Name: laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion at JoVE

작업은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, (NIH / NINDS) 보조금: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 M.G.C.; (NIH/닌드) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311을 P.R.L.에 부여합니다. (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; 미시간 대학의 로겔 암 센터, 채드터프 재단, 레아의 해피 하트 재단에서 M.G.C. 및 P.R.L. RNA 생물 의학 그랜트 F046166에 신경 외과의 학과, UL1 TR002240 미시간 임상 및 건강 연구 (MICHR), 연구 및 건강 연구 (MICHR) 프로젝트 F049768 미시간 포브스 암 연구소의 A.C. 대학, 실명을 방지하기 위해 연구에서 의사 - 과학자 상, Inc., Inc.,(RPB), NIH의 NEI에서 R01 EY022633을 부여 (AK), 및 안과 및 시각 과학의 부서에 RPB에서 무제한 보조금. 이 연구는 비전 연구 코어 (P30 EY007003) 및 암 센터 연구 코어 (P30 CA046592)를 활용했습니다. AK는 A. 알프레드 타우브만 의학 연구소에서 부인 윌리엄 데이비슨 신흥 학자 상에 의해 지원됩니다.

실험 동물을 사용하는 여기에 설명된 모든 방법은 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: GEMM 또는 안정된 선으로부터 생성된 신경구는 마우스10에서 두개내 종양 생착에 사용될 수 있고 LMD 및 RNA 시퀀싱을 위해 처리될 수 있다. 이러한 세포는 반딧불 루시퍼라아제 및 GFP 단백질을 구성적으로 표현하며, 이는 종양 ?...

<ol>
	<li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy.">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Microdissection.">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li><li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection.">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li><li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples.">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas.">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li><li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions.">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li><li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection.">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li><li>N&#250;&#241;ez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response.">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+Big+data+from+small+samples.">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li><li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing.">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li><li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection.">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li></ol>

신경교종 이질성 및 침략의 근본적인 분자 기전을 이해하는 것은 새로운 치료표적13을밝히는 것이 매우 중요하다. 이 원고에서는 레이저 포획 미세 해부(LMD)를 이용한 신경교종 이질성 및 침범의 분자 경관을 분석하고 전사성 분석을 통해 보다 자세하고 최적화된 방법을 설명합니다.
레이저 포획 미세해부(LMD)는 종양 내의 상이한 영역 또는 단일 세포를 식별...

신경교종은 중추 신경계의 가장 공격적인 원발성 종양입니다. 그들은 매우 침략적이고 이질적인1. 종양의 세포 및 분자 분대의 분석은 새로운 치료 표적을 드러낼 것입니다.
현재 이용 가능한 다른 방법 들 중에서, 동결 된 뇌 종양 조직의 레이저 캡처 미세 해부 (LMD)는 종양 조직에서 이산 해부학 영역 또는 특정 세포 집단을 분리하여 분자 프로필을 연구 할 수있는 비용 효과적이고 신뢰할 수있는 기술입니다2,,3. LMD는 선택된 단일 세포 또는 다세포구조의mRNA 유전자 발현 프로파일의 분석을4,5. LMD는 종양 진행 도중 일어나는 분자 사건에 관하여 심층적인 기계론적인 지식을 얻기 위하여 이용될 수 있습니다. 종양 조직의 처리개선은 조직 형태와 RNA 품질6의최적의 광학 적 분해능을 얻기 위해 필요하다. 파라포름알데히드 고정이 형태학적 분석을 위한 최선의 선택이지만, RNA 품질은 이러한 조건하에서 영향을 받고 저하되어 RNA-seq 분석을 위한 RNA 품질이 저하됩니다. 동결 된 조직 섹션의 사용은 세포막을 부수고 세포 내의 구멍을 생성 할 수있는 얼음 결정 형성을 피하고 RNA-Seq 분석7을위한최상의 옵션으로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 LMD에 대한 동결 마우스 뇌종양 조직을 처리하기 위해 최적화된 단면 고정 및 염색 방법을 설명한다. 얼음 결정이 조직에서 형성되는 것을 방지하기 위해, 우리는 30 % 자당의 용액으로 마우스를 주입했습니다. 이 용액은 극성 물 분자 사이의 상호 작용을 방해하고 얼음 결정의 형성을 방지하여 조직 형태를 보존합니다. 조직 염색은 종양 내의 세포 또는 해부학적으로 명백한 지역의 특정 인구를 분화하고 장악하기 위하여 필요합니다. RNA 무결성을 유지하기 위해 무해한 염료로 조직을 수정하고 염색하는 것이 필수적입니다. 이전에 는 헤마톡신/에오신(H&E)으로 조직을 염색하면 RNA 무결성이 저하되는 것으로 나타났습니다8. 우리는 에탄올, 크레실 바이올렛 4%, 에오신 Y 0.5% 솔루션으로 관심 조직을 고정하고 염색했습니다. 크레실 바이올렛은 진한 청색으로 세포 핵을 더럽는 산성염 염료입니다. Eosin Y는 세포의 기본 성분을 더럽게 하는 호염약 염료로, 세포질및 다른 세포 구조 의 구별을 제공하는8. 두 염료 모두 에탄올에 용해되며 RNA 품질을 저하시키지 않습니다. 조직 손상을 방지하고 세포 구조의 높은 광학 해상도를 유지하기 위해 LMD9이전에 조직 섹션을 장착했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning PCR Tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection (LMD) System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN Membrane Glass Slide (2 &#181;m)</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>1150518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinpoint Solution</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>634411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion

