Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
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Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dei National Institutes of Health (NIH/NINDS): R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Concede R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; il Dipartimento di Neurochirurgia, il Rogel Cancer Center dell'Università del Michigan, la Fondazione ChadTough e la Fondazione Happy Hearts di Leah a M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 a M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 per l'Istituto per la ricerca clinica e sanitaria (MICHR), il programma di borse di studio per la traduzione post-istituzionale (PTSP), grant, Grant, Grant, Grant, Grant, Il progetto F049768 presso l'Università del Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Physician-Scientist Award della Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), concede R01 EY022633 dal NEI del NIH (AK), e una sovvenzione illimitata di RPB al Dipartimento di Oftalimologia e Scienze Visive. Questa ricerca ha utilizzato il Vision Research Core (P30 EY007003) e il Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK è sostenuto dal premio William Davidson Emerging Scholar Award dell'A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

Tutti i metodi descritti qui che utilizzano animali sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
NOTA: le neurosfere di Glioma generate da un GEMM o linee stabili possono essere utilizzate per l'innesto del tumore intracranico nei topi10 e lavorate per il sequenziamento di LMD e RNA. Queste cellule estuono constitutivemente luciferata e proteine GFP, che saranno ulteriormente utilizzate per l'a...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. 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Comprendere i meccanismi molecolari alla base dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma è di fondamentale importanza per scoprire nuovi obiettivi terapeutici13. In questo manoscritto, descriviamo un metodo dettagliato e ottimizzato per analizzare il paesaggio molecolare dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma usando la microdissezione di cattura laser (LMD) seguita dall'analisi trascrittomica.
La microdissezione di cattura laser (LMD) può essere utilizzata...

I gliomi sono i tumori primari più aggressivi del sistema nervoso centrale. Sono altamente invasivi ed eterogenei1. L'analisi dei componenti cellulari e molecolari del tumore rivelerà nuovi bersagli terapeutici.
Tra i diversi metodi attualmente disponibili, la microdissezione di cattura laser (LMD) del tessuto tumorale del cervello congelato è una tecnica affidabile e conveniente che consente l'isolamento di aree anatomiche discrete o specifiche popolazioni cellulari dai tessuti tumorali per studiare il loro profilo molecolare2,3. LMD consente l'analisi dei profili di espressione genica mRNA di singole cellule selezionate o strutture multicellulari4,5. LMD può essere utilizzato per acquisire conoscenze meccanicistiche approfondite sugli eventi molecolari che si svolgono durante la progressione del tumore. Il miglioramento nella lavorazione dei tessuti tumorali è necessario per ottenere una risoluzione ottica ottimale della morfologia dei tessuti e della qualità dell'RNA6. Anche se la fissazione della paraformaldeide è l'opzione migliore per l'analisi morfologica, la qualità dell'RNA è influenzata e degradata in queste condizioni, con conseguente scarsa qualità dell'RNA per l'analisi RNA-seq. L'uso di sezioni di tessuto congelato evita la formazione di cristalli di ghiaccio, che potrebbero rompere le membrane cellulari e produrre fori all'interno delle cellule, e rimane l'opzione migliore per l'analisi RNA-Seq7.
