आगे बढ़ाने के लिए स्टार्ट कट पर क्लिक करें। जब ब्याज के सभी क्षेत्रों को विच्छेदित कर दिया गया है, तो धारक से कलेक्टर ट्यूबों को सूखी बर्फ पर स्थानांतरित करें जब तक कि वे डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण न कर लें।एक बेहतर आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता के साथ ऊतकों को प्राप्त करने के लिए, विभिन्न पर्फ्यूजन दृष्टिकोणों का मूल्यांकन किया गया था। ब्याज के क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए, आरएनए के लिए अहानिकर रंगों के साथ ऊतकों को दाग देना आवश्यक है। टाइरोड समाधान और 30% सुक्रोज के साथ ट्यूमर असर चूहों के बाद के पर्फ्यूजन के बाद 30% सुक्रोज में एक रात इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप माउस ऊतक की आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता के संरक्षण में परिणाम होता है।हालांकि पैराफॉर्मलडिहाइड ऊतक निर्धारण के परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान होते हैं, आरएनए अखंडता नकारात्मक रूप से प्रभावित होती है। इनक्यूबेशन टाइरोड समाधान का उपयोग करना, या टाइरोड समाधान प्लस 30% सुक्रोज समाधान इनक्यूबेशन का उपयोग करने जैसे अन्य दृष्टिकोण आरएनए गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करते हैं, लेकिन ऊतक आकृति विज्ञान में एक कम संकल्प मनाया जाता है। यदि ऊतकों को बढ़ते माध्यम के साथ नहीं रखा जाता है, तो वर्ग निर्जलित हो जाते हैं और आकृतिविज्ञान खराब हो जाता है जबकि पानी में भंग 15% बढ़ते मध्यम के साथ ऊतक के नमूनों का बढ़ना उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान को बनाए रखता है।लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप इमेजिंग विच्छेदन के लिए ट्यूमर ऊतक के चयन की अनुमति देता है। ब्याज चयन के इस क्षेत्र तो आरएनए अखंडता विश्लेषण के लिए प्रत्येक ऊतक नमूने के भीतर ब्याज के क्षेत्रों के विच्छेदन की अनुमति देता है । एक उच्च गुणवत्ता ट्यूमर ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता को बनाए रखने के महत्वपूर्ण है।टाइरोड समाधान और 30% सुक्रोज में रातोंरात संरक्षण के साथ 30% सुक्रोज परफ्यूजन एलएमडी के लिए ऊतक आकृति विज्ञान में काफी सुधार करता है। जल्दी lyoma निर्धारण, धुंधला और GAN समाधान के साथ बढ़ते आरएनए गुणवत्ता के संरक्षण और ऊतक के भीतर बनाने से दरारें रोकने के लिए महत्वपूर्ण कदम है । हम आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण दोनों के लिए आरएनए की उचित मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रति ऊतक क्षेत्र 6 वर्ग माइक्रोमीटर कुल ट्यूमर को कम से कम 2.5 गुना 10 खंडित करने की सलाह देते हैं।एलएमडी आणविक सिग्नलिंग रास्तों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो ग्लियोमा विषमता और आक्रमण को विनियमित करता है जो प्रीक्लिनिकल ग्लियोमा मॉडल में भविष्य के अनुवाद विकास के लिए उपन्यास संभावित लक्ष्यों को प्रकट कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

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लेजर कैद की Microdissection ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

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कुल शाही सेना अलगाव और डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए कैद गैर अलहदा माउस ब्रेन क्षेत्र के Microdissection के लिए लेजर माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

लेजर या न्यूरॉन्स घाव मस्तिष्क की चोट के बाद जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए एकल न्यूरॉन्स के समृद्ध आबादी का कब्जा Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

संस्कृति में विभेदित मानव Neuroprogenitor कोशिकाओं से न्यूरॉन्स की लेजर कब्जा MICRODISSECTION

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा माउस स्पाइनल कॉर्ड मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए आरएनए का उत्पादन

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

लेजर कैद Microdissection के साथ नाक बायोप्सी संयुक्त माध्यम से प्राप्त की घ्राण न्यूरॉन्स: मानसिक विकार में उपचार प्रतिक्रिया का अध्ययन के लिए एक संभावित दृष्टिकोण

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

लेजर कैद Microdissection - व्यक्तिगत डोपामिन न्यूरॉन्स के अलगाव और पूरे उदर tegmental क्षेत्र के एक प्रदर्शन

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

स्टीरियोटैक्टिक एटलस-निर्देशित लेजर दर्दनाक चोट से प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्रों के Microdissection पर कब्जा

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

लेजर के अनुकूलन-कब्जा Microdissection के अलगाव के लिए प्रवेश गैंग्लिया से ताजा-जमे हुए मानव ऊतक

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम में लेजर कैप्चर Microdissected Purkinje कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता आरएनए अलगाव के लिए एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...