글리오마는 그들의 침략성과 이질성을 특징으로 하는 1 차적인 뇌종양입니다. 의사 팔리세이드, 미세 혈관 증식, 중간엽 변형 및 괴사와 같은 특정 조직학적 패턴은 고급 신경교종의 조직학적 이질성을 특징으로합니다. 우리의 실험실은 온코 스트림이라는 이름의 중간 엽 세포의 높은 밀도의 존재가 종양 악성 종양과 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 우리는 신경교종의 성장과 침략의 기초가 되는 기계장치를 이해하기 위하여 독특한 접근을 개발했습니다. 여기서, 우리는 레이저 포획 미세 내부(LMD) 및 RNA 염기서열 분석을 활용하여 종양 내 이기종 다세포 구조(즉, 중간엽 영역 또는 종양 침윤 영역)의 미분 mRNA 발현을 분석하는 포괄적인 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 좋은 조직 조직학 및 RNA 무결성을 유지합니다. 관류, 동결, 임베딩, 단면화 및 염색은 형태를 보존하고 고품질 레이저 미세 해부 샘플을 얻기 위해 최적화되었습니다. 결과는 30% 자당을 사용하여 신경교종 베어링 마우스의 관류가 좋은 형태와 RNA 질을 제공한다는 것을 표시합니다. 또한, 4% 크레실 바이올렛과 0.5% 에오신으로 종양 섹션을 염색하면 RNA 무결성을 유지하면서 좋은 핵 및 세포 염색을 초래합니다. 기재된 방법은 민감하고 매우 재현성이 있으며 다양한 종양 모델에서 종양 형태를 연구하는 데 활용될 수 있다. 요약하면, 우리는 고형 종양 내의 이기종 다세포 구조의 분자 특징을 연구하기 위해 시퀀싱을 위한 형태학 및 RNA 품질을 보존하는 LMD를 수행하는 완전한 방법을 설명합니다.

우리의 실험실은 수면 미용 트랜스포사아제 시스템을 사용하여 유전자 조작 마우스 모델(GEMMs)을 생성하였다(그림1A). 이 시스템은 신생아 마우스에 있는 신경 전구 세포의 게놈으로 특정 유전 변경을 통합합니다. 이 변경된 전구 세포는 내인성 신경교종 종양을 형성합니다. 종양을 생성하는 데 사용되는 플라스미드 서열은 다음과 하였?...

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Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