Qui, descriviamo un metodo ottimizzato di fissazione e colorazione delle sezioni per elaborare i tessuti tumorali del cervello del topo congelato per LMD. Per evitare che i cristalli di ghiaccio si formino nel tessuto, abbiamo perfuso i topi con una soluzione di saccarosio del 30%. Questa soluzione interrompe le interazioni tra molecole di acqua polare e impedisce la formazione di cristalli di ghiaccio, preservando la morfologia dei tessuti. La colorazione dei tessuti è necessaria per differenziare e ottenere una popolazione specifica di cellule o aree anatomicamente distinte all'interno del tumore. È essenziale fissare e macchiare il tessuto con coloranti innocui per mantenere l'integrità dell'RNA. È stato precedentemente dimostrato che la colorazione del tessuto con ematossina/eosina (H&E) deteriora l'integrità dell'RNA8. Abbiamo fissato e macchiato il tessuto di interesse con etanolo, Cresyl viola 4% e eosin Y 0.5% soluzioni. Cresyl violet è un colorante acidofilo che macchia il nucleo cellulare con un colore blu scuro. Eosin Y è un coloranti basofilo che macchia i componenti di base delle cellule, fornendo una distinzione tra citoplasma e altre strutture cellulari8. Entrambi i coloranti sono solubili in etanolo e non deteriorano la qualità dell'RNA. Per evitare danni ai tessuti e mantenere un'elevata risoluzione ottica delle strutture cellulari, abbiamo montato le sezioni di tessuto primadell'LMD 9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

I gliomi sono tumori cerebrali primari caratterizzati dalla loro invasività e eterogeneità. Modelli istologici specifici come pseudopalisades, proliferazione microvascolare, trasformazione mesenchymic e necrosi caratterizzano l'eterogeneità istologica dei gliomi di alta qualità. Il nostro laboratorio ha dimostrato che la presenza di alte densità di cellule mesenchymal, chiamate oncostream, correla con la malignità tumorale. Abbiamo sviluppato un approccio unico per comprendere i meccanismi alla base della crescita e dell'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo completo che utilizza la microdissezione di cattura laser (LMD) e il sequenziamento dell'RNA per analizzare l'espressione mRNA differenziale delle strutture multicellulari eterogenee intra-tumorali (cioè aree mesenchymal o aree di invasione del tumore). Questo metodo mantiene una buona istologia dei tessuti e l'integrità dell'RNA. Perfusione, congelamento, incorporamento, sezionamento e colorazione sono stati ottimizzati per preservare la morfologia e ottenere campioni di microdissezione laser di alta qualità. I risultati indicano che la perfusione di topi portanti con glioma utilizzando il 30% di saccarosio fornisce una buona morfologia e qualità dell'RNA. Inoltre, colorare le sezioni tumorali con 4% Cresyl viola e 0.5% eosina si traduce in una buona colorazione nucleare e cellulare, pur preservando l'integrità dell'RNA. Il metodo descritto è sensibile e altamente riproducibile e può essere utilizzato per studiare la morfologia tumorale in vari modelli tumorali. In sintesi, descriviamo un metodo completo per eseguire LMD che conserva la morfologia e la qualità dell'RNA per il sequenziamento per studiare le caratteristiche molecolari delle strutture multicellulari eterogenee all'interno dei tumori solidi.

Il nostro laboratorio ha generato un modello murino geneticamente ingegnerizzato (GEMM) utilizzando il sistema di trasposasi di bellezza del sonno (Figura 1A). Questo sistema incorpora specifiche alterazioni genetiche nel genoma delle cellule progenitrici neurali nei topi neotopatici. Queste cellule progenitrici alterate formano tumori glioma endogeni. Le sequenze di plasmide utilizzate per generare i tumori erano: (1) pT2C-LucPGK-SB100X per ...