이 프로토콜은 레이저 미세 절과 RNA 염기를 사용하여 중간 엽 세포의 축적 영역 또는 종양 침입 영역과 같은 종양 이질성의 차등 mRNA 발현을 분석합니다. 이 방법은 고품질 의 레이저 미세 절시 샘플의 수집을 용이하게하기 위해 양질의 조직 조직 조직 및 RNA 무결성을 보존하도록 최적화되었습니다. 이 방법은 민감하고 재현성이 높습니다.그것은 다양한 종양 모델에서 종양 형태학 및 이질성을 연구하기 위해 활용할 수 있다. 냉동 뇌종양 조직의 레이저 미세 절제는 종양 조직에서 세포 집단의 이산 해부학 영역을 분리하여 분자 프로파일을 연구하는 비용 효과적이고 신뢰할 수 있는 기술입니다. LMD는 종양 진행 중에 일어나는 분자 사건에 대한 심층적인 기계론적 지식을 얻기 위해 활용될 수 있으며 새로운 치료 목표를 드러낼 수 있습니다.마우스 종양 부담의 생체 내 생물 발광은 7 광자 에서 10~10~10회 사이의 신호에 도달한다. 간과 폐가 완전히 혈액을 지울 때까지 안락사 종양 베어링 마우스의 순환 시스템을 통해 산소 로동 액액을 플러시합니다. 15분 동안 티로드 용액에 용해된 30% 자당 용액으로 동물을 계속 인내합니다.관류의 성공을 평가하기 위해, 목, 꼬리 및 다리가 순환의 끝에 경직되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 뇌를 수확하고 신선한 30 % 자당 용액에 밤새 뇌를 저장합니다. 냉동 보존을 준비하기 위해, 감기 isopentane-2-메틸 부탄으로 항아리를 채우고 액체 질소로 채워진 용기에 항아리를 놓습니다.용매가 차가운 동안, 필터 종이에 뇌를 건조하고 라벨 크라이오폴드에 뇌를 배치합니다. 크릴로몰드의 중심으로 중간을 절단하는 최적의 온도의 약 5 밀리리터에서 조심스럽게 원하는 방향으로 금형에 뇌를 배치합니다. 깨끗한 집게를 사용하여, 신속하게 30 ~ 40 초 동안 차가운 isopentane-2-메틸 부탄에 크라이오폴드를 배치합니다.절단 매체가 고화되면, 드라이 아이스에 크라이오폴드를 전송하고 냉동 뇌 조직을 알루미늄 호일에 감싸고 영하 80도 저장합니다. 냉동 뇌종양 조직 섹션을 취득하려면 먼저 영하 20도에서 영하 24도 사이의 저온을 설정하고 샘플 블록을 30~60분 동안 저온챔버에 배치합니다. 샘플이 평형화되는 동안 챔버와 칼 홀더를 100% 에탄올로 청소하고 RNase 클리닝 용액으로 단면 브러시를 분사하십시오.시료가 준비되면 금형을 제거하고 냉동 조직 블록을 냉동 조직 블록에 부착하여 냉동 절단 매체를 사용하여 냉동 된 시편 디스크에 부착하십시오. 블록을 디스크 홀더에 놓고 블록을 칼날과 정렬합니다. Rnase 가 없는 브러시 중 하나를 사용하여 뇌의 10 마이크로미터 섹션을 획득하여 조직 조각을 절삭 표면에 조심스럽게 평평하게 하고 말리게 합니다.슬라이드에 뇌 조직 섹션을 장착하려면 라벨이 부착된 RNase 가 없는 PEN 유리 슬라이드의 양전하 측을 부드럽게 눌러 섹션에 슬라이드를 놓습니다. 모든 슬라이드가 수집되면 저장 상자를 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 레이저 마이크로 해부 전에 절단 매체를 용해하려면 슬라이드를 30초 순차적 내림차순 에탄올 몰입으로 담그고 0.5%eosin Y 용액으로 20초 5초 동안 염색합니다.eosin Y 인큐베이션의 끝에서 필터 용지를 사용하여 슬라이드를 건조하게 차단하고 순차적으로 오름차순 에탄올 몰입으로 슬라이드를 탈수합니다. 60초 에탄올침이 뚫린 후, 슬라이드를 자일렌 용기에 넣고 3분간 헹구십시오. 다음으로, RNase가 없는 물로 제조된 마운팅 매체에 샘플을 장착하기 전에 실온에서 RNase가 없는 표면의 슬라이드를 10초 동안 건조시하십시오.10~20초 후에 슬라이드를 현미경 현미경 마이크로 디스섹션 플랫폼으로 옮기십시오. 레이저 캡처 마이크로 절의 경우 레이저를 켜기 전에 전원을 켭니다. 다음으로, 컴퓨터의 현미경 컨트롤러를 켜고 레이저 캡처 마이크로 절제 소프트웨어를 시작합니다.현미경 제어판에서 10배 배율을 선택합니다. 레이저 제어하에 조직 해부에 대한 레이저 매개 변수를 설정하고 120 헤르츠의 레이저 주파수와 100 %의 레이저 전류를 선택하면 정확한 레이저 미세 절에 대해 속도를 10으로 설정하고 조리개를 10 마이크로 미터로 설정합니다. 그런 다음 전원을 53으로 설정합니다.단면 다음 조직을 캡처하는 조직 수집기와 두 번째 언로드 버튼을 클릭하는 조직 수집기로드합니다. 빈 컬렉터를 튜브당 30마이크로리터의 용액 버퍼를 포함하는 DNase 및 Rnase 가 없는 0.5 밀리리터 PCR 플랫헤드 튜브로 교체하십시오. 수집기를 컴퓨터에 반환하고 계속 진행하려면 클릭합니다.처리된 시편을 현미경에 로드하고 레이저 미세 절제 소프트웨어에서 언로드를 클릭합니다. 샘플을 슬라이드 홀더에 올려 놓고 슬라이드 홀더를 스테이지에 배치합니다. 계속 클릭하여 잘라낸 셰이프 창에서 그리기 컷을 선택합니다.현미경 제어를 사용하여 관심 영역을 찾고 관심 영역 주위에 윤곽을 그립니다. 그런 다음 대상 수집관을 선택하고 시작 컷을 클릭하여 조직 미세 절을 진행합니다. 관심 있는 모든 영역이 해부되면 수집가 튜브를 홀더에서 드라이 아이스로 옮겨 다운스트림 처리가 될 때까지 옮습니다.우수한 형태학 및 RNA 무결성을 가진 조직을 취득하기 위하여는, 각종 관류 접근이 평가되었습니다. 관심 영역을 해부하려면 RNA에 대한 무해한 염료로 조직을 얼룩지게해야합니다. 티로드 용액과 30%의 자당과 종양 베어링 마우스의 후속 관류는 30%의 자당에서 하룻밤 배양에 이어 마우스 조직의 형태 및 RNA 무결성의 보존을 초래한다.파라포름알데히드 조직 고정은 고품질 조직 형태학을 초래하지만 RNA 무결성은 부정적인 영향을 미칩니다. 티로드 용액 인큐베이션, 또는 티로드 용액 플러스 30% 자당 용액 인큐베이션을 사용하는 것과 같은 다른 접근법은 RNA 품질에 영향을 미치지 않지만 조직 형태에 대한 분해능이 감소되는 것으로 관찰된다. 조직이 장착 매체로 장착되지 않으면, 단면도가 탈수되고 물에 용해된 15%의 장착 배지를 가진 조직 견본의 장착하는 동안 형태학이 악화되는 것은 고품질 조직 형태를 유지합니다.레이저 포획 미세 절 현미경 이미징은 해부를 위한 종양 조직의 선택을 허용합니다. 관심 선택의 이 지역은 RNA 무결성 분석을 위한 각 조직 견본 내의 관심 있는 지역의 해부를 허용합니다. 고품질 종양 조직 형태와 RNA 무결성을 유지하는 것은 매우 중요합니다.30%의 자당에서 하룻밤 보존을 가진 타이로드 용액과 30%의 자당 관류는 LMD에 대한 조직 형태를 크게 향상시킵니다. GAN 용액으로 빠른 lyoma 고정, 염색 및 장착은 RNA 품질을 보존하고 조직 내에서 균열이 형성되는 것을 방지하는 중요한 단계입니다. RNA 품질 관리 및 전사 분석 모두에 적합한 양의 RNA를 얻기 위해 조직 영역당 6제곱마이크로미터 의 총 종양으로 최소 2.5배 10배 이상 을 배분하는 것이 좋습니다.LMD는 전임상 신경교종 모형에 있는 미래 번역 발달을 위한 새로운 잠재적인 표적을 드러낼 수 있던 신경교종 이질성 및 침략을 통제하는 분자 신호 통로의 분석을 가능하게 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

레이저 캡처 이외에 Microdissection과 코 생검 결합을 통해 획득 후각 뉴런 : 정신 장애의 치료 반응을 연구하기 위해 잠재적 인 접근

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

레이저에서 고품질 RNA 격리 스테인리스 프로토콜 캡처 Microdissected Purkinje 세포 인간의 사후 소 뇌에

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...