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Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Questo protocollo utilizza la microdisezione laser e il sequenziamento dell'RNA per analizzare l'espressione differenziale dell'mRNA dell'eterogeneità intratumorale, come aree di accumulo di cellule mesenchimali o aree di invasione tumorale. Questo metodo è stato ottimizzato per preservare l'istologia tissutale di buona qualità e l'integrità dell'RNA per facilitare l'acquisizione di campioni di microdisezione laser di alta qualità. Questo metodo è sensibile e altamente riproducibile.Può essere utilizzato per studiare la morfologia e l'eterogeneità del tumore in vari modelli tumorali. La microdisezione laser del tessuto tumorale cerebrale congelato è una tecnica economica e affidabile per l'isolamento di aree anatomiche discrete delle popolazioni cellulari dai tessuti tumorali per studiarne i profili molecolari. L'LMD può essere utilizzato per acquisire una conoscenza meccanicistica approfondita degli eventi molecolari che si svolgono durante la progressione tumorale e potrebbe rivelare nuovi obiettivi terapeutici.Una bioluminescenza in vivo del peso tumorale del topo raggiunge un segnale tra uno per 10 e il sei e uno per 10 al 7 ° fotoni. Lavare la soluzione di tirodi ossigenati attraverso il sistema circolatorio del topo che porta tumore eutanasiato fino a quando il fegato e i polmoni non sono stati completamente liberati dal sangue. Continuare a perfondere l'animale con una soluzione di saccarosio al 30% sciolta in soluzione di tirolo per altri 15 minuti.Per valutare il successo della perfusione, confermare che il collo, la coda e le gambe sono rigidi alla fine della circolazione. Quindi raccogliere il cervello secondo i protocolli standard e conservare il cervello durante la notte in una fresca soluzione di saccarosio al 30%. Per prepararsi alla crioconservazione, riempire un barattolo con isopentane-2-metilbutano freddo e posizionare il barattolo in un contenitore pieno di azoto liquido.Mentre il solvente è agghiacciante, asciugare il cervello su un pezzo di carta da filtro e posizionare il cervello in un Cryomold etichettato. Con attenzione a circa cinque millilitri di mezzo di taglio della temperatura ottimale al centro del Cryomold e posizionare il cervello nello stampo nell'orientamento desiderato. Utilizzando forcep pulite, posizionare rapidamente il Cryomold nell'isopentane-2-metilbutano refrigerato per 30-40 secondi.Una volta che il mezzo di taglio si è solidificato, trasferire il Cryomold sul ghiaccio secco e avvolgere il Cryomold e scattare il tessuto cerebrale congelato in un foglio di alluminio per meno 80 gradi Celsius. Per acquisire sezioni di tessuto tumorale cerebrale congelate, impostare prima la temperatura di un criostato tra meno 20 e meno 24 gradi Celsius e posizionare il blocco campione nella camera criostatica per 30-60 minuti. Mentre il campione è equilibrante, pulire la camera e il portaprofestelli con etanolo al 100% e spruzzare le spazzole di sezione con soluzione detergente RNasi.Quando il campione è pronto, rimuovere lo stampo e utilizzare un mezzo di taglio fresco per attaccare il blocco di tessuto congelato al disco campione del criostato. Posizionare il blocco nel supporto del disco e allineare il blocco con la lama del coltello. Acquisire sezioni di 10 micrometri del cervello utilizzando uno dei pennelli senza Rnase per appiattire e disartiare accuratamente i pezzi di tessuto sulla superficie di taglio.Per montare le sezioni del tessuto cerebrale sulle diapositive, premere senza problemi il lato caricato positivamente di uno scivolo di vetro PEN senza RNasi etichettato sulla sezione e posizionare lo scivolo in una scatola di stoccaggio all'interno della camera. Una volta raccolte tutte le diapositive, posizionare la casella di archiviazione a meno 80 gradi Celsius. Per sciogliere il mezzo di taglio prima della microsezione laser, immergere le diapositive in immersioni sequenziali di etanolo decrescente di 30 secondi seguite da colorazione della soluzione di viola cristallo per 20 secondi e cinque secondi in soluzione 0,5% eosina Y.Al termine dell'incubazione eosina Y, utilizzare carta da filtro per bloccare gli scivoli asciutti e disidratare le diapositive in immersioni sequenziali ascendenti all'etanolo. Dopo l'immersione in etanolo di 60 secondi, sciacquare le diapositive in un contenitore di xilene per tre minuti. Successivamente, asciugare i vetrini su superficie priva di RNasi a temperatura ambiente per 10 secondi prima di montare i campioni in mezzo di montaggio preparato con acqua priva di RNasi.Dopo 10-20 secondi, trasferire le diapositive sulla piattaforma di microscopio per la microscopia. Per la microdisezione di cattura laser, accendere l'alimentazione prima di accendere il laser. Quindi, accendere il controller del microscopio nel computer e avviare il software di microdisezione di acquisizione laser.Nel pannello Controllo microscopio selezionare l'ingrandimento 10 volte superiore. In Controllo laser impostare i parametri laser per la dissezione dei tessuti e selezionare una frequenza laser di 120 hertz e una corrente laser del 100%Per una microdisezione laser accurata, impostare la velocità su 10 e impostare l'apertura su 10 micrometri. Quindi impostare la potenza su 53.Caricare il raccoglitore di tessuti che acquisirà il tessuto seguendo la sezione e fare clic sul secondo pulsante Scarica. Sostituire il collettore vuoto con tubi a testa piatta PCR da 0,5 millilitri senza DNasi e Rnase contenenti 30 microlitri di tampone di lisi per tubo. Riportare il raccoglitore alla macchina e fare clic su continua a procedere.Caricare il campione elaborato sul microscopio e fare clic su Scarica nel software di microdisezione laser. Su per il campione sul supporto dello scivolo e posizionare il supporto dello scivolo sul palco. Fate clic su Continua (Continue) per procedere e selezionate Disegno taglio (Draw Cut) nella finestra Taglia forme (Cut Shapes).Utilizzare i controlli del microscopio per trovare l'area di interesse e tracciare un profilo intorno alla regione di interesse. Quindi selezionate un tubo di raccolta di destinazione e fate clic su Avvia taglio (Start Cut) per procedere alla microdisezione del tessuto. Una volta sezionate tutte le aree di interesse, trasferire i tubi di collettore dal supporto sul ghiaccio secco fino a quando non sono a valle.Per acquisire tessuti con una morfologia superiore e integrità dell'RNA, sono stati valutati vari approcci di perfusione. Per sezionare le aree di interesse, è necessario macchiare i tessuti con coloranti innocui per l'RNA. La successiva perfusione di topi portanti di tumore con soluzione di tirodi e 30% di saccarosio seguita da un'incubazione notturna nel 30% di saccarosio porta alla conservazione della morfologia e dell'integrità dell'RNA del tessuto del topo.Sebbene la fissazione del tessuto paraformaldeide si traduce in una morfologia dei tessuti di alta qualità, l'integrità dell'RNA è influenzata negativamente. Altri approcci come l'uso di un'incubazione di soluzione di tiroide o soluzione di tirolo più il 30% di incubazioni di soluzione di saccarosio non influenzano la qualità dell'RNA, ma si osserva una risoluzione ridotta nella morfologia dei tessuti. Se i tessuti non sono montati con mezzo di montaggio, le sezioni si disidratano e la morfologia si deteriora durante il montaggio dei campioni di tessuto con il mezzo di montaggio del 15% sciolto in acqua mantiene una morfologia tissutale di alta qualità.L'imaging al microscopio a microscopia a cattura laser consente la selezione del tessuto tumorale per la dissezione. Questa selezione della regione di interesse consente quindi la dissezione delle aree di interesse all'interno di ciascun campione di tessuto per l'analisi dell'integrità dell'RNA. Mantenere una morfologia del tessuto tumorale di alta qualità e l'integrità dell'RNA è fondamentale.La soluzione di tirodi e la perfusione di saccarosio al 30% con conservazione notturna nel 30% di saccarosio migliorano significativamente la morfologia dei tessuti per l'LMD. La rapida fissazione, colorazione e montaggio del licoma con la soluzione GAN è un passo fondamentale per preservare la qualità dell'RNA e prevenire la formazione di crepe all'interno del tessuto. Si consiglia di sessare almeno 2,5 per 10 al 6 ° micrometro quadrato tumore totale per area tissutale per ottenere quantità appropriate di RNA sia per il controllo qualità dell'RNA che per l'analisi trascritomica.LMD consente l'analisi delle vie di segnalazione molecolare che regolano l'eterogeneità e l'invasione del glioma che potrebbero rivelare nuovi potenziali obiettivi per il futuro sviluppo traslizionale nei modelli di glioma preclinico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Un protocollo di acciaio inox per l'isolamento di RNA di alta qualità da Laser catturare cellule Microdissected Purkinje nel cervelletto umano Post-Